• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    Nano DSC法測定ILPR G-四鏈體的熱力學(xué)性質(zhì)

    2018-03-21 01:09:29張又右史全王思雨譚志誠王韶旭
    關(guān)鍵詞:溫區(qū)構(gòu)象溶菌酶

    張又右,史全,王思雨,譚志誠,王韶旭

    (1.大連交通大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,遼寧 大連116028;2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 熱化學(xué)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116023)

    0 引言

    端粒結(jié)構(gòu)存在于染色體末端,是一種富含鳥嘌呤(Guanine)的非編碼重復(fù)序列.端粒DNA的四個(gè)鳥嘌呤G在一價(jià)金屬陽離子(如K+、Na+)的誘導(dǎo)下[1]可以通過堿基間Hoogsteen氫鍵作用形成環(huán)狀的芳香平面結(jié)構(gòu)——G-四分體(G-quartets),平面通過π-π相互作用進(jìn)一步形成四鏈體結(jié)構(gòu).已有文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)DNA序列形成穩(wěn)定的G-四鏈體時(shí),端粒酶活性降低,相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)被明顯抑制[2].在生物體內(nèi),G-四鏈體的不同堿基類型、空間構(gòu)象、溝槽種類等決定了G-四鏈體具有多態(tài)性和特異性,使得G-四鏈體能夠作為藥物選擇性識別的靶點(diǎn).因而近年來G-四鏈體在小分子抗病毒[3]和抗腫瘤[4]藥物合成方面得到了廣泛的關(guān)注.

    ILPR(insulin linkage polymorohism region)是位于染色體胰島素基因近側(cè)啟動子365 bp處的一個(gè)基因片段[5],其堿基序列為5′-ACAG4TGTG4-3′.Kennedy等[6]證實(shí)了ILPR序列能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性,且能夠在胰島β細(xì)胞之間傳遞轉(zhuǎn)錄信號,該序列的增多會導(dǎo)致病毒基因具有高傳染性,因此ILPR序列是Ⅰ型糖尿病這一多基因遺傳病的關(guān)鍵.Schonhoft等[7]提出當(dāng)ILPR序列折疊形成穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)時(shí),轉(zhuǎn)錄水平降低,病毒基因表達(dá)被抑制,從而達(dá)到靶向治療的目的.

    近年來國內(nèi)外學(xué)者對ILPR G-四鏈體進(jìn)行了一系列結(jié)構(gòu)和性質(zhì)研究.Schonhoft等[7]使用熒光淬滅法研究了ILPR G-四鏈體與胰島素溶液的結(jié)合常數(shù).Jennifer等[8]利用圓二色光譜法測定了ILPR G-四鏈體與胰島素結(jié)合后的結(jié)構(gòu)變化并設(shè)計(jì)了相應(yīng)的電化學(xué)傳感器.Xiao等[9]在其工作中使用等離子共振技術(shù)研究了ILPR G-四鏈體和胰島素樣生長因子-2(IGF-2)的解離常數(shù).Christine等[10]研究了ILPR G-四鏈體與胰島素的作用機(jī)制且證明了ILPR能在鉀離子溶液中形成穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu).這些研究在一定程度上探究了G-四鏈體的性質(zhì),揭示了ILPR序列和胰島素的結(jié)合作用,然而對ILPR G-四鏈體的熱力學(xué)性質(zhì)如比熱研究等涉及較少.

    差示掃描微量熱儀技術(shù)(Nano DSC)能夠準(zhǔn)確地測定微瓦級別的熱效應(yīng),具有高靈敏性和穩(wěn)定的控溫能力,這一量熱技術(shù)能從能量角度提供光譜法等其他方法無法直接得到的熱力學(xué)基礎(chǔ)參數(shù),在測定G-四鏈體等小分子時(shí)能準(zhǔn)確獲取體系中相互作用的能量信息.

    本研究主要利用TA Nano DSC在40~100℃溫區(qū)測量了ILPR G-四鏈體在K+溶液中的熔融溫度Tm、融化焓ΔH和等壓比熱Cp,并通過兩態(tài)模型對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了擬合,將熱力學(xué)行為與微觀結(jié)構(gòu)變化結(jié)合起來,為當(dāng)前進(jìn)一步研究ILPR G-四聯(lián)體提供新思路.

