生物酶法合成L-精氨酸衍生物的研究進(jìn)展

孫安然，宋偉，劉佳，羅秋玲，陳修來，劉立明

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

3 江南大學(xué) 食品微生物制造工程實驗室，江蘇 無錫 214122

1 L-精氨酸及其衍生物的生產(chǎn)方法

1.1 L-精氨酸的生產(chǎn)方法及比對

L-精氨酸 (L-arginine, L-Arg) 是一種堿性半必需氨基酸，于1886年從羽扇豆幼苗中發(fā)現(xiàn)，其在動植物體內(nèi)具有重要的生理活性 (促進(jìn)肝功能恢復(fù)、減緩血栓形成、減輕神經(jīng)衰弱、促進(jìn)傷口恢復(fù)等)，在化工、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[1-2]。

目前，L-精氨酸的生產(chǎn)途徑包括化學(xué)提取法和微生物發(fā)酵法?；瘜W(xué)提取法主要是指利用精細(xì)化工的手段，從包括自然資源及有機(jī)廢液的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中直接提取L-精氨酸，主要包括沉淀法、電滲析法和離子交換法，是早期生產(chǎn)L-精氨酸所采用的主流方法。中國科學(xué)院武漢植物研究所以棉籽餅粕水解液為原料，通過732陽離子交換樹脂分離提純多種氨基酸。以棉籽餅粕水解液中所有蛋白質(zhì)為基準(zhǔn)計算，L-精氨酸的提取率為1.5%。化學(xué)提取法通常會引入有毒沉淀劑，而且操作過程復(fù)雜、能耗高、產(chǎn)物純度較低，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。

微生物發(fā)酵法以其環(huán)境友好、生產(chǎn)條件溫和和生產(chǎn)過程穩(wěn)定的優(yōu)勢，逐漸在L-精氨酸的生產(chǎn)中占據(jù)主導(dǎo)地位[3]。特別是通過傳統(tǒng)菌株篩選、代謝工程改造及生物反應(yīng)器發(fā)酵過程優(yōu)化等手段，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-精氨酸在過去幾十年里取得了長足的進(jìn)展，為L-精氨酸的高值化生產(chǎn)提供了堅實的基礎(chǔ)。生產(chǎn)L-精氨酸的常用菌株有鈍齒棒桿菌Corynebacterium crenatum、黃色短桿菌Brevibacterium flavum和谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum等[4-6]。許正宏團(tuán)隊等[7-9]采用常見的誘變方法，篩選得到了1株精氨酸高產(chǎn)菌株C.crenatumSYPW50-11，在500 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程中，96 h發(fā)酵周期精氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別為45 g/L和30%。Su等[10]利用傳統(tǒng)突變育種的策略，得到1株2-噻唑丙氨酸和磺胺胍抗性、組氨酸缺陷的B.flavum，該菌株精氨酸的產(chǎn)量可達(dá)61.6 g/L。Park等[5]利用代謝工程的手段，通過移除C.glutamicum的精氨酸操縱子的抑制劑、優(yōu)化輔因子水平、增加L-精氨酸前體的供應(yīng)、優(yōu)化限速反應(yīng)步驟等策略，在1 500 L分批發(fā)酵反應(yīng)器中，建立了C.glutamicum高效生產(chǎn)L-精氨酸的工藝路線，產(chǎn)量為81.2 g/L，單位質(zhì)量葡萄糖對應(yīng)L-精氨酸的產(chǎn)量為0.40 g/g。目前，發(fā)酵法生產(chǎn)L-精氨酸的廠商主要包括日本味之素(MAXIN)、田邊制藥 (Tanabe Seiyaku)、協(xié)和發(fā)酵(Kyowa Hakko) 及德國德固賽公司 (Degussa)。國內(nèi)采用發(fā)酵法生產(chǎn)L-精氨酸的廠商較少，而且所用菌種產(chǎn)酸能力低、穩(wěn)定性差，無法與國際上同類產(chǎn)品競爭，國內(nèi)市場L-精氨酸主要依賴于進(jìn)口。

1.2 L-精氨酸衍生物的生產(chǎn)方法及比對

L-精氨酸衍生物種類繁多，包括鳥氨酸、瓜氨酸、胍基丁胺、精氨琥珀酸等。L-精氨酸衍生物的生產(chǎn)方法有化學(xué)法、發(fā)酵法和生物酶法。下文將以L-鳥氨酸為例，比對化學(xué)法、發(fā)酵法和生物酶法合成L-精氨酸衍生物的異同?；瘜W(xué)合成法以氰化氫、丙烯醛、氨氣和二氧化碳為原料，經(jīng)過多步化學(xué)反應(yīng)得到鳥氨酸[11]。該方法所選用的原料來源廣泛并且成本低廉，但反應(yīng)過程中引入的氰化氫為劇毒物質(zhì)，使得化學(xué)法合成的L-鳥氨酸難以直接應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和保健品等領(lǐng)域。此外，該化學(xué)合成法步驟繁多，且合成的產(chǎn)物為DL-鳥氨酸，需要進(jìn)一步的手性拆分才能得到光學(xué)純度的L-鳥氨酸，工藝難度大，生產(chǎn)成本高。發(fā)酵法生產(chǎn) L-鳥氨酸是指通過篩選 L-瓜氨酸或L-精氨酸營養(yǎng)缺陷型的生產(chǎn)菌株，采用微生物發(fā)酵的方法大量積累L-鳥氨酸。Tsuchida等[12]研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸節(jié)桿菌的L-瓜氨酸或L-精氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株外加霉酚酸抗性后可生產(chǎn)50 g/L L-鳥氨酸；谷氨酸棒桿菌的L-瓜氨酸或L-精氨酸缺陷型菌株外加青霉素、霉酚酸和鳥氨酸抗性后可生產(chǎn)46 g/L L-鳥氨酸；乳酸短桿菌的L-瓜氨酸或L-精氨酸缺陷型菌株外加鳥氨酸抗性后可生產(chǎn)55 g/L L-鳥氨酸。發(fā)酵法生產(chǎn)L-鳥氨酸的育種過程復(fù)雜、周期長，且產(chǎn)量較低，不利于L-鳥氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)。生物酶法合成L-鳥氨酸是指通過直接提取或異源表達(dá)的手段，利用生物體內(nèi)的精氨酸酶催化L-精氨酸脒基水解生產(chǎn)L-鳥氨酸的過程。Song等[11]通過異源表達(dá)嗜熱菌的精氨酸酶生產(chǎn) L-鳥氨酸，L-鳥氨酸的產(chǎn)量可達(dá)112.3 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)87.1%，生產(chǎn)強(qiáng)度為 26.2 g/(L·h)。生物酶法合成L-鳥氨酸的反應(yīng)過程條件溫和，反應(yīng)步驟簡單，產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率都較高且反應(yīng)過程不引入有毒有害物質(zhì)，為L-鳥氨酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了有力的支持。因此，比對化學(xué)法和發(fā)酵法，生物酶法合成L-精氨酸衍生物具有明顯優(yōu)勢。

