3種檢測方法診斷結(jié)核性胸膜炎的對比分析

墻建軍，夏 飛，雷應軍，劉海潮，胡振紅

(解放軍武漢總醫(yī)院，湖北 武漢 430070)

目前，肺結(jié)核仍然是嚴重危害人類健康的主要傳染病，是全球關注的公共衛(wèi)生和社會問題，也是我國重點控制的主要疾病之一。世界衛(wèi)生組織(WHO)新出版了《2015年全球結(jié)核病報告》顯示，2014年全球新發(fā)肺結(jié)核病人數(shù)為960萬，我國為94萬；全球患病率為174/10萬，我國為89/ 10萬；全球發(fā)病率為133/10萬，我國為68/10萬[1]。結(jié)核性胸膜炎(tuberculous pleurisy,TBP)是胸膜對結(jié)核菌高度變態(tài)反應時產(chǎn)生的胸膜炎癥，為最常見的胸膜疾病之一，其發(fā)病率與結(jié)核病疫情相關，傳統(tǒng)檢查手段敏感性和特異性均較差，胸腔積液抗酸桿菌檢出率極低、培養(yǎng)陽性率低且耗時較長；胸膜活檢陽性率達60%～80%，但為有創(chuàng)傷檢查，不適合常規(guī)采用。γ-干擾素釋放試驗(interferon-γ release assays, IGRAs)是近年來最為熱門的結(jié)核病診斷方法，其中包括基于全血的酶聯(lián)免疫吸附試驗和基于外周血淋巴細胞的酶聯(lián)免疫斑點試驗(T-SPOT.TB)。筆者通過對90例進行了T-SPOT.TB、結(jié)核蛋白芯片以及腺苷脫氨酶(ADA)檢測患者的檢驗結(jié)果進行回顧性分析，以探討T-SPOT.TB在結(jié)核性胸膜炎診斷中的價值。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選取2015年1—12月在我院接受診治的胸腔積液患者90例，其中結(jié)核性胸膜炎50例(TBP組)，非結(jié)核性胸膜炎(非TBP組)40例。TBP組男39例，女11例；年齡18～84歲，平均48歲；病程1 d～3個月；患者癥狀、體征、各項檢查結(jié)果及抗結(jié)核治療效果均支持診斷。非TBP組男25例，女15例；年齡20～80歲，平均50歲；病程4 d～5個月；胸膜轉(zhuǎn)移癌23例，肺炎旁胸腔積液8例，心功能不全7例，肺栓塞2例；腫瘤病例均經(jīng)病理細胞學證實，其他疾病根據(jù)臨床癥狀、體征、常規(guī)化驗檢查、影像學表現(xiàn)及療效等證實。納入標準: 患者均行胸腔穿刺或胸腔置管引流胸腔積液，行血清T-SPOT.TB、血清結(jié)核蛋白芯片、胸腔積液結(jié)核蛋白芯片、胸腔積液ADA等檢查。結(jié)核性胸膜炎診斷標準: 胸膜活檢提示典型的結(jié)核病表現(xiàn)；胸腔積液涂片或培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌；除外其他原因引起的胸腔積液，抗結(jié)核治療有效[2]。

1.2 檢測方法

1.2.1T-SPOT.TB方法 采用T-SPOT.TB檢測試劑盒(英國Oxford Immunotec公司)對血液樣本進行檢測。結(jié)果判讀:第1孔為陰性對照孔，第4孔為陽性對照孔，如陽性對照孔出現(xiàn)斑點，說明試驗成功。第2孔和3孔為測試孔，當混合多肽ESAT-6或CFP-10孔達到以下標準則判定為陽性結(jié)果：①如果陰性對照孔斑點數(shù)為0～5個，測試孔斑點數(shù)-陰性對照孔斑點數(shù)≥6個；②如果陰性對照孔斑點數(shù)≥6個，測試孔斑點數(shù)≥2倍的陰性對照孔斑點數(shù)。如出現(xiàn)以下情況判定試驗結(jié)果為“不確定”：①空白對照孔斑點數(shù)超過10個；②陽性質(zhì)控對照孔斑點數(shù)少于20個(除非混合多肽ESAT-6或CFP-10孔根據(jù)結(jié)果解釋和判斷標準確定為陽性)。

1.2.2結(jié)核蛋白芯片檢測方法 PBT-X2蛋白芯片閱讀儀及結(jié)核蛋白芯片試劑盒均由南京大淵生物技術公司提供。操作方法嚴格按說明書進行，結(jié)果根據(jù)儀器廠家設置參數(shù)自動判別，分別打印出胸腔積液與血清中三種特異性抗體即脂阿拉伯甘露糖(LAM)、 16 kDa及38 kDa抗體，如果任意抗體檢測陽性，結(jié)果判定為陽性。

