低頻強(qiáng)噪聲急性暴露對巴馬香豬耳蝸毛細(xì)胞損傷的觀察

陳超 吳瑋，，3 王剛 屈昌北 韓浩倫 李保衛(wèi)

工業(yè)環(huán)境中存在的噪聲常為 500 Hz 以下的低頻噪聲[1]。大量研究表明，內(nèi)耳是噪聲損傷的特征性靶點(diǎn)，連續(xù)過度的噪聲刺激將導(dǎo)致耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞的損傷或缺失，造成暫時(shí)性聽覺閾移和永久性聽覺閾移[2]。低頻噪聲普遍存在于人類的生活環(huán)境中，且低頻噪聲具有衰減慢、聲波長及較易穿越障礙物的特點(diǎn)，對人體的影響比高頻噪聲更長遠(yuǎn)[3]。目前對噪聲的研究主要集中于高頻噪聲對嚙齒類動物聽功能的影響以及噪聲損傷的發(fā)生機(jī) 制[4]，關(guān)于低頻強(qiáng)聲對哺乳動物損傷的研究較少。本研究擬探討不同頻率和強(qiáng)度的低頻強(qiáng)噪聲暴露對巴馬香豬毛細(xì)胞的損傷，以及低頻強(qiáng)聲長時(shí)(30 min)持續(xù)暴露時(shí)毛細(xì)胞的死亡方式，為深入研究低頻噪聲損傷耳蝸毛細(xì)胞的機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 外耳道清潔的健康巴馬香豬13只，雌雄不限，體重10.2～18.3 kg，平均12.7±1.6 kg，分為對照組3只，50 Hz實(shí)驗(yàn)組5只和70 Hz實(shí)驗(yàn)組5只。

1.2噪聲暴露和噪聲強(qiáng)度檢測 由動力源、低頻信號發(fā)射器、功率放大器和聲源發(fā)生器組成(第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)發(fā)聲設(shè)備，在聲場內(nèi)發(fā)出頻率為50～100 Hz、強(qiáng)度≥160 dB SPL的低頻強(qiáng)聲，將50 Hz實(shí)驗(yàn)組、70 Hz實(shí)驗(yàn)組巴馬香豬分別置于50 Hz、167～170 dB SPL(由于聲強(qiáng)設(shè)備的技術(shù)限制，50 Hz聲強(qiáng)只能控制在167～170 dB之間，無法得出精確數(shù)值)和70 Hz、164 dB SPL強(qiáng)聲聲場內(nèi)(各處聲壓級相同)，持續(xù)暴露30 min。對照組不給予噪聲暴露，其他飼養(yǎng)條件與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.3聽性腦干反應(yīng)(ABR)測試 各組動物于實(shí)驗(yàn)前在隔聲靜電屏蔽室內(nèi)進(jìn)行雙耳ABR檢測，50 Hz、70 Hz實(shí)驗(yàn)組分別于噪聲暴露后即刻行雙耳ABR檢測。測試方法：3%戊巴比妥(1 mg/kg)耳緣靜脈麻醉動物后，顱頂正中接記錄電極,測試耳接參考電極,鼻尖處接地極,單耳閉合聲場給聲,刺激聲為短音,帶通濾波為100～3 000 Hz，信號放大100 000倍，刺激重復(fù)率21.1次/秒，聲刺激持續(xù)時(shí)間100 μs，間歇期10 ms，疊加1 024 次；刺激聲強(qiáng)度從80 dB SPL開始，先以10 dB遞減，接近反應(yīng)閾時(shí)以5 dB遞減至剛好出現(xiàn)波形，再重復(fù)一次，以能重復(fù)出現(xiàn)穩(wěn)定的波Ⅴ判斷為ABR反應(yīng)閾值；如果125 dB SPL不能引出反應(yīng)，則默認(rèn)其閾值為130 dB SPL。測試時(shí)注意動物保溫。

1.4畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)測試 對照組于實(shí)驗(yàn)前在隔聲靜電屏蔽室內(nèi)進(jìn)行雙耳DPOAE檢測，實(shí)驗(yàn)各組分別于實(shí)驗(yàn)前、噪聲暴露后即刻行雙耳DPOAE檢測。初始音強(qiáng)度L1=70 dB SPL，L2=60 dB SPL，初始音頻比f2/f1=1.2，測試當(dāng)f2為1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、8 000 Hz的2f1-f2的畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射幅值，以大于本底噪聲3 dB為DPOAE引出。