2 L-精氨酸的結(jié)構(gòu)及其衍生化反應(yīng)

2.1 L-精氨酸的結(jié)構(gòu)特征

L-精氨酸具有胍基、羧基和氨基 (圖 1)，這些官能團(tuán)使其在生理生化功能上展現(xiàn)了非常重要和多元化的作用，同時也是精氨酸衍生化的化學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。其中，胍基是一種堿性基團(tuán)，易于水解，可被取代，其中的碳氮雙鍵有一定的還原性，可被氧化[13-15]；羧基是一種弱酸性基團(tuán)，可與游離氨基發(fā)生酰胺反應(yīng)，也可脫離生成二氧化碳[16-17]；氨基是一個高活性、易被氧化的手性堿性基團(tuán)，可參與酰胺類物質(zhì)和酮的生成以及消旋反應(yīng)[18]。此外，L-精氨酸主鏈碳原子不活潑，但其上氫原子可被羥基取代[19]。

圖1 L-精氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of L-arginine.

2.2 L-精氨酸的衍生化反應(yīng)

L-精氨酸多種多樣的官能團(tuán)使其可以發(fā)生豐富的衍生化反應(yīng) (圖2)：1) 胍基基團(tuán)在精氨酸酶(L-arginine amidinohydrolase, EC 3.5.3.1)、精氨酸脫亞胺酶 (L-arginine deiminase，EC 3.5.3.6)和精氨琥珀酸裂合酶 (Argininosuccinatelyase，EC 4.3.2.1) 的作用下，通過水解胍基、亞胺基和取代胍基上的氫而生成鳥氨酸、瓜氨酸和精氨琥珀酸[20-21]；2) 羧基基團(tuán)在 L-氨基酸合酶 (L-amino acids ligase，EC 6.3.2.28) 和 L-精氨酸脫羧酶(L-arginine decarboxylase，EC 4.1.1.19) 的作用下發(fā)生酰胺化和脫羧作用，生成L-丙氨酸-谷氨酰胺等二肽化合物和胍基丁胺[22-23]；3) 氨基基團(tuán)在L-精氨酸消旋酶 (L-arginine racemase，EC 5.1.1.9)、L-精氨酸合酶 (L-amino acids ligase，EC 6.3.2.28) 和L-精氨酸氧化酶 (L-arginine oxidase，EC 1.4.3.-) 的作用下生成D-精氨酸[24]、二肽化合物和5-胍基-2-氧代戊酸[25]；4) L-精氨酸主鏈碳原子上的氫可在 L-精氨酸羥化酶 (L-arginine hydroxylase，EC 1.14.11.41) 的作用下被取代，生成3-羥基-L-精氨酸[26]。L-精氨酸的衍生化反應(yīng)催化類型、酶種類及產(chǎn)物詳細(xì)情況列于表1。

3 L-精氨酸衍生化產(chǎn)品及其生物酶法合成工藝

按衍生化基團(tuán)的不同，L-精氨酸的典型衍生化產(chǎn)品可分為4類：基于胍基基團(tuán)的衍生化產(chǎn)品、基于羧基基團(tuán)的衍生化產(chǎn)品、基于氨基基團(tuán)的衍生化產(chǎn)品和基于碳主鏈的衍生化產(chǎn)品。其生物酶法合成工藝詳述如下。

3.1 基于胍基基團(tuán)改造的精氨酸衍生化產(chǎn)品

生物酶法合成精氨酸胍基基團(tuán)所得的衍生化產(chǎn)品有鳥氨酸、瓜氨酸和精氨琥珀酸3種，本文以典型的鳥氨酸和瓜氨酸為例，講述其生物酶法合成工藝。

圖2 L-精氨酸的結(jié)構(gòu)特性及其衍生化反應(yīng)Fig.2 Chemical structures of L-arginine and its derivatization reaction.

