RASSF1A 基因甲基化和SCC聯(lián)合檢測在非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移監(jiān)測中的應(yīng)用

張洪彬 張滿娥 黃文濱 盧志華

肺癌是否發(fā)生轉(zhuǎn)移對于術(shù)后的治療方式和預(yù)后有重要的影響，但是目前缺乏可早期、動態(tài)監(jiān)測肺癌轉(zhuǎn)移的標志物。目前多項研究表明，抑癌基因—Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白家族1A（ras association domain family 1A，RASSF1A）的編碼基因啟動子區(qū)的甲基化與肺癌相關(guān)［1?3］。因此RASSF1A基因甲基化有可能作為動態(tài)監(jiān)測肺癌轉(zhuǎn)移的標志物。同時，近幾年對于循環(huán)腫瘤DNA的研究顯示，腫瘤患者血液中游離DNA與相應(yīng)的原發(fā)腫瘤細胞基因變異相一致［2］。因此，循環(huán)血中的RASSF1A基因甲基化水平檢測也可能成為一種非侵入性的腫瘤診斷手段［3］。鱗狀上皮細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC）是一種傳統(tǒng)的肺癌標志物，可輔助診斷肺鱗癌，配合癌抗原125（cancer antigen 125，CA125）、細胞角蛋白19片段（cytoker?atin?19?fragment，CYFRA21?1）、癌胚抗原（carcino embryonic antigen，CEA）聯(lián)合檢測可提高肺癌患者診斷的靈敏性［4］，其水平與腫瘤的進展程度相關(guān)，但是單獨檢測靈敏度不高［5?6］。本研究通過隨訪觀察非小細胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）患者，采用甲基化特異性PCR（methyla?tion specific PCR，MSP）技術(shù)對NSCLC患者腫瘤組織及對應(yīng)術(shù)前血漿標本中RASSF1A甲基化水平進行檢測，并同時檢測上述病例術(shù)前血清SCC水平，旨在探討RASSF1A甲基化水平和SCC聯(lián)合檢測在NSCLC患者危險分層及術(shù)后轉(zhuǎn)移評估中的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2014年1月至2015年6月在龍巖市第二醫(yī)院就診的57例NSCLC患者，其中男性25例，年齡35～72歲，平均年齡（65.8±3.9）歲；女性 32例，年齡 30～70歲，平均年齡（59.5±5.6）歲。入選標準：①病理診斷為NSCLC，符合美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）2015年 NSCLC臨床指南［7］。②未經(jīng)任何放化療等治療。③無其他腫瘤病史。

1.2 方法

在施行手術(shù)前采集患者外周靜脈血液標本5 mL，其中2 mL分離血清，3 mL置于經(jīng)過EDTA?Na處理的抗凝管中，3 000 r/min離心15 min，分離血漿。取5～10 g腫瘤組織，腫瘤組織需取自腫塊中心且未發(fā)生壞死的部分，術(shù)后均經(jīng)病理醫(yī)生確診為NSCLC。組織獲取均征得患者及家屬知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，分別于1個月、3個月、6個月、12個月隨訪患者因肺癌轉(zhuǎn)移再次入院情況。

1.2.1 血清SCC水平測定

血清SCC水平測定采用電化學(xué)發(fā)光法，試劑和檢測儀器購自美國羅氏公司。實驗步驟按照說明書操作。血清SCC水平正常值為：＜1.5 ng/mL。

1.2.2 MSP法檢測RASSF1A甲基化水平

DNA提取及修飾：取50 mg組織，使用蛋白酶K消化法提取組織DNA，采用DNA純化試劑盒（QIAGEN，德國）提取血漿樣本中的基因組DNA，按試劑盒說明書操作。提取后的DNA用紫外分光光度計（島津UV?1750，日本）測定濃度及純度。DNA甲基化修飾使用The Intergen CpGenome DNA Modification Kit（QIAGEN，德國），取DNA 1 μg用3 mol/LNaOH處理變性后，再通過亞硫酸氫鈉修飾，50℃避光水浴過夜，修飾后的DNA用乙醇沉淀回收并用去離子水重懸，即可用于MSP的檢測。

MSP檢測：針對RASSF1A基因啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，根據(jù)參考文獻［3］合成基因的各PCR引物，甲基化引物對的上游引物序列為5′?GTGTTA?ACGCGTTGCGTATC?3′，下游引物序列為 5′?AACCCCGCGAACTAAAAACGA?3′；非甲基化引物對的上游引物序列為5′?TTTGGTTGGAGTGT?GTTAATGTGT ?3′，下游引物序列為5′?CAAACCCCACAAACTAAAAACAA?3′。