1.5耳蝸HE染色及免疫組化染色 完成ABR和 DPOAE測試后，動物斷頭處死，取出雙耳耳蝸。針頭挑出鐙骨，刺破圓窗膜，PBS液沖洗后，部分耳蝸標(biāo)本置于多聚甲醛溶液固定，10%乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液脫鈣60天，包埋耳蝸組織。

1.5.1HE染色 石蠟切片置于70 ℃烤箱內(nèi)烘烤45分鐘后，放入三缸二甲苯溶液中脫蠟各10分鐘，之后依次放入梯度乙醇中水化各3分鐘后流水沖洗；切片置于蘇木素染色2～3分鐘，鹽酸乙醇分化；置伊紅液30秒，鹽酸乙醇分化；依次放入梯度乙醇、二甲苯石碳酸、二甲苯、二甲苯各2分鐘；中性樹脂膠封片。

1.5.2免疫組化染色

1.5.2.1Caspase-3免疫組化染色 石蠟切片脫水；PBS溶液沖洗；2%雙氧水去除內(nèi)源性過氧化氫酶10 min，PBS溶液沖洗；BSA封閉；加抗Caspase-3抗體(用PBS以1∶100配比)，4 ℃過夜，PBS溶液沖洗；加入二抗(二抗試劑盒)1 h，PBS溶液沖洗；DAB顯色，顯色在光鏡下控制，約2 min。檢測Corti器、螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)局部Caspase-3的表達(dá)。以PBS溶液代替抗Caspase-3抗體作為陰性對照；陽性對照選擇扁桃體組織切片，方法步驟相同。

1.5.2.2TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞 組織切片二甲苯洗2次，無水乙醇洗2次，用PBS洗后加入蛋白酶K溶液室溫水解15 min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次。加入含2%過氧化氫的PBS，室溫反應(yīng)5 min。PBS清洗后加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1～5 min；滴加 54 μl TdT酶反應(yīng)液，置濕盒中于37 ℃反應(yīng)1 h。將切片置于染色缸中，加入已預(yù)熱到37 ℃的洗滌與終止反應(yīng)緩沖液，于37 ℃保溫30 min，每10 min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動；PBS洗 3次，在切片上滴加兩滴過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應(yīng)30 min；用PBS洗4次，每次5 min。在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05%DAB溶液，室溫顯色3～6 min；用蒸餾水洗4次，室溫下用甲基綠進(jìn)行復(fù)染10 min；用蒸餾水洗3次，再用100%正丁醇洗3次，用二甲苯脫水3次，封片。

1.6耳蝸基底膜鋪片及熒光染色 經(jīng)10%乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液脫鈣的耳蝸,分離耳蝸基底膜，PI染色觀察毛細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1各組巴馬香豬噪聲暴露前后ABR、DPOAE檢測結(jié)果 實(shí)驗(yàn)前各組動物ABR閾值為20～50 dB SPL，50 Hz組平均33.5±9.4 dB SPL，70 Hz組平均為34.0±4.6 dB SPL；3 000 Hz以上DPOAE均可引出；噪聲暴露后實(shí)驗(yàn)組ABR及DPOAE均未引出。

2.2各組耳蝸HE染色結(jié)果 對照組耳蝸HE染色切片未見明顯異常， 50 Hz實(shí)驗(yàn)組Corti器細(xì)胞排列紊亂，螺旋韌帶剝脫； 70 Hz實(shí)驗(yàn)組Corti器細(xì)胞排列紊亂，螺旋韌帶剝脫，血管紋剝脫(圖1)。

2.3各組耳蝸免疫組化染色結(jié)果 各組耳蝸TUNEL染色、Caspase-3染色均未見陽性表達(dá)(圖2、3)。

2.4各組耳蝸毛細(xì)胞免疫熒光染色 對照組毛細(xì)胞排列整齊，低頻強(qiáng)聲暴露后各實(shí)驗(yàn)組耳蝸外毛細(xì)胞排列紊亂、不規(guī)則，部分外毛細(xì)胞缺失(圖4)，且70 Hz實(shí)驗(yàn)組外毛細(xì)胞缺失較50 Hz實(shí)驗(yàn)組嚴(yán)重。