表1 L-精氨酸的衍生化反應(yīng)Table 1 Derivatization reactions of L-arginine

鳥氨酸是精氨酸酶水解L-精氨酸的產(chǎn)物。在醫(yī)藥領(lǐng)域，L-鳥氨酸具有傷口消炎的功能[20-21]，并且可以與其他氨基酸通過離子鍵形式結(jié)晶形成氨基酸鹽復(fù)合物，以達(dá)到增強(qiáng)藥效的目的，諸如L-鳥氨酸苯乙酸用作肝性腦病的治療、天門冬氨酸鳥氨酸用于護(hù)肝藥[32]。在食品領(lǐng)域，鳥氨酸具有促進(jìn)人體生長激素分泌的作用，可用作減肥保健品的添加劑[33]，此外鳥氨酸還具有脫苦味的作用，可用于食品添加劑中以改善食品風(fēng)味[34]。近年來，生物酶法合成L-鳥氨酸的研究進(jìn)展如表2所示，主要包括野生型產(chǎn)酶微生物的篩選和高效酶源的異源表達(dá)兩部分。早在1995年，人們開始將L-精氨酸酶用于L-鳥氨酸合成，由Makryaleas等從動物肝臟中提取并直接用于酶轉(zhuǎn)化[35]。由于動物肝臟提取精氨酸酶的工藝非常復(fù)雜，一些研究者開始通過傳統(tǒng)的土壤篩選方法來篩選微生物來源的 L-精氨酸酶。北京化工大學(xué) Xu[36]通過添加一定量的堿性氨基酸L-精氨酸，控制篩選培養(yǎng)基初始pH為10–11，只有能夠降解精氨酸的菌株才能在強(qiáng)堿環(huán)境下生存，并使培養(yǎng)基的 pH下降至正常范圍。之后再進(jìn)一步檢測精氨酸被降解之后的產(chǎn)物，與目標(biāo)反應(yīng)進(jìn)行對照。最終篩選得到的菌株可在24 h內(nèi)產(chǎn)43.57 g/L 鳥氨酸，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)90.13%。同樣的，Matsui等[25]用在培養(yǎng)基中添加高濃度L-精氨酸的方法，經(jīng)過3輪富級培養(yǎng)，在新發(fā)現(xiàn)的假單胞菌Pseudomonassp.中篩選到了一株新的產(chǎn)L-精氨酸酶的菌株。

采用模式菌株異源表達(dá)精氨酸酶并用于鳥氨酸合成的研究是近幾年才興起的，其中最新的成果為本研究室Song等的研究[11]。Song等結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索和文獻(xiàn)調(diào)研對精氨酸酶相關(guān)參數(shù)進(jìn)行挖掘，最終選擇芽胞桿菌Bacillus caldoveloxDSM411生產(chǎn)的精氨酸酶作為精氨酸脒基水解生產(chǎn)L-鳥氨酸的酶制劑。為了克服野生菌株生產(chǎn)精氨酸酶產(chǎn)量低的缺點，精氨酸酶基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后過量表達(dá)于大腸桿菌E.coliBL21 (DE3) 中，獲得一株 L-精氨酸酶高產(chǎn)菌株 FMME096。經(jīng)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)條件優(yōu)化后，重組菌株 FMME096酶活為177.3 U/mL，與野生菌株相比提高了47.9倍。同時，建立了L-精氨酸催化生產(chǎn)鳥氨酸的高效轉(zhuǎn)化體系：12 g/L的濕菌體和170 g/L的L-精氨酸在60 ℃、pH 9.0的條件下轉(zhuǎn)化4 h，L-鳥氨酸的產(chǎn)量最高可達(dá)112.3 g/L，轉(zhuǎn)化率87.1%，單位菌體L-鳥氨酸產(chǎn)量為 9.4 g/g?？紤]到酶的穩(wěn)定性，Zhang等[37]對精氨酸酶進(jìn)行了固定化研究。作者將畢赤酵母Pichia pastorisGS115異源表達(dá)的鳥氨酸酶以戊二醛為交聯(lián)劑、以殼聚糖為載體進(jìn)行固定化。通過比對游離酶與固定化酶的性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，兩者均在pH 10.0、40 ℃下活性最高，但是固定化酶的熱穩(wěn)定性和 pH耐受范圍更高，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。在36個催化反應(yīng)循環(huán)之后，酶活還可以保持在初始酶活的50%以上。固定化酶在添加1%戊二醛、1 mmol/L Mn2+、40 ℃、pH 10的條件下可轉(zhuǎn)化200 g/L L-精氨酸為149.9 g/L鳥氨酸，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)98%。國內(nèi)已有一些企業(yè)實現(xiàn)了L-鳥氨酸的生物酶法合成，其中包括上海漢飛生化科技有限公司、山東民強(qiáng)生物科技股份有限公司、寧波鎮(zhèn)海海德生化科技有限責(zé)任公司和天津啟仁醫(yī)藥科技有限公司等。山東民強(qiáng)生物科技股份有限公司通過陶瓷濾膜和711氨型樹脂純化底物L(fēng)-精氨酸溶液，在30 ℃下經(jīng)含有精氨酸酶的菌體催化反應(yīng)24 h后，L-精氨酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)98%。

表2 生物酶法合成L-鳥氨酸的研究進(jìn)展Table 2 Recent development of enzymatic production of L-ornithine