    1 實(shí)驗(yàn)方法

    1.1 試劑與儀器

    ILPR序列的DNA片段由上海生工生物工程有限公司合成和純化, DNA序列通過質(zhì)譜檢測,分子量誤差<0.1%;氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀,分析純,購自天津阿法埃莎(Alfa Aesar)化學(xué)有限公司;0.1 mol/L甘氨酸溶液(pH為2.4)和0.925 mg/mL溶菌酶溶液由TA Instruments提供;實(shí)驗(yàn)用水為高純水.

    1.2 DNA樣品預(yù)處理

    將50 OD DNA片段溶于高純水中,于4℃低溫靜置保存12 h,配置成儲存液.配置PBS緩沖液: 10 mmol/L的K2HPO4溶液和KH2PO4溶液中加入 100 mmol/L的KCl緩沖溶液(調(diào)節(jié)pH為7.4).儲存液中加入5 mL PBS緩沖液混合,留作退火處理.

    1.3 Nano DSC實(shí)驗(yàn)

    1.3.1 誤差校準(zhǔn)

    使用隨配的脫氣裝置,在20 inches Hg的真空度下將待測甘氨酸與溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)試劑脫氣15 min,消除氣泡對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾.基線實(shí)驗(yàn)在3 atm壓力下以1℃/min的升溫速率預(yù)掃描甘氨酸溶液至85℃,后續(xù)從25℃升溫至85℃,重復(fù)兩遍.標(biāo)準(zhǔn)樣品實(shí)驗(yàn)在3 atm壓力下掃描溶菌酶溶液至85℃.誤差校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍.

    1.3.2 預(yù)掃描

    為了避免溶液與儀器器壁之間的熱量交換對熱流信號產(chǎn)生影響,實(shí)驗(yàn)前12 h將適量PBS溶液進(jìn)樣至Nano DSC中,以1℃/min的升降溫速率進(jìn)行循環(huán)實(shí)驗(yàn).

    1.3.3 DNA退火

    混合液在Nano DSC中以1.5℃/min的速率從室溫升至90℃,于90℃恒溫10 min,以確保序列處于單鏈無序狀態(tài),再以0.1℃/min的速率緩慢降至4℃.

    1.3.4 G-四鏈體測定

    緩沖液掃描在3 atm 壓力下于40~110℃溫度范圍內(nèi),以0.5℃/min的速率升溫PBS緩沖溶液,重復(fù)測定2次.樣品掃描在3 atm 壓力下于40~110℃溫度范圍內(nèi),以0.5℃/min的速率升溫退火后的G-四鏈體溶液.

    1.3.5 UV-vis測定

    以PBS緩沖液做參比溶液,在1 cm石英比色皿中加入一定濃度的退火后的G-四鏈體溶液,在波長190~350 nm之間以0.5 nm為間隔測定其吸光度.

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

    2.1 Nano DSC誤差校準(zhǔn)結(jié)果

    在40~75℃溫區(qū)范圍內(nèi)校準(zhǔn)0.1 mol/L甘氨酸緩沖液熱流基線后,0.925 mg/mL溶菌酶的摩爾比熱隨溫度變化的曲線Cp,m-T如圖1所示.其中圓點(diǎn)、方塊與三角形分別代表了第一次、第二次與第三次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.如圖1所示,溶菌酶的摩爾比熱隨著溫度升高呈現(xiàn)對稱的吸熱峰,在57℃左右有一個(gè)吸熱峰值,峰頂溫度即為熔融中點(diǎn)溫度Tm.

    圖1 溶菌酶DSC熱譜圖

    用Nano DSC標(biāo)準(zhǔn)積分軟件計(jì)算出的溶菌酶熔融中點(diǎn)溫度和融化焓列于表1.

    表1 重復(fù)實(shí)驗(yàn)下溶菌酶的熔融中點(diǎn)溫度和融化焓

    根據(jù)ASTM E 2603-08[11],溶菌酶的熱力學(xué)標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)列于表2.且由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出三次校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好.對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)值可以認(rèn)為誤差校準(zhǔn)后測量精度已達(dá)到標(biāo)準(zhǔn).