圖1 各組耳蝸HE染色 a為對照組,b為50Hz實(shí)驗(yàn)組,c為70Hz實(shí)驗(yàn)組(HE×100)

圖2 各組耳蝸Caspase-3染色 a為對照組,b為50Hz實(shí)驗(yàn)組,c為70Hz實(shí)驗(yàn)組(免疫組化×200)

圖3 各組耳蝸TUNEL染色 a為對照組,b為50Hz實(shí)驗(yàn)組,c為70Hz實(shí)驗(yàn)組(免疫組化×200)

圖4 各組耳蝸毛細(xì)胞免疫熒光 a為對照組,毛細(xì)胞排列整齊;b為50Hz實(shí)驗(yàn)組,噪聲暴露后外毛細(xì)胞排列紊亂、不規(guī)則,部分外毛細(xì)胞缺失;c為70Hz實(shí)驗(yàn)組,外毛細(xì)胞排列紊亂、不規(guī)則,大量毛細(xì)胞缺失,較50Hz實(shí)驗(yàn)組外毛細(xì)胞缺失嚴(yán)重

3 討論

有研究顯示噪聲對于聽覺的損傷主要與聲強(qiáng)、噪聲的頻譜性質(zhì)、持續(xù)時(shí)間、噪聲的類型和接觸方式以及個(gè)體差異相關(guān)[5]。噪聲的強(qiáng)度越高，耳聾的程度也越嚴(yán)重，因此強(qiáng)聲導(dǎo)致的聽損傷更為明顯[6,7]。本研究旨在探討不同頻率和聲強(qiáng)的低頻強(qiáng)噪聲暴露對巴馬香豬聽功能及耳蝸毛細(xì)胞影響，并觀察低頻強(qiáng)聲長時(shí)間(30 min)持續(xù)暴露所致毛細(xì)胞的死亡方式。從文中結(jié)果看，低頻強(qiáng)噪聲對巴馬香豬聽覺產(chǎn)生了明顯損傷，其聽覺損傷程度較文獻(xiàn)報(bào)道的150 dB SPL的噪聲損傷更為嚴(yán)重[8]。 耳蝸HE染色顯示50 Hz實(shí)驗(yàn)組Corti器細(xì)胞排列紊亂，螺旋韌帶剝脫；70 Hz實(shí)驗(yàn)組Corti器細(xì)胞排列紊亂，螺旋韌帶剝脫，血管紋剝脫；毛細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示50 Hz實(shí)驗(yàn)組噪聲暴露后外毛細(xì)胞排列紊亂、不規(guī)則，部分外毛細(xì)胞缺失，70 Hz實(shí)驗(yàn)組外毛細(xì)胞排列紊亂、不規(guī)則，大量毛細(xì)胞缺失，較50 Hz實(shí)驗(yàn)組外毛細(xì)胞缺失嚴(yán)重。

關(guān)于噪聲引起耳蝸損害的機(jī)制目前主要有三種理論：機(jī)械性損傷、代謝性損害和血管性改變，此三種損害機(jī)制往往同時(shí)存在，共同起作用[9]。一般認(rèn)為，強(qiáng)度在85～130 dB SPL之間的噪聲主要是通過干擾耳蝸內(nèi)的新陳代謝引起細(xì)胞的代謝性損害，從而導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞的一系列病理性改變；聲強(qiáng)在110～134 dB SPL的噪聲刺激還可引起耳蝸感覺上皮周圍血管微循環(huán)的改變，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞缺氧，引起細(xì)胞內(nèi)某些酶類活性降低和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的堆積，導(dǎo)致聽功能損傷[10]；當(dāng)噪聲強(qiáng)度超過130 dB SPL時(shí)，造成耳蝸毛細(xì)胞破壞的主要原因很可能是噪聲的機(jī)械性損傷。曾有報(bào)道，高強(qiáng)度的噪聲可直接導(dǎo)致動物死亡。本實(shí)驗(yàn)的最低噪聲強(qiáng)度達(dá)164 dB SPL，引起聽功能損傷的主要原因可能是噪聲的機(jī)械力直接破壞，造成毛細(xì)胞死亡，且70 Hz較50 Hz噪聲造成的機(jī)械性損傷更為嚴(yán)重；推測此時(shí)頻率可能成為影響損傷程度的主要因素，隨頻率增加損傷程度愈加嚴(yán)重。本課題組后期實(shí)驗(yàn)將巴馬香豬分別暴露于80 Hz(162 dB)、90 Hz(161.5 dB)、100 Hz(170 dB)、80 Hz(164 dB)、140 Hz(166 dB)、200 Hz(167.1 dB)，除80 Hz(162 dB)于暴露后2小時(shí)死亡，余均在暴露過程中死亡。但關(guān)于70 Hz實(shí)驗(yàn)組較50 Hz實(shí)驗(yàn)組外毛細(xì)胞缺失嚴(yán)重的具體原因尚需進(jìn)一步研究。

