雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物活血化瘀及抗炎作用研究?

王彥禮，劉雅萍，高俊鵬，王敦方，徐航宇，馬旭冉，楊偉鵬△

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700； 2. 大連普瑞康生物技術(shù)有限公司，大連 116001； 3. 神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，石家莊 051430)

天山雪蓮(saussurea involucrate (kar．et Kir) Sch．Bip) 是我國珍稀的名貴藥材，具有活血通經(jīng)、散寒除濕、強(qiáng)筋助陽等功效，在民族地區(qū)常用來治療風(fēng)濕、婦女痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)等疾病[1]。由于天山雪蓮生長環(huán)境特異，生長緩慢，人工栽培困難，加之過度采挖致使雪蓮資源匱乏，而采用植物細(xì)胞工程技術(shù)對(duì)雪蓮進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，能生產(chǎn)出質(zhì)量穩(wěn)定、藥效成分高的雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物，并可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，此技術(shù)可有效解決雪蓮藥材短缺的問題[2]。本研究觀察雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)急性血瘀模型大鼠的活血化瘀作用及抗子宮內(nèi)膜異物炎癥的作用，為臨床應(yīng)用雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物治療婦科疾病提供實(shí)驗(yàn)方面支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠，體質(zhì)量180～200 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)SCXK-(軍)2012-0004)。

1.2 藥物

雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物(20166，批號(hào)H130401)，大連普瑞康生物技術(shù)有限公司；阿司匹林(sigma，批號(hào)20120928001)；鹽酸腎上腺素注射液，天津金耀氨基酸有限公司(批號(hào)1307051)；ADP血小板聚集功能檢測試劑盒，山東泰利信醫(yī)療科技有限公司(批號(hào)20160927B)；纖維蛋白原FIB含量測定試劑盒，上海太陽生物技術(shù)有限公司(批號(hào)132090)。

1.3 儀器

LBY-N6K自動(dòng)血液流變儀、LBY-NW1毛細(xì)管黏度計(jì)、C2000-4血凝儀、LBY-NJ4血小板聚集儀，北京普利生儀器有限公司；KH-120 M毛細(xì)管離心機(jī)，日本產(chǎn)；KUBOTA紅細(xì)胞壓積讀數(shù)板、TGL-16型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SN-695型智能放免γ測量儀，上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠生產(chǎn)。

1.4 分組及造模

1.4.1 取雄性大鼠60只，按體質(zhì)量隨機(jī)分出10只作為空白對(duì)照組，其余50只大鼠分為血瘀模型組、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物高、中、低3個(gè)劑量組和陽性藥阿司匹林組。雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物按照140、70、35 mg/kg 3個(gè)劑量(相當(dāng)于人用劑量3.33 mg/kg/d的40、20、10倍)，陽性藥阿斯匹林按照100 mg/kg灌胃給藥，空白對(duì)照組和模型組給予同體積溶劑，每日1次，持續(xù)7 d。于第7天皮下注射腎上腺素1 mg/kg共2次，間隔4 h，在2次注射之間，將大鼠浸入冰水內(nèi)5 min處置后禁食，次日取血進(jìn)行血液流變學(xué)檢測[3]。

1.4.2 取雌性大鼠60只，用1.6%戊巴比妥鈉麻醉，剪去下腹部毛酒精消毒，于下腹正中切口2 cm，暴露子宮，沿左側(cè)子宮角上1 cm處作一橫切口，將消毒后的塑料管(2 mg)放置子宮內(nèi)縫合固定，滴入青霉素以防感染[4]。次日，將手術(shù)后的大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、陽性藥阿司匹林組、雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物高、中、低劑量組共5組。雪蓮培養(yǎng)物按照140、70、35 mg/kg 3個(gè)劑量(相當(dāng)于人用劑量3.33 mg/kg/d的40、20、10倍)，陽性藥阿斯匹林按照100 mg/kg灌胃給藥，模型組給予同體積溶劑，每日1次，連續(xù)7 d。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 將1.4.1的禁食大鼠20%烏拉坦腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈采血5 ml，按9∶1的比例將全血與3.8%的枸櫞酸鈉溶液混勻抗凝，取6 ml抗凝血用于血小板、全血黏度和紅細(xì)胞壓積的測定，余3 ml 3000 r/min離心15 min以分離血漿，用于血漿黏度和血漿纖維蛋白原含量的測定。將旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)設(shè)定剪切率為10、200 s-1，檢測溫度37 ℃，加入710 μL抗凝全血，觀察并記錄其不同切變率下的全血黏度；紅細(xì)胞壓積的測定用微量血細(xì)胞比積法：取∮1.5×75 mm的毛細(xì)管吸取0.2 ml抗凝血，一端封閉，12000 r/min離心5 min，用刻度板讀數(shù)，讀數(shù)/0.9以去除抗凝劑的影響；血漿纖維蛋白原(Clauss法)按試劑盒說明書在血凝儀上進(jìn)行測定。