    表2 溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)熱力學(xué)數(shù)據(jù)

    2.2 ILPR G-四鏈體試驗(yàn)結(jié)果

    圖2所示為ILPR G-四鏈體在40~110℃溫區(qū)范圍的DSC熱譜圖曲線.如圖所示,ILPR G-四鏈體的熔融轉(zhuǎn)變分別在67.63℃和96.2℃,這表明ILPR G-四鏈體的去折疊熔融過程不是一個(gè)簡單的兩態(tài)轉(zhuǎn)變過程.在低熔融溫度下,第一次構(gòu)象轉(zhuǎn)變?nèi)诔涕L且溫區(qū)跨度大.在高熔融溫度下,第二次構(gòu)象轉(zhuǎn)變峰形變窄,轉(zhuǎn)變迅速.

    圖2 ILPR G-四鏈體DSC熱譜圖

    已有研究從光譜的角度分析了ILPR G-四鏈體的構(gòu)象.Paramasivan S[12]和Kypr J[13]曾利用圓二色光譜法對G-四鏈體的特征結(jié)構(gòu)CD譜圖作出總結(jié),研究認(rèn)為G-四鏈體的平行構(gòu)象在260~265 nm處出現(xiàn)正Cotton效應(yīng)、240 nm處出現(xiàn)負(fù)Cotton效應(yīng);而反平行構(gòu)象則在295nm處出現(xiàn)正Cotton效應(yīng)、260 nm處出現(xiàn)Cotton效應(yīng).對ILPR G-四鏈體,Dhakal S[14]、Christine M[10]、Schonhoft J D[7]等人經(jīng)CD熔融實(shí)驗(yàn)表明該G-四鏈體在265、295 nm出現(xiàn)明顯正Cotton效應(yīng),如圖3所示.這說明了ILPR G-四鏈體可能是平行構(gòu)象和反平行構(gòu)象的混合.

    圖3 ILPR G-四鏈體 CD光譜圖

    在本研究中,可以從比熱的角度分析G-四鏈體可能的結(jié)構(gòu)微觀變化.Liphardt J[15]研究表明,在反平行構(gòu)象中,G四分體之間鳥嘌呤G形成的環(huán)形相連的連續(xù)結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定,反平行構(gòu)象解鏈的破裂力高.在圖2中,在較低熔融溫度下,第一次構(gòu)象轉(zhuǎn)變峰值處比熱為0.465 J/mol·℃.在較高熔融溫度下,第二次構(gòu)象轉(zhuǎn)變峰值處比熱為6.054 J/mol·℃.這說明第二次構(gòu)象轉(zhuǎn)變吸熱更多,且需要在溫區(qū)跨度為86~105℃的較高溫度下進(jìn)行,相比較第一次構(gòu)象轉(zhuǎn)變處平緩的吸熱解鏈情況,推斷這是由于反平行構(gòu)象穩(wěn)定、解鏈所需能量大導(dǎo)致.高溫熔融源自于反平行構(gòu)象轉(zhuǎn)變,低溫熔融對應(yīng)平行構(gòu)象轉(zhuǎn)變.兩個(gè)熔融峰分離十分明顯,說明這兩種構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程可能是相對獨(dú)立的.

    在圖4中,通過TA Analysis軟件模擬,基線校正后的G-四鏈體摩爾比熱隨溫度變化曲線的去卷積處理可以很好地把原始實(shí)驗(yàn)曲線處理成兩個(gè)分立組分的疊加,以此來分離這兩個(gè)相對獨(dú)立的構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程.

    圖4 DSC熱譜圖去卷積模擬

    為了準(zhǔn)確表達(dá)比熱數(shù)據(jù),計(jì)算每個(gè)轉(zhuǎn)變過程中的熔融焓,研究中采用了高斯函數(shù)對比熱實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合:

    (1)

    式(1)中的各擬合參數(shù)沒有物理意義,僅作比熱實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合.所有的擬合參數(shù)(A0、A1、A2、A3)和擬合數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的均方根偏差(RMS)列于表3.