L-瓜氨酸是L-精氨酸在L-精氨酸脫亞胺酶作用下的產(chǎn)物。瓜氨酸常用作醫(yī)藥保健的添加劑，用于預(yù)防前列腺疾病[40]；用作健身補(bǔ)劑，增強(qiáng)肌肉力量和持久力[41]；用作食品的抗氧化劑和抗衰老保健品及化妝品[42]。生物酶法合成L-瓜氨酸的研究進(jìn)展如表3。早在1974年，Yamamoto等[43]開始將高產(chǎn) L-精氨酸脫亞胺酶的惡臭假單胞菌Pseudomonas putidaATCC4359固定化細(xì)胞用于L-鳥氨酸的工業(yè)化生產(chǎn) (Tanabe Seiyaku公司，日本)，其產(chǎn)量和時空產(chǎn)率可達(dá) 87.59 g/L和 9.73 g/(L·h)。2010年之后，對于L-精氨酸脫亞胺的研究開始增多，主要集中于酶動力學(xué)性質(zhì)的考察 (表3) 與蛋白表達(dá)策略。在表達(dá)載體的選擇上，李娜[44]比較了P.pichia和E.coli兩種不同的宿主分泌表達(dá)相同L-精氨酸脫亞胺酶的能力。首先，作者根據(jù)不同宿主密碼子偏好性對脫亞胺酶序列進(jìn)行了優(yōu)化。之后，對于P.pichia表達(dá)宿主，作者將優(yōu)化后的基因與表達(dá)載體 pPIC9K連接，成功構(gòu)建重組表達(dá)載體 pPIC9K-ADI，檢測重組蛋白酶活為29.0 U/L；對于E.coli表達(dá)宿主，作者將優(yōu)化后的基因克隆與表達(dá)載體pBAD相連接 (pBAD具有阿拉伯糖啟動子)，經(jīng)鑒定得到重組質(zhì)粒pBAD-ADI，經(jīng)檢測重組蛋白酶活為68.0 U/L，為酵母表達(dá)體系的2.34倍。在此基礎(chǔ)上，作者采用Osmotic Shock法使L-精氨酸脫亞胺酶從細(xì)胞周質(zhì)空間釋放，定位在細(xì)胞周質(zhì)空間的重組蛋白活性為53 U/L，定位在細(xì)胞內(nèi)的重組蛋白酶活為34 U/L，總酶活提高了 27.9%。在增加目的蛋白可溶性方面，Wang等[45]在單一載體上構(gòu)建了一個精氨酸脫亞胺酶的GroES-GroEL融合蛋白 (其中GroES為P.putidaATCC4359來源精氨酸脫亞胺酶，GroEL可以協(xié)助目的蛋白正確折疊)，使得脫亞胺酶的可溶性增加了6倍。

生物酶法合成瓜氨酸的最新成果為本研究室Song等[27]的研究。他構(gòu)建了一株食品安全級乳酸桿菌Lactobacillus lactis來源的精氨酸脫亞胺酶高產(chǎn)菌株，之后以易錯PCR技術(shù)對精氨酸脫亞胺酶進(jìn)行定向進(jìn)化，突變文庫里篩選獲得一株性質(zhì)明顯改善的精氨酸脫亞胺酶生產(chǎn)菌株 FMME106(R127T、R395M)，相對于出發(fā)菌株比活力提高了38.3%，達(dá)到195.7 U/mg。之后建立了精氨酸脫亞胺生產(chǎn)L-瓜氨酸高效催化體系 (15 g/L菌體細(xì)胞、190 g/L L-精氨酸、50 ℃、pH 7.2)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 h后，L-瓜氨酸的產(chǎn)量達(dá)到最大，為 176.9 g/L，轉(zhuǎn)化率為92.3%。上海聚瑞生物技術(shù)有限公司、濱州生物技術(shù)研究院有限責(zé)任公司和上海凱圣生物科技有限公司等已實現(xiàn)了生物酶法合成瓜氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)。上海凱圣生物科技有限公司從環(huán)境微生物中克隆得到了精氨酸脫亞胺酶的基因，構(gòu)建了E.coliBL21的基因工程菌，并驗證了其在生產(chǎn)L-瓜氨酸上的用途，L-精氨酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)99%。

表3 生物酶法合成L-瓜氨酸的研究進(jìn)展Table 3 Recent development of enzymatic production of L- citrulline

3.2 基于羧基基團(tuán)改造的精氨酸衍生化產(chǎn)品

生物酶法合成L-精氨酸羧基所得衍生化產(chǎn)品包括胍基丁胺和含酰胺鍵的二肽。胍基丁胺(Agmatine，AGM) 是一種重要的生物胺類物質(zhì)，是生物體內(nèi) L-精氨酸-一氧化氮和生物胺代謝途徑及多種神經(jīng)受體的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，廣泛分布在哺乳動物的胃、腸道、脾臟、骨骼肌和腦中，具有豐富的生理功能[49]。1994年在哺乳動物腦中得到分離純化后，胍基丁胺的生理功能、代謝及合成得到了越來越多的關(guān)注[50]。胍基丁胺是L-精氨酸重要的代謝產(chǎn)物之一，經(jīng) L-精氨酸脫羧酶 (L-arginine decarboxylase, ADC，EC 4.1.1.19) 催化L-精氨酸脫羧生成。同時產(chǎn)物胍基丁胺可經(jīng)胍基丁胺水解酶(Agmatinase, EC 3.5.3.11) 的催化降解為腐胺。

目前，胍基丁胺的生產(chǎn)方法包括化學(xué)法和生物酶法?；瘜W(xué)法通常以 1,4-丁二胺、己二酸二乙酯、1,4-二溴丁烷和1,4-二氯-2-丁烯為底物。反應(yīng)過程易引入有毒有害物質(zhì)，反應(yīng)過程復(fù)雜，反應(yīng)安全性低。生物酶法合成胍基丁胺的方法主要是指L-精氨酸脫羧酶催化L-精氨酸脫羧，生成目標(biāo)產(chǎn)物的過程。L-精氨酸脫羧酶屬于氨基酸脫羧酶家族，PLP依賴型，廣泛分布在植物微生物體內(nèi)。Zhang等[51]通過分子生物學(xué)的手段，構(gòu)建了一株可以過表達(dá)E.coliK12來源精氨酸脫羧酶基因的E.coliBL21菌株，并建立了一個連續(xù)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)胍基丁胺的生物過程 (100 mmol/L L-Arg、50 mmol/L PLP、pH 7.0、45 ℃、15 h)，使得胍基丁胺的最高產(chǎn)量可達(dá)20 g/L。同時，采用海藻酸鹽對細(xì)胞進(jìn)行固定化，固定化細(xì)胞循環(huán)使用6次后，平均轉(zhuǎn)化率可達(dá)55.6%。