1.5.2 將1.4.2的大鼠末次給藥1 h后取血分離血清，放免法檢測腫瘤壞死因子TNF-α，處死動(dòng)物摘取致炎側(cè)和非致炎側(cè)子宮，稱重并計(jì)算腫脹率和抑制率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)急性血瘀模型大鼠的活血化瘀作用

表1顯示，模型組與對(duì)照組比較紅細(xì)胞壓積無明顯變化，血漿纖維蛋白原含量、血小板聚集率、血漿黏度、全血黏度均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，說明急性血瘀模型造模成功。雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物低劑量組可明顯降低血漿纖維蛋白原含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物高、中、低劑量組可明顯降低全血黏度10、全血黏度200，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，對(duì)于紅細(xì)胞壓積、血小板聚集率以及血漿黏度無明顯影響。

表1 雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)急性血瘀模型大鼠血液流變學(xué)的影響

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.2 雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異物炎癥的作用

表2顯示，雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物高、中、低劑量組均可以降低致炎子宮的腫脹率，體現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，其中高、中劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物高、中、低劑量組均可明顯降低血清中TNF-α含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)子宮異物炎癥及TNF-α的影響

注：與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

天山雪蓮在民族地區(qū)常用來治療婦科疾病，如痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)等。雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物具有與野生雪蓮相近的抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制等作用[5-6]，且黃酮等有效成分含量高于野生雪蓮[7]。目前，雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物已被批準(zhǔn)為新資源食品，多種保健功能已得到證實(shí)[8-9]，但目前針對(duì)雪蓮治療婦科疾病的實(shí)驗(yàn)研究尚少。

中醫(yī)理論認(rèn)為“大怒致瘀”“外寒也可致瘀”。本研究采用給予大鼠皮下注射大劑量腎上腺素模擬暴怒時(shí)的機(jī)體狀態(tài)，并以冰水浸泡模擬寒邪入侵，在兩種因素綜合作用下復(fù)制大鼠急性血瘀證模型。腎上腺素為α和β受體激動(dòng)劑，具有收縮外周血管和增加心肌收縮力的作用，使心臟負(fù)荷增加，心肌耗氧代謝增加，心功能下降，從而使血液運(yùn)行障礙，血液黏度增加，加之液體的黏度在溫度降低時(shí)升高，再給動(dòng)物施以冰水冷浴。二者的綜合作用使得模型組除紅細(xì)胞壓積指標(biāo)沒有明顯變化外，其余各項(xiàng)血液流變學(xué)指標(biāo)均較正常組顯著升高，復(fù)制出血液流變性呈“黏、濃、凝、集”的血瘀狀態(tài)。

血液流變學(xué)的主要指標(biāo)是全血黏度、血漿黏度以及紅細(xì)胞聚集指數(shù)等，其水平的增高是導(dǎo)致血液高黏滯及血栓形成的重要原因；全血黏度增高是血液黏滯度增高的根本，主要與紅細(xì)胞聚集增強(qiáng)有關(guān)，而低切變率下的全血黏度在一定程度上反映紅細(xì)胞聚集能力；血漿黏度增高是導(dǎo)致血液黏度增高的原因之一，與血漿無形成分的改變有關(guān)[10]。

本文采用冰水浴和注射腎上腺素結(jié)合的方法造成大鼠血瘀模型。本研究結(jié)果顯示，雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物可以明顯降低急性血瘀模型大鼠的全血黏度，對(duì)血漿纖維蛋白原也有一定的降低作用，說明雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物具有一定的活血化瘀作用。

腫瘤壞死因子(TNF-α)是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子。正常水平的 TNF-α可以參與抵抗細(xì)菌、病毒和寄生蟲的感染, 促進(jìn)組織修復(fù),引起腫瘤細(xì)胞凋亡等,但TNF-α在體內(nèi)的大量產(chǎn)生和釋放則會(huì)破壞機(jī)體的免疫平衡,與其他炎癥因子共同產(chǎn)生多種病理損傷, 如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、炎癥性腸病等多種疾病[11]。子宮內(nèi)膜異物可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎癥的發(fā)生，使致炎子宮出現(xiàn)不同程度的腫脹。雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物可以降低致炎子宮的腫脹程度，并可以明顯降低致炎大鼠血清中炎癥介質(zhì)TNF-α的含量，說明雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)于子宮內(nèi)膜異物引起的炎癥具有一定的抑制作用。

綜上，雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物具有一定的活血化瘀和抗婦科炎癥的作用。本結(jié)果對(duì)于雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)用于婦科疾病的治療提供了一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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