    由此計(jì)算出來G-四鏈體熔融溫度和融化焓列于表4.

    所有ILPR G-四鏈體在40~110℃的摩爾比熱實(shí)驗(yàn)值(以0.5℃為間隔)列于表5.

    表3 比熱擬合系數(shù)

    表4 ILPR G-四鏈體熔融溫度和融化焓

    表5 ILPR G-四鏈體摩爾比熱

    2.3 紫外可見吸收光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    對ILPR序列,其摩爾吸光系數(shù)ε=283 900 L/(mol·cm),分子量為8.911 8 kD.吸光度A在波長190~350 nm之間的變化曲線如圖5所示.在260 nm 處G-四鏈體溶液吸光度為4.068.由朗伯-比耳定律得:

    A=εbc

    其中,A為吸光度;ε為摩爾吸光系數(shù);b為液池厚度;c為溶液濃度.

    圖5 ILPR G-四鏈體紫外可見吸收光譜圖

    由此計(jì)算得退火后的G-四鏈體溶液濃度為14.33 μmol/L.

    3 結(jié)論

    通過Nano DSC法進(jìn)行ILPR序列退火處理,并通過紫外光譜測試得到退火后的ILPR G-四鏈體濃度.在3 atm壓力下,40~110℃溫區(qū)準(zhǔn)確測量了ILPR G-四鏈體在K+溶液中的等壓比熱,并通過去卷積擬合數(shù)據(jù)分離兩個(gè)結(jié)構(gòu)的變化過程,分別得到熔融中點(diǎn)溫度為(67.63±0.16)℃和(96.2±0.01)℃;融化焓為(170.9±2.1)kJ/mol 主(392.0±1.6)kJ/mol.

    [1]CHANTOT J F, GUSCHLBAUER W. Physicochemical properties of nucleosides 3. Gel formation by 8-bromoguanosine [J]. FEBS Lett.,1969,4(3): 173-176.

    [2]ZHANG JING NAN, YU QIAN QIAN. A ruthenium(II) complex capable of inducing and stabilizing bcl-2 G-quadruplex formation as a potential cancer inhibitor [J]. Journal of Inorganic Biochemistry, 2013,134:1- 11.

    [3]VIRGILIO A, ESPOSITO V . Structural Investigations on the Anti-HIV G-Quadruplex-Forming Oligonucleotide TGGGAG and Its Analogues: Evidence for the Presence of an A-Tetrad [J]. Chem. Bio. Chem., 2012,13(15): 2219- 2224.

    [4]PAULA J, DAMIAN Al. Discovery and Development of the G-Rich Oligonucleotide AS1411 as a Novel Treatment for Cancer [J]. Exp. Mol. Path., 2009,86(3): 151- 164.

    [5]CONNOR A C, FREDERICK K A. Insulin Capature by an Insulin-Linked Polymorphic Region G-Quadruplex DNA Oligonucleotide[J]. J. Am. Chem. Soc., 2006,128(15): 4986- 4991.

    [6]KENNEDY G C, GERMAN M S . The Minisatellite in the Diabetes Susceptibility Locus Iddm2 Regulates Insulin Transcription [J]. Nat. Genet., 1995,9(3): 293- 298.

    [7]SCHONHOFT J D, DAS A. ILPR Repeats Adopt Diverse G-quadruplex Conformations That Determine Insulin Binding [J]. Biopolymers., 2010,93(1): 21- 31.

    [8]GERASIMOV J Y, SCHAEFER C S, YANG W, et al. Development of an Electrochemical Insulin Sensor Based on the Insulin-Linked Polymorphic Region [J]. Biosens. Bioelectron., 2013,42: 62- 68.

    [9]XIAO J, CARTER J A. A Genome-Inspired DNA Ligand for the Affinity Capture of Insulin and Insulin-Like Growth Factor-2[J]. J. Sep. Sci.,2009,32(10):1654- 1664.

    [10]CHRISTINE M T, NICOLEL Ml. An Isothermal Titration and Differential Scanning Calorimetry Study of the G-Quadruplex DNA-Insulin Interaction[J]. J. Phys. Chem. B., 2014,118: 1784- 1790.