PCR 反應(yīng)體系如下：10×PCR 緩沖液2.5 μL，10 mol/L dNTP 4 μL，25 mol/L MgCl24 μL，上、下游引物各1 μL，已修飾的DNA模板10 μL，Taq酶0.5 μL，去離子水補充體積至50 μL。擴增條件如下：94℃預(yù)變性 5 min；94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃1 min，共35個循環(huán)。同時分別選取經(jīng)甲基化酶M.SssⅠ（NEB，美國）處理和未經(jīng)處理的正常人外周血淋巴細胞DNA作為甲基化、非甲基化陽性對照，去離子水作空白對照。取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進行3%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀（BIORAD，美國）拍照分析。甲基化引物擴增出條帶的樣品，判定為甲基化陽性；未甲基化引物擴增出條帶、甲基化引物擴增不出條帶的樣品，判定為甲基化陰性；2種引物均擴增出條帶的樣品，判定為甲基化陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。用χ2檢驗分別比較不同病理分期患者、鱗癌和非鱗癌患者、發(fā)生轉(zhuǎn)移和未發(fā)生轉(zhuǎn)移患者組織和血漿中RASSF1A基因甲基化陽性率；t檢驗分別比較鱗癌和非鱗癌患者、發(fā)生轉(zhuǎn)移和未發(fā)生轉(zhuǎn)移患者術(shù)前血清SCC水平。單因素方差分析法比較不同病理分期患者術(shù)前血清SCC水平差異。通過繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteris?tic curve，ROC）制定實驗數(shù)據(jù)的截斷點，采用Ka?plan?Meier進行生存分析，生存曲線比較采用Log Rank檢驗。以上統(tǒng)計學(xué)分析以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者總體病理分期及組織學(xué)類型

57例NSCLC患者，總體病理分期及組織學(xué)類型分布見表1。其中26例（45.6%）因肺癌轉(zhuǎn)移再次入院，為轉(zhuǎn)移組。其余31例未發(fā)生轉(zhuǎn)移為未轉(zhuǎn)移組。

表1 患者總體病理分期及組織學(xué)類型Table 1 The overall pathological stage and histological type of the patient

2.2 不同分組患者術(shù)前血清SCC水平、術(shù)后組織和術(shù)前血漿RASSF1A甲基化陽性率比較

比較不同病理分期患者術(shù)前血清SCC、術(shù)后組織和術(shù)前血漿RASSF1A甲基化陽性率，Ⅲ期均高于Ⅱ期、Ⅱ期高于Ⅰ期，3組間術(shù)前血清SCC水平、術(shù)后組織RASSF1A甲基化陽性率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），術(shù)前血漿RASSF1A甲基化陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。鱗癌（包括鱗癌和腺鱗癌）患者術(shù)前血清SCC水平高于非鱗癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），組織、術(shù)前血漿RASSF1A甲基化陽性率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者術(shù)前血清SCC水平、術(shù)后組織和術(shù)前血漿RASSF1A甲基化陽性率均高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），具體數(shù)據(jù)見表2。

2.3 血清SCC水平、組織和血漿RASSF1A甲基化陽性率評估患者術(shù)后轉(zhuǎn)移的價值

根據(jù)出院后12個月NSCLC患者隨訪的轉(zhuǎn)移情況，繪制血清SCC水平、組織和血漿RASSF1A甲基化陽性率對NSCLC患者術(shù)后轉(zhuǎn)移判定的ROC曲線，血清SCC水平、組織和血漿RASSF1A甲基化陽性率曲線下面積分別為0.681、0.785、0.647，檢驗P值分別為0.019、0.000、0.058。以上結(jié)果表明血清SCC和組織RASSF1A甲基化陽性率面積有統(tǒng)計學(xué)意義，血清SCC和組織RASSF1A甲基化陽性率均符合預(yù)測NSCLC術(shù)后轉(zhuǎn)移的條件，見圖1。

表2 不同分組患者術(shù)前血清SCC水平、術(shù)后組織和術(shù)前血漿RASSF1A甲基化陽性率比較Table 2 Comparison of preoperative serum SCC level,positive rate of RASSF1A methylation in postoperative tissue and preoperative plasma among different groups

圖1 血清SCC水平、術(shù)后組織和術(shù)前血漿RASSF1A甲基化陽性率預(yù)測NSCLC術(shù)后轉(zhuǎn)移的ROC曲線Figure 1 The ROC curves of serum SCC level，positive rate of RASSF1A methylation in postoperative tissue and preoperative plasma that used to predict NSCLC postoperative metastasis

2.4 生存曲線分析

結(jié)合血清SCC水平、組織RASSF1A甲基化陽性率對NSCLC患者的術(shù)后轉(zhuǎn)移判定的ROC曲線的坐標點，血清SCC水平≥4.05 ng/mL預(yù)測NSCLC患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的敏感性和特異性分別為42.3%和 96.8%，約登（Youden）指數(shù)為 0.391；RASSF1A甲基化陽性預(yù)測NSCLC患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的敏感性和特異性分別為73.1%和83.9%，Youden指數(shù)為0.569。以血清SCC、組織RASSF1A甲基化水平越高，發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險越高進行危險分層。將血清SCC為4.05 ng/mL、組織RASSF1A發(fā)生甲基化（賦值為1）作為危險分層界值繪制Kaplan?Meier生存曲線，將入選的NSCLC患者分為高危組（血清SCC水平≥4.05 ng/mL和/或組織RASSF1A發(fā)生甲基化，共24例）、低危組（血清SCC水平＜4.05 ng/mL和/或組織RASSF1A未發(fā)生甲基化，共33例）。Log Rank（Mantel?Cox）檢驗顯示，高危組與低危組患者生存時間差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.011，P＜0.05），見圖2。