文中結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組耳蝸Caspase-3、TUNEL染色均未見陽性表達(dá)，這與本課題組前期實(shí)驗(yàn)將巴馬香豬暴露于50 Hz低頻強(qiáng)聲中5 min的結(jié)果不同，徐海燕等[10]曾將巴馬香豬暴露于的50 Hz(142 dB)的低頻強(qiáng)聲中5 min，暴露后實(shí)驗(yàn)組動物雙耳ABR均未引出，外毛細(xì)胞排列及層次均明顯錯(cuò)亂、部分消失，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，但其實(shí)驗(yàn)組動物耳蝸均可見Caspase-3陽性表達(dá)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，這可能與毛細(xì)胞死亡方式有關(guān)。目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為噪聲暴露后，耳蝸毛細(xì)胞的死亡存在凋亡、壞死兩種截然不同的死亡方式，但以凋亡為主[11，12]。楊衛(wèi)平等[13]曾對比研究PI染色、TUNEL染色法、Caspase-3免疫組化染色三種方法檢測耳蝸毛細(xì)胞死亡模式，結(jié)果提示PI染色的耳蝸基底膜可見正常、凋亡、壞死和缺失四種毛細(xì)胞核形態(tài)，細(xì)胞核固縮、熒光染色增強(qiáng)的毛細(xì)胞為凋亡，胞核腫脹、熒光染色減弱和個(gè)別熒光染色增強(qiáng)的毛細(xì)胞為壞死，TUNEL、Caspase-3表達(dá)陽性的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)Caspase-3免疫組化染色、TUNEL染色均未見各組動物耳蝸毛細(xì)胞陽性表達(dá)，DAPI染核可見多量毛細(xì)胞缺失，因此，推測低頻強(qiáng)聲長時(shí)間(30 min)持續(xù)暴露時(shí)毛細(xì)胞的死亡方式為壞死。有研究將成年灰鼠暴露于4 kHz窄帶噪聲中1 h，分別于噪聲刺激后1、4、30天觀察耳蝸毛細(xì)胞損傷情況，結(jié)果顯示，毛細(xì)胞損傷數(shù)量隨時(shí)間的延長而急劇增加，凋亡的外毛細(xì)胞數(shù)量明顯多于壞死[14]，因此認(rèn)為外毛細(xì)胞凋亡為強(qiáng)噪聲刺激后灰鼠耳蝸基底膜損傷早期細(xì)胞死亡的主要方式[14]；灰鼠耳蝸基底膜的損傷主要是噪聲刺激后,產(chǎn)生大量自由基，自由基損傷DNA 、蛋白質(zhì)、膜磷質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)分子、細(xì)胞表面受體, 導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞凋亡[15,16]。

綜上所述，本研究選擇的低頻強(qiáng)噪聲急性暴露條件能夠造成巴馬香豬耳蝸外毛細(xì)胞不可逆性損傷，且70 Hz實(shí)驗(yàn)組較50 Hz實(shí)驗(yàn)組損傷嚴(yán)重；耳蝸Caspase-3免疫組化、TUNEL染色均未見陽性表達(dá)，表明低頻強(qiáng)噪聲持續(xù)暴露30 min造成的巴馬香豬耳蝸外毛細(xì)胞主要的死亡方式為壞死。

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