    [11]美國材料實(shí)驗(yàn)協(xié)會. ASTM Standards[EB/OL]. https://www.astm.org/DATABASE.CART/HISTORICAL/E2603- 08.htm.

    [12]PARAMASIVAN S, RUJAN I, PHILIP H. Circular dichroism of quadruplex DNAs: Applications to structure, cation effects and ligand binding[J]. Methods.,2007,43: 324- 331.

    [13]KYPR J, KEJNOVSKA I, RENCIUK D, et al. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA[J]. Nucleic Acids Res., 2009,37(6): 1713- 1725.

    [14]DHAKAL S, SCHONHOFT J D. ILPR G-quadruplex Formed in Seconds Demonstrate High Mechanical Stabilities [J]. J. Am. Chem. Soc., 2009,131(5): 1876- 1882.

    [15]LIPHARDT J, DUMONT S, SMITH S B, et al. Equilibrium Information from Nonequilibrium Measurements in an Experimental Test of Jarzynski′s Equality [J].Science,2002,296: 1832- 1835.

    猜你喜歡
    溫區(qū)構(gòu)象溶菌酶
    PPRTs 偏差方程外推至-189.344 2~156.598 5 ℃溫區(qū)的研究
    偶氮類食品著色劑誘惑紅與蛋溶菌酶的相互作用研究
    質(zhì)子交換爐溫控系統(tǒng)的模糊解耦預(yù)測控制
    一種一枝黃花內(nèi)酯分子結(jié)構(gòu)與構(gòu)象的計(jì)算研究
    航空配餐樓中溫區(qū)空調(diào)系統(tǒng)設(shè)計(jì)探討
    雙溫區(qū)雙冷指斯特林制冷機(jī)連管的設(shè)計(jì)
    真空與低溫(2015年4期)2015-06-18 10:47:26
    玉米麩質(zhì)阿拉伯木聚糖在水溶液中的聚集和構(gòu)象
    Cu2+/Mn2+存在下白花丹素對人血清白蛋白構(gòu)象的影響
    動物型溶菌酶研究新進(jìn)展
    修飾改性β-葡聚糖溶液構(gòu)象研究進(jìn)展
    亚洲精品乱久久久久久| 插逼视频在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久久久国产精品人妻一区二区| 9色porny在线观看| 国产精品三级大全| 插逼视频在线观看| 蜜桃在线观看..| 国产精品一区www在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲国产av影院在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 国产精品人妻久久久久久| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产精品久久久久久av不卡| 女人精品久久久久毛片| 1024视频免费在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 男女午夜视频在线观看 | 国产成人精品福利久久| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 国产成人aa在线观看| a级毛片黄视频| 婷婷色综合www| 国产精品熟女久久久久浪| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲综合精品二区| 久久午夜福利片| 日本av手机在线免费观看| 97在线视频观看| 亚洲国产精品一区三区| 高清av免费在线| 2018国产大陆天天弄谢| 国产一区亚洲一区在线观看| xxx大片免费视频| 亚洲精品乱久久久久久| 五月伊人婷婷丁香| 美女主播在线视频| 在线看a的网站| 亚洲国产日韩一区二区| 国产毛片在线视频| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲精品久久午夜乱码| 日韩av免费高清视频| 中国三级夫妇交换| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲综合色网址| 欧美国产精品一级二级三级| 大片电影免费在线观看免费| 精品久久国产蜜桃| 色哟哟·www| 大片电影免费在线观看免费| 大片电影免费在线观看免费| 一级a做视频免费观看| 精品久久久久久电影网| 亚洲国产精品专区欧美| 看非洲黑人一级黄片| 国产极品天堂在线| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲久久久国产精品| 老女人水多毛片| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久久久久久大尺度免费视频| 黄色 视频免费看| 欧美日韩亚洲高清精品| 如何舔出高潮| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产成人a∨麻豆精品| 日本爱情动作片www.在线观看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 热99国产精品久久久久久7| 中文字幕av电影在线播放| av一本久久久久| 一级a做视频免费观看| 国产精品欧美亚洲77777| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产男人的电影天堂91| 在线 av 中文字幕| 国产精品女同一区二区软件| 国产亚洲最大av| 黑人猛操日本美女一级片| 黑人猛操日本美女一级片| 午夜免费鲁丝| 欧美性感艳星| 久久热在线av| 久久午夜综合久久蜜桃| 色哟哟·www| 有码 亚洲区| 制服人妻中文乱码| 天美传媒精品一区二区| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久午夜综合久久蜜桃| 777米奇影视久久| 一本色道久久久久久精品综合| www.