本研究室 Sun等[30]構(gòu)建了一株E.coliBL21來源精氨酸脫羧酶EcC2的重組表達(dá)菌株，經(jīng)過酶學(xué)性質(zhì)測定和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化 (20 g/L L-Arg、3.5 g/L濕菌體、4 mmol/L Mg2+、30 mmol/L PLP、pH 7.0、37 ℃)，使得胍基丁胺的產(chǎn)量在6 h內(nèi)可達(dá)14.3 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá) 95.3%。上述轉(zhuǎn)化過程普遍存在精氨酸脫羧酶活力低、轉(zhuǎn)化過程底物載量少、時空產(chǎn)率低的問題，不利于胍基丁胺進(jìn)一步的放大生產(chǎn)與規(guī)?；苽?。本研究室Sun等在之前的研究基礎(chǔ)上，通過基因組數(shù)據(jù)庫挖掘的策略，以EcC2為探針，篩選到一個與EcC2氨基酸序列一致性為55.37%、來自腐敗希瓦氏菌Shewanella putrefaciens的脫羧酶SpA9。在相同條件下，SpA9的酶活力為15.8 U/mg，是探針EcC2酶活力的29.8倍。經(jīng)過酶學(xué)性質(zhì)研究、產(chǎn)酶條件優(yōu)化及轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化，得到L-精氨酸轉(zhuǎn)化的最佳體系為 90 g/L L-Arg，18 mmol/L Mg2+、31.5 mmol/L PLP、135 g/L濕菌體、2%曲拉通X-100。在3.5 L罐體上，控制pH 8.5、溫度37 ℃、通氣1 vvm、攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min。2 h后胍基丁胺的產(chǎn)量達(dá)到最大，為52.66 g/L，轉(zhuǎn)化率為78.27%，時空產(chǎn)率為26.33 g/(L·h)。河南華榮生物技術(shù)有限公司建立了一種生物酶法聯(lián)產(chǎn)胍基丁胺和D-精氨酸的工藝路線。首先分別構(gòu)建了表達(dá)精氨酸消旋酶基因argR的E.coli重組菌，和表達(dá)精氨酸脫羧酶基因speA的E.coli重組菌。將含有 L-精氨酸、表達(dá)精氨酸消旋酶的基因工程菌濕菌體的轉(zhuǎn)化體系，攪拌反應(yīng)后得到 DL-精氨酸的混旋物，除去精氨酸消旋酶后，補(bǔ)加表達(dá) L-精氨酸脫羧酶的濕菌體繼續(xù)攪拌反應(yīng)，至 L-精氨酸被完全消耗，最后經(jīng)分離純化得到D-精氨酸和胍基丁胺。

含酰胺鍵的二肽化合物主要由 L-氨基酸合酶催化合成。Senoo等[31]發(fā)現(xiàn)一種來源于枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis的YwfE酶，具有催化非保護(hù)氨基酸形成二肽化合物的能力，而且YwfE底物譜很廣，可以催化形成41種不同的二肽化合物，并為此建立了一個新的酶種類 (EC 6.3.2.28)。之后人們對 L-氨基酸合酶的研究越來越深。L-氨基酸合酶又稱Lal酶，是一種ATP依賴型、具有廣譜底物特性、催化非基團(tuán)保護(hù)氨基酸成肽的連接酶。常見L-氨基酸合酶可催化合成的二肽種類如表4所示。為了進(jìn)一步拓寬 L-氨基酸合酶的底物譜范圍，Senoo等[31]使用計算機(jī)模擬篩選的方法 (基于模型分析的Hidden Markov算法)，篩選了5個新的L-精氨酸合酶 (變形鏈球菌Streptococcus mutansATCC 25175，SMU 1321.c；發(fā)光桿菌Phtotrhabdus luminescens，Plu 1218；齒垢密螺旋體Treponema denticolaATCC 35405，TDE 2209；胸膜肺炎放線桿菌Actinobacillus pleuropneumoniae，Aple 02000835；肺炎雙球菌Streptococcus pneumoniae，SP 0885)，其底物范圍及產(chǎn)物種類如表 4所示。Arai等[16]發(fā)現(xiàn)來自丁香假單胞菌Pseudomonas syringaeNBRC14081的tabS基因所編碼的Lal酶可以催化形成 136種氨基酸二肽化合物 (表 4)，并以較高的轉(zhuǎn)化率合成L-精氨酸的衍生物L(fēng)-Arg-Phe (62%)。

表4 L-精氨酸合酶的底物譜及產(chǎn)物Table 4 Substrate spectrum and products of L-amino acids ligase

3.3 基于氨基基團(tuán)改造的精氨酸衍生化產(chǎn)品

基于氨基基團(tuán)改造的精氨酸衍生化產(chǎn)品有D-精氨酸、5-胍基-2-氧代戊酸以及含酰胺鍵的氨基酸二肽 (見 3.2基于羧基基團(tuán)改造的精氨酸衍生化產(chǎn)品)。

D-精氨酸是一種非蛋白組成類氨基酸，在自然界中含量稀少，具有抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散、降低生長激素和胰島素釋放速率的作用，是合成治療心腦血管疾病、抗腫瘤藥物和減肥藥的重要中間體[24]。D-精氨酸的生物酶法合成一般伴隨其他氨基酸衍生物的聯(lián)產(chǎn)。南京大學(xué)Li等在利用精氨酸脫亞胺酶轉(zhuǎn)化聯(lián)產(chǎn)D-精氨酸和L-瓜氨酸的過程中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中有一定量的L-精氨酸時，菌體生長與精氨酸脫亞胺酶的生產(chǎn)是偶聯(lián)的。作者進(jìn)一步進(jìn)行了發(fā)酵條件的優(yōu)化 (發(fā)酵培養(yǎng)基組成、接種量、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵初始pH、通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、表面活性劑的種類及加量、金屬離子)。最終，在最適的發(fā)酵和轉(zhuǎn)化條件下，100 g DL-精氨酸經(jīng)催化反應(yīng)生成D-精氨酸30.3 g、L-鳥氨酸33.1 g，分別為理論收率的 60.6%和 68.2%，產(chǎn)品質(zhì)量符合日本味之素公司AJI藥用級標(biāo)準(zhǔn)。