1.2.3ADA測定 應用10 mL抗凝玻璃管收集胸腔積液10 mL，1 000 r/min離心5 min，取上清液用酶法(北京九強生物技術股份有限公司試劑盒，批號：12-1021P)測定胸腔積液ADA活性，參照試劑盒說明書進行診斷，ADA≥45 IU/L定義為陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計數(shù)資料比較行2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1

2組3種檢測方法陽性率比較 TBP組血清T-SPOT.TB陽性率明顯高于血清結(jié)核蛋白芯片、胸腔積液結(jié)核蛋白芯片、胸腔積液ADA(P均<0.05)。非TBP組血清T-SPOT.TB陽性率與血清及胸腔積液結(jié)核蛋白芯片、胸腔積液ADA比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

2.2

3種檢測方法的靈敏性與特異性對比 血清T-SPOT.TB靈敏性明顯高于血清結(jié)核蛋白芯片、胸腔積液結(jié)核蛋白芯片(P均<0.05)，但與胸腔積液ADA比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；胸腔積液ADA靈敏性與血清及胸腔積液結(jié)核蛋白芯片比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。血清T-SPOT.TB特異性明顯高于血清結(jié)核蛋白芯片、胸腔積液結(jié)核蛋白芯片及胸腔積液ADA(P均<0.05)；胸腔積液ADA特異性明顯高于血清及胸腔積液結(jié)核蛋白芯片(P均<0.05)。見表2。

表1 3種檢測方法陽性率對比 例(%)

注：①與T-SPOT.TB陽性率比較，P<0.05。

表2 3種檢測方法的靈敏性與特異性對比 %(例/例)

注：①與T-SPOT.TB比較，P<0.05;②與ADA比較，P<0.05。

3 討 論

蛋白芯片是近年來蛋白組學研究中的新方向。結(jié)核蛋白芯片系統(tǒng)是以微孔濾膜為載體，將純化的結(jié)核菌LAM、16 kD及38 kD等3種抗原固相在同一膜片上，利用微孔濾膜的滲濾、濃縮、凝集作用，使抗原抗體反應在固相膜上快速進行，再以免疫標記顯色后通過芯片閱讀儀對不同抗原點陣的灰度值進行同步檢測，從而對結(jié)核菌感染的情況進行診斷[3]。本芯片包被了以上3種抗原，只要其中任何一對應抗體與之反應即為陽性。從文獻報道來看，結(jié)核蛋白芯片靈敏度偏低，陳鄒陽[4]隨機選擇結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液患者80例行外周血結(jié)核蛋白芯片檢測，靈敏性為72.5%，特異性為90.6%；陶波山[5]對102例結(jié)核性胸膜炎患者的胸腔積液、血清和48例非結(jié)核性胸膜炎患者的胸腔積液、血清分別用ADA、結(jié)核蛋白芯片和結(jié)核分枝桿菌特異性ELISPOT 3種方法進行檢測，結(jié)果示胸腔積液結(jié)核蛋白芯片靈敏性為52.9%，特異性為89.6%，血清結(jié)核蛋白芯片靈敏性為74.5%，特異性為93.8%；本研究中，血清結(jié)核蛋白芯片靈敏性、特異性分別為70.4%，50.8%，胸腔積液結(jié)核蛋白芯片靈敏性、特異性分別為69.6%，49.3%，靈敏性與上述報道一致，但特異性均低。