3 討論

圖2 不同危險分層的Kaplan?Meier生存曲線Figure 2 Kaplan?Meier survival curves of different risk stratification

由于非小細胞肺癌易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此判斷臨床病情的嚴重程度、危險分層和術(shù)后轉(zhuǎn)移給患者帶來了很大的困難。在非小細胞肺癌的研究中，主要依靠病理分期、生物標志物和患者的臨床特征來預(yù)測預(yù)后。尋找非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移標志物是肺癌研究領(lǐng)域的熱點之一。近年來，CA125、CYFRA21?1、CEA等生物標志物已被確定在非小細胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展中有重要作用。同時，還為非小細胞肺癌的診斷、危險分層、療效評價和術(shù)后轉(zhuǎn)移提供了有力的支持。

在本研究中使用的SCC是一種常用的腫瘤標志物，其在子宮、肺、頭部和頸部等鱗癌中均有表達。大量的臨床研究表明，檢測SCC有助于判斷非小細胞肺癌患者的術(shù)后轉(zhuǎn)移，尤其是在肺鱗狀細胞癌患者中［4?6］。在非小細胞肺癌患者中，血清SCC的升高可能提示轉(zhuǎn)移或預(yù)后差。本研究結(jié)果顯示，越后期的病理分期，術(shù)前血清SCC水平越高，可以輔助病理分期的診斷；同時，鱗癌患者SCC水平可以作為肺鱗狀細胞癌的鑒別診斷指標；高水平SCC轉(zhuǎn)移率較高與國內(nèi)外SCC對于NSCLC術(shù)后轉(zhuǎn)移評價的研究結(jié)果一致［4?6］。

在NSCLC標志物的研究中，通過檢測可預(yù)測化療療效和預(yù)后的分子標記物，可以識別出可從化療中受益的早期患者。RASSF1A是一個抑癌基因，多項研究表明其啟動子區(qū)異常的高甲基化會導(dǎo)致其喪失抑癌功能［8?9］。另外，有研究指出，腫瘤細胞在壞死的過程中，可釋放DNA進入循環(huán)血中，與相應(yīng)的原發(fā)腫瘤細胞在分子層面的變異相一致［10?11］。但是 NSCLC 的基因甲基化研究僅局限于組織方面，僅有少數(shù)檢測循環(huán)血中的研究［12］。針對河北地區(qū)人群的相關(guān)性研究表明，血漿中甲基化RASSF1A基因的檢出率與NSCLC的分化程度有關(guān)［13］。也有研究指出，肺癌組織和血漿RASSF1A基因甲基化檢出率與患者分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)［14］，非小細胞肺癌患者的淋巴結(jié)有更高比例的RASSF1A基因甲基化檢出率［15］。這與本研究的結(jié)果具有一致性。本實驗通過檢測NSCLC患者術(shù)后組織和血漿RASSF1A甲基化水平，并對患者進行12個月的隨訪，隨訪期間發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者組織和血漿RASSF1A甲基化陽性率均高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這表明RASSF1A甲基化與NSCLC患者術(shù)后轉(zhuǎn)移相關(guān)，有望作為NSCLC術(shù)后轉(zhuǎn)移預(yù)測的新型標志物。另外，病理分期越晚，組織RASSF1A甲基化陽性率越高，可作為病理分期的輔助標志物［16?17］。

本文研究結(jié)果表明，血清SCC和組織RASSF1A甲基化陽性率均可作為NSCLC術(shù)后轉(zhuǎn)移的標志物，但分別使用的正確診斷指數(shù)（約登指數(shù)）并不高。Log Rank（Mantel?Cox）檢驗顯示，血清SCC、組織RASSF1A甲基化水平高與水平低的患者生存時間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。血清 SCC、組織RASSF1A甲基化水平都與NSCLC的危險分層有關(guān)，且水平越高發(fā)生轉(zhuǎn)移事件的風(fēng)險越大。綜上所述，血清SCC、血漿和組織RASSF1A甲基化水平在NSCLC患者危險分層及術(shù)后轉(zhuǎn)移評估中有一定的臨床意義。

本研究數(shù)據(jù)僅限于龍巖地區(qū)，樣本量不夠大；此外，本研究以無轉(zhuǎn)移的NSCLC患者為對照組，未建立良性肺病對照組、小細胞肺癌對照組，隨訪持續(xù)時間僅為一年。以上是本研究的不足之處。因不同的標志物有各自獨特的生物學(xué)特性和代謝過程，在NSCLC的發(fā)展過程中協(xié)同或單獨發(fā)揮作用，如果能對NSCLC患者血清SCC、血漿RASSF1A甲基化水平聯(lián)合并持續(xù)檢測，同時結(jié)合影像學(xué)等其他診斷手段，將有利于對NSCLC術(shù)后轉(zhuǎn)移不良患者的監(jiān)測和干預(yù)，對延緩病情進展、延長患者的生存時間有重要意義。

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