對于5-胍基-2-氧代戊酸的生產(chǎn)，Matsui等[25]以含有高濃度L-精氨酸的培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基，通過傳統(tǒng)土壤篩選的方法，經(jīng)過3輪富集培養(yǎng)后，通過 HPLC-MS鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，篩選得到一株可以氧化L-精氨酸為5-胍基-2-氧代戊酸的菌株。通過16S rDNA基因和進(jìn)化樹分析，鑒定該菌屬假單胞菌屬Pseudomonas，命名為Pseudomonassp.TPU 7192。

3.4 基于碳主鏈改造的精氨酸衍生化產(chǎn)品

生物酶法修飾精氨酸碳主鏈的主要產(chǎn)物為3-羥基-L-精氨酸。目前已報道可以催化L-精氨酸羥基化生成 3-羥基-L-精氨酸的酶來源于鏈霉菌Streptomycessp.ATCC11861[52]。Streptomycessp.中存在一條由VioC和VioD兩個酶組成的卷曲霉素合成路徑，其中 VioC為 Fe2+依賴型，具有L-精氨酸羥化酶的功能，可以催化L-精氨酸生成3-羥基-L-精氨酸。同時3-羥基-L-精氨酸也是卷曲霉素的前體物質(zhì)。Ju等[19]對上述研究進(jìn)行了實驗驗證，在E.coliBL21中異源表達(dá)Streptomycessp.ATCC11861中的VioC基因，并對其催化L-精氨酸的產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果表明 VioC具有L-精氨酸羥化酶活性，可以催化 L-精氨酸生成3-羥基-L-精氨酸。

4 小結(jié)與展望

圍繞“生物酶法合成L-精氨酸衍生物”這一研究主題，國內(nèi)外的研究者在L-精氨酸衍生物種類的挖掘、衍生化用酶的篩選、衍生化用酶的表達(dá)策略和催化轉(zhuǎn)化體系的建立與優(yōu)化等方面開展了大量卓有成效的研究，極大地豐富了生物酶法合成L-精氨酸衍生物的種類，并且部分產(chǎn)品已實現(xiàn)了生物酶法的工業(yè)化生產(chǎn)。然而，目前生物酶法合成L-精氨酸衍生物的產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度仍較低，其根本原因在于酶對工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境的耐受性差，難以長期保持高的催化活力；另外現(xiàn)有的L-精氨酸衍生物合成的催化體系單一，酶的催化活力難以徹底地發(fā)揮。因此如何利用酶工程的新技術(shù)與方法提高酶的催化能力和環(huán)境耐受性，如何優(yōu)化催化反應(yīng)體系的組成是未來研究的重點和熱點，主要包括：1) 利用蛋白質(zhì)工程的策略對催化用酶的缺陷進(jìn)行分子改造，提高催化用酶對工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境的耐受性；2) 多酶級聯(lián)反應(yīng)的開發(fā)與應(yīng)用，構(gòu)建體外多酶反應(yīng)途徑，優(yōu)化催化反應(yīng)體系；3) 輔酶再生系統(tǒng)的構(gòu)建，降低催化反應(yīng)成本；4) 擺脫單一水相催化的模式，利用介質(zhì)工程的手段建立高效催化體系。

[1]Heffernan KS, Vieira VJ, Valentine RJ.Microvascular function and ageing: L-arginine,tetrahydrobiopterin and the search for the fountain of vascular youth.J Physiol London, 2008, 586(8):2041–2042.

[2]Karami R, Hosseini M, Khodabandehloo F, et al.Different effects of L-arginine on morphine tolerance in sham and ovariectomized female mice.J Zhejiang Univ Sci B, 2011, 12(12): 1016–1023.

[3]Wang X, Tao WY, Sun ZH, et al.The progress of L-arginine fermentation.Ind Microbiol, 2000, 30(4):50–54 (in Chinese).王霞, 陶文沂, 孫志浩, 等.L-精氨酸發(fā)酵研究進(jìn)展.工業(yè)微生物, 2000, 30(4): 50–54.

[4]Guo J, Man ZW, Rao ZM, et al.Improvement of the ammonia assimilation for enhancing L-arginine production ofCorynebacterium crenatum.J Ind Microbiol Biot, 2017, 44(3): 443–451.

[5]Park SH, Kim HU, Kim TY, et al.Metabolic engineering ofCorynebacterium glutamicumfor L-arginine production.Nat Commun, 2014, 5: 4618.

[6]Su LM, Li S. Preservation method for L-arginine-producing strain ofBrevibacterium flavum.Ind Microbiol, 2009, 39(1): 60–62 (in Chinese).蘇令鳴, 李爽.產(chǎn)精氨酸的黃色短桿菌菌種保藏方法的研究.工業(yè)微生物, 2009, 39(1): 60–62.

[7]Huang JH, Wang XC, Wang HN, et al.Isolation of highly productive strain of L-arginine.Amino Acids Bio Res, 2005, 27(3): 46–48 (in Chinese).黃繼紅, 王新春, 王華南, 等.L-精氨酸高產(chǎn)菌株的選育.氨基酸和生物資源, 2005, 27(3): 46–48.