ADA是一種分布廣泛的酶，催化腺苷轉(zhuǎn)化為肌苷和脫氧腺苷為脫氧肌苷，在T淋巴細胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用。ADA在淋巴細胞分化和單核細胞成熟為巨噬細胞的過程中起到一定作用，當發(fā)生結(jié)核性胸膜炎時，宿主通過細胞免疫抵抗結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染，胸膜的淋巴細胞明顯增多、活性增強，故ADA在胸腔積液中含量明顯增高。Piras等最早報道ADA作為胸腔積液輔助鑒別診斷分子標識，之后圍繞其對結(jié)核性胸膜炎的診斷應用價值有大量的研究。劉菲等[6]研究結(jié)果顯示，胸腔積液ADA靈敏性、特異性分別為71.2%，92%。一項納入63項研究、8 000例胸膜炎 (其中2 796例為結(jié)核性胸膜炎)患者的薈萃分析顯示，敏感性、特異性分別為92%,90%[7]。本研究結(jié)果顯示，胸腔積液ADA靈敏性、特異性分別為88.1%,72.9%。導致結(jié)果不一致的原因可能與檢測方法多樣、截斷值不同有關，而其他因素如患者的免疫狀況、種族、地區(qū)結(jié)核流行情況也可影響ADA水平和結(jié)果判斷。血液中ADA主要存在于紅細胞、粒細胞和淋巴細胞，其活性約為血清的40～70倍。尉艷霞等[8]回顧性分析91例經(jīng)內(nèi)科胸腔鏡胸膜活檢病理確診為結(jié)核性胸腔積液(結(jié)核組49例)和惡性胸腔積液(惡性組42例)患者的胸腔積液及血清中ADA活性，結(jié)果表明，結(jié)核性胸膜炎和惡性胸腔積液的血清ADA均在正常范圍，且兩者的差異無統(tǒng)計學意義。陶波山[5]研究表明血清的ADA檢測結(jié)核性胸膜炎組與非結(jié)核性組無顯著性差異。基于血清ADA檢測對結(jié)核性胸膜炎診斷價值有限，本研究未納入該方法。

IGRAs是檢測MTB特異性抗原刺激T細胞產(chǎn)生的γ-干擾素，以判斷是否存在MTB的感染。目前國際上較成熟的IGRAs有2種:①采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測全血中致敏T細胞再次受到MTB特異性抗原刺激后釋放的γ-干擾素水平，稱之為全血檢測或結(jié)核感染T細胞免疫檢測；②采用酶聯(lián)免疫斑點技術(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)測定在MTB特異性抗原刺激下，外周血單個核細胞中能夠釋放γ-干擾素的效應T細胞數(shù)量，稱之為細胞檢測或結(jié)核感染T細胞檢測。由于ELISPOT技術是從單細胞水平進行檢測，可及時捕獲細胞周圍分泌的細胞因子，故敏感度更高。Dai等[9]檢索了中文和英文的數(shù)據(jù)庫，對檢索到的36篇英文和25篇中文文獻進行了薈萃分析，結(jié)果顯示IGRAs的總體敏感度和特異度分別為85%和84%。Menzies等[10]對1966—2006年的相關文獻和數(shù)據(jù)進行的薈萃分析結(jié)果顯示，結(jié)核感染T細胞免疫檢測和結(jié)核感染T細胞檢測的總體特異度分別為97.7%和92.5 %。劉紅等[11]回顧性分析2011年2—10月鄭州大學第一附屬醫(yī)院收治的結(jié)核病疑似患者1 084例， 384例(35.4%)確診為結(jié)核病患者，54例為實驗室診斷，其中42例T-SPOT. TB結(jié)果陽性，敏感性為77.8%(42/54);330例為臨床診斷，其中289例T-SPOT. TB結(jié)果陽性，敏感性為87.6%(289/330)。T-SPOT. TB的綜合敏感性為86.2%(331/384)。李津等[12]報道，通過IGRAs檢測胸腔積液診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感性為90.1%，特異性為88.0%。另一項研究結(jié)果顯示，胸腔積液T-SPOT.TB檢測的敏感度和特異度可以達到95.7%和100.0%，顯著高于ADA(55.5%和86.3%)[13]。本研究血清T-SPOT. TB靈敏性、特異性分別為93.9%，90.2%，與文獻報道相一致，顯示血清T-SPOT. TB靈敏性、特異性明顯優(yōu)于結(jié)核蛋白芯片法，差異有顯著統(tǒng)計學意義；血清T-SPOT. TB靈敏性優(yōu)于胸腔積液ADA，但無統(tǒng)計學意義；血清T-SPOT. TB特異性優(yōu)于胸腔積液ADA，差異有統(tǒng)計學意義。

IGRAs在不同地區(qū)、不同人群中的靈敏性和特異性均存在較大差異，此外，不同IGRAs產(chǎn)品使用的抗原、檢測試劑、檢測參數(shù)和界值設定等可能存在差異，對最終檢測結(jié)果及其判讀有一定影響。國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準的IGRAs僅限于血液樣本的檢測，即IGRAs對體液或組織標本的研究尚未經(jīng)過充分驗證，不能得出可靠的結(jié)論；我院尚未開展胸水T-SPOT.TB，故未能進行胸水T-SPOT.TB對比分析。由于我院開展血清T-SPOT. TB較晚，樣本數(shù)據(jù)量偏少，故研究結(jié)果有一定局限性，對T-SPOT. TB診斷結(jié)核性胸膜炎或結(jié)核病的臨床應用價值做出更科學準確的評價仍需進行大規(guī)模研究。

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