[8]Xiong XJ, Dou WF, Xu ZH, et al.L-Arginine production by arginine analog-resistant mutant of microorganisms.J Wuxi Univ Light Ind, 2003, 22(2):10–13 (in Chinese).熊筱晶, 竇文芳, 許正宏, 等.L-精氨酸高產(chǎn)菌的誘變育種及其搖瓶產(chǎn)酸條件.無錫輕工大學(xué)學(xué)報,2003, 22(2): 10–13.

[9]Xu ZH, Dou WF, Wang X, et al.Effects of nitrogen source and its supply manner on production of L-arginine byCorynebacterium crenatumJDN28-75.Chin J Appl Environ Biol, 2006, 12(3): 381–385 (in Chinese).許正宏, 竇文芳, 王霞, 等.氮源及其添加模式對鈍齒棒桿菌JDN28-75合成L-精氨酸的影響.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 2006, 12(3): 381–385.

[10]Su LM, Wang YM, Li S.Fermentative production of L-arginine by mutant AN78.Ind Microbiol, 2003,33(2): 1–3 (in Chinese).蘇令鳴, 王宜敏, 李爽.黃色短桿菌變異株 AN78的發(fā)酵生產(chǎn) L-精氨酸的研究.工業(yè)微生物, 2003,33(2): 1–3.

[11]Song W, Niu PQ, Chen XL, et al.Enzymatic production of L-ornithine from L-arginine with recombinant thermophilic arginase.J Mol Catal B-Enzym, 2014, 110: 1–7.

[12]Tsuchida TC, Uchibori HC, Nishimoto YC.Process for producing L-ornithine by fermentation: EP,0393708.1994-06-29.

[13]Li L, Li ZM, Chen DQ, et al.Inactivation of microbial arginine deiminases by L-canavanine.J Am Chem Soc, 2008, 130(6): 1918–1931.

[14]Tsai M, Sampaleanu LM, Greene C, et al.A duck δ1 crystallin double loop mutant provides insight into residues important for argininosuccinate lyase activity.Biochemistry, 2004, 43(37): 11672–11682.

[15]Yu JJ, Park KB, Kim SG, et al.Expression,purification, and biochemical properties of arginase fromBacillus subtilis168.J Microbiol, 2013, 51(2):222–228.

[16]Arai T, Arimura Y, Ishikura S, et al.L-amino acid ligase fromPseudomonas syringaeproducing tabtoxin can be used for enzymatic synthesis of various functional peptides.Appl Environ Microb,2013, 79(16): 5023–5029.

[17]Falasca G, Franceschetti M, Bagni N, et al.Polyamine biosynthesis and control of the development of functional pollen in kiwifruit.Plant Physiol Biochem, 2010, 48(7): 565–573.

[18]Matsui D, Oikawa T.Detection and function of the intramolecular disulfide bond in arginine racemase:an enzyme with broad substrate specificity.Chem Biodivers, 2010, 7(6): 1591–1602.

[19]Ju JH, Ozanick SG, Shen B, et al.Conversion of(2S)-arginine to (2S, 3R)-capreomycidine by VioC and VioD from the viomycin biosynthetic pathway ofStreptomycessp.strain ATCC11861.Chembiochem,2004, 5(9): 1281–1285.

[20]Lu DM.Progress in metabolic engineering for microbial synthesis of ornithine.Microbiol China,2015, 42(7): 1391–1399 (in Chinese).盧冬梅.微生物合成鳥氨酸的代謝工程研究進(jìn)展.微生物學(xué)通報, 2015, 42(7): 1391–1399.

[21]Wang JB, Zou YL, Xue HY.Studies on biological function and production of L-ornithine.Food Res Dev, 2007, 28(3): 166–169 (in Chinese).汪江波, 鄒玉玲, 薛海燕.L-鳥氨酸的生物功能及生產(chǎn)研究.食品研究與開發(fā), 2007, 28(3): 166–169.

[22]Rossi FR, Marina M, Pieckenstain FL.Role of arginine decarboxylase (ADC) inArabidopsisthalianadefence against the pathogenic bacteriumPseudomonas viridiflava.Plant Biol, 2015,17(4): 831–839.

[23]Veiga-da-Cunha M, Chevalier N, Stroobant V, et al.Metabolite proofreading in carnosine and homocarnosine synthesis molecular identification of PM20D2 as β-alanyl-lysine dipeptidase.J Biol Chem,2014, 289(28): 19726–19736.

[24]Guo TT, Peng JM, Hou YY, et al.Production of D-arginine and L-ornithine by enzymatic conversion of L-arginine amidinase.Fine Chem, 2012, 29(7):656–659 (in Chinese).郭婷婷, 彭佳敏, 侯媛媛, 等.精氨酸酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn) D-精氨酸和L-鳥氨酸.精細(xì)化工, 2012, 29(7): 656–659.

[25]Matsui D, Terai A, Asano Y.L-Arginine oxidase fromPseudomonassp.TPU 7192: characterization,gene cloning, heterologous expression, and application to L-arginine determination.Enzyme Microb Tech, 2016, 82: 151–157.

[26]Han LL, Schwabacher AW, Moran GR, et al.Streptomyces wadayamensisMppP is a pyridoxal 5′-phosphate-dependent L-arginine α-deaminase,γ-hydroxylase in the enduracididine biosynthetic pathway.Biochemistry, 2015, 54(47): 7029–7040.

[27]Song W, Sun X, Chen XL, et al.Enzymatic production of L-citrulline by hydrolysis of the guanidinium group of L-arginine with recombinant arginine deiminase.J Biotech, 2015, 208: 37–43.

[28]Engel K, Vuissoz JM, Eggimann S, et al.Bacterial expression of mutant argininosuccinate lyase reveals imperfect correlation ofin-vitroenzyme activity with clinical phenotype in argininosuccinic aciduria.J Inherit Metab Dis, 2012, 35(1): 133–140.

[29]Drozak J, Veiga-da-Cunha M, Vertommen D, et al.Molecular identification of carnosine synthase as ATP-grasp domain-containing protein 1 (ATPGD1).J Biol Chem, 2010, 285(13): 9346–9356.

[30]Sun X, Song W, Liu LM.Enzymatic production of agmatine by recombinant arginine decarboxylase.J Mol Catal B-Enzym, 2015, 121: 1–8.

[31]Senoo A, Tabata K, Yonetani Y, et al.Identification of novel L-amino acid α-ligases through hidden markov model-based profile analysis.Biosci Biotech Biochem, 2010, 74(2): 415–418.

[32]Wan HG, Zhu C, Xiong Y, et al.L-ornithine phenylacetate,a new medicine to treat hepatic encephalopathy.Chin J New Drug, 2013, 22(11):1274–1277 (in Chinese).萬紅貴, 朱超, 熊洋, 等.一種新型治療肝性腦病的藥物: L-鳥氨酸苯乙酸.中國新藥雜志, 2013,22(11): 1274–1277.

[33]Horiuchi M, Kanesada H, Miyata T, et al.Ornithine ingestion improved sleep disturbances but was not associated with correction of blood tryptophan ratio in Japanese antarctica expedition members during summer.Nutr Res, 2013, 33(7): 557–564.

[34]Kawabe H, Shibasaki T, Uchida T.Beverage containing amino acid and method of diminishing bitterness of amino acid: Japan, WO/052125.2004-06-24.

[35]Makryaleas K, Drauz K.Method for the preparation of salts of L-ornithine: US, 5405761.1995-04-11.

[36]Xu T.Study on producing L-ornithine by arginase in microorganism[D].Beijing: Beijing University of Chemical Technology, 2009 (in Chinese).徐燾.微生物酶法生產(chǎn) L-鳥氨酸的研究[D].北京:北京化工大學(xué), 2009.

[37]Zhang X, Liu J, Yu XH, et al.High-level expression of human arginase I inPichia pastorisand its immobilization on chitosan to produce L-ornithine.BMC Biotechnol, 2015, 15: 66.

[38]Zhang T, Guo YJ, Zhang H, et al.Arginase fromBacillus thuringiensisSK 20.001: purification,characteristics, and implications for L-ornithine biosynthesis. Process Biochem, 2013, 48(4):663–668.

[39]Zhan YP, Liu JZ, Mao PT, et al.Biotransformation of L-ornithine from L-arginine using whole-cell recombinant arginase.World J Microb Biot, 2013,29(11): 2167–2172.

[40]El-Sayed A, Hassan MN, Nada HMS.Purification,immobilization, and biochemical characterization of L-arginine deiminase from thermophilicAspergillus fumigatusKJ434941: anticancer activityin vitro.Biotechnol Progr, 2015, 31(2): 396–405.

[41]Ruiz E, Tejerina T.Relaxant effects of L-citrulline in rabbit vascular smooth muscle.Brit J Pharmacol,1998, 125(1): 186–192.

[42]Prestes CC, Sgaravatti AM, Pederzolli CD, et al.Citrulline and ammonia accumulating in citrullinemia reduces antioxidant capacity of rat brainin vitro.Metab Brain Dis, 2006, 21(1): 61–72.

[43]Yamamoto K, Sato T, Tosa T, et al.Continuous production of L-citrulline by immobilizedPseudomonas putidacells.Biotechnol Bioeng, 1974,16(12): 1589–1599.

[44]Li N.Studies on the secretory expression of arginine deiminase[D].Wuxi: Jiangnan University, 2010 (in Chinese).李娜.精氨酸脫亞胺酶的分泌型表達(dá)研究[D].無錫: 江南大學(xué), 2010.

[45]Wang Y, Li YZ.Cultivation to improvein vivosolubility of overexpressed arginine deiminases inEscherichia coliand the enzyme characteristics.BMC Biotechnol, 2014, 14: 53.

[46]Liu YM.Identification and directed evolution of arginine deiminase fromPseudomonas plecoglossicida[D].Wuxi: Jiangnan University, 2010(in Chinese).劉詠梅.產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶變形假單胞菌的篩選鑒定及酶的定向改造[D].無錫: 江南大學(xué), 2010.

[47]Ran S.Cloning, expression and site-mutation of a arginine deminase fromAeromonassp.[D].Wuhan:Huazhong Agricultural University, 2014 (in Chinese).冉詩.氣單胞菌精氨酸脫亞胺酶基因的克隆、表達(dá)與定點突變研究[D].武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[48]Ma Y.Recombinant expression, fermentation optimization and application of arginine deiminase fromPseudomonas putida[D].Wuxi: Jiangnan University, 2015 (in Chinese).馬越.惡臭假單胞菌精氨酸脫亞胺酶的重組表達(dá)、發(fā)酵優(yōu)化及其應(yīng)用[D].無錫: 江南大學(xué), 2015.

[49]Raasch W, Regunathan S, Li G, et al.Agmatine, the bacterial amine, is widely distributed in mammalian tissues.Life Sci, 1995, 56(26): 2319–2330.

[50]Li G, Regunathan S, Barrow CJ, et al.Agmatine: an endogenous clonidine-displacing substance in the brain.Science, 1994, 263(5149): 966–969.

[51]Zhang WG, Zhao GH, Liu JZ, et al.Enzymatic synthesis of agmatine by immobilizedEscherichia colicells with arginine decarboxylase activity.Chem Res in Chin Univ, 2011, 27(6): 992–995.

[52]Helmetag V, Samel SA, Thomas MG, et al.Structural basis for theerythro-stereospecificity of the L-arginine oxygenase VioC in viomycin biosynthesis.FEBS J, 2009, 276(13): 3669–3682.