色视频.com| 亚洲国产av影院在线观看| 一区二区av电影网| 少妇人妻 视频| 亚洲av成人精品一二三区| 日韩三级伦理在线观看| 一级毛片 在线播放| 成人国产av品久久久| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产亚洲精品久久久com| 日韩欧美精品免费久久| 精品久久久精品久久久| 精品少妇内射三级| 日日爽夜夜爽网站| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲精品国产av成人精品| 丝袜美足系列| 久久午夜福利片| 国产在视频线精品| 国产精品久久久久成人av| 老司机影院成人| 国产片特级美女逼逼视频| 最后的刺客免费高清国语| 91精品国产国语对白视频| 国产av国产精品国产| 国产成人av激情在线播放| 精品国产国语对白av| 韩国av在线不卡| 婷婷色av中文字幕| 国产精品久久久久久久久免| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 另类精品久久| 免费看av在线观看网站| 免费黄色在线免费观看| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲国产最新在线播放| 久久精品国产综合久久久 | 涩涩av久久男人的天堂| 国产成人精品一,二区| 人妻 亚洲 视频| 欧美人与性动交α欧美软件 | videosex国产| 婷婷色麻豆天堂久久| 黑人高潮一二区| 亚洲成国产人片在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 成人国产av品久久久| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 大话2 男鬼变身卡| 边亲边吃奶的免费视频| 18在线观看网站| 亚洲天堂av无毛| 国产精品偷伦视频观看了| 一区二区三区精品91| 午夜av观看不卡| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲国产av新网站| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产成人免费观看mmmm| 一边亲一边摸免费视频| √禁漫天堂资源中文www| 在线观看国产h片| 国产男女内射视频| 久久久国产一区二区| 午夜激情久久久久久久| 一级a做视频免费观看| 久久久精品94久久精品| 久久精品久久精品一区二区三区| 人人澡人人妻人| 99久久综合免费| 一二三四中文在线观看免费高清| 一级毛片我不卡| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久久久久人妻| 日韩电影二区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 熟女av电影| 捣出白浆h1v1| 日韩一本色道免费dvd| 两性夫妻黄色片 | 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲美女黄色视频免费看| 日韩制服骚丝袜av| 国产男人的电影天堂91| 最近中文字幕高清免费大全6| 黑人欧美特级aaaaaa片| 两个人看的免费小视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| av国产精品久久久久影院| 老司机影院成人| 一本大道久久a久久精品| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲成人一二三区av| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产av码专区亚洲av| 老司机影院毛片| 少妇高潮的动态图| 欧美精品一区二区大全| 欧美日韩视频精品一区| 又大又黄又爽视频免费| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久精品国产综合久久久 | 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产一区二区激情短视频 | 一级片'在线观看视频| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲高清免费不卡视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 又大又黄又爽视频免费| 男女国产视频网站| 男男h啪啪无遮挡| 热99国产精品久久久久久7| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 免费黄网站久久成人精品| 91成人精品电影| 伦精品一区二区三区| 国产精品 国内视频| 日韩伦理黄色片| xxx大片免费视频| 91精品国产国语对白视频| 成年人午夜在线观看视频| 人妻系列 视频| 涩涩av久久男人的天堂| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 91国产中文字幕| 日本色播在线视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 97在线视频观看| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产亚洲精品久久久com| 国产69精品久久久久777片| 精品亚洲成a人片在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 人体艺术视频欧美日本| 这个男人来自地球电影免费观看 | av黄色大香蕉| 国产不卡av网站在线观看| 看十八女毛片水多多多| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲国产av影院在线观看| 青青草视频在线视频观看| 五月天丁香电影| 伊人久久国产一区二区| 免费看光身美女| 久久免费观看电影| 日日撸夜夜添| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久久久精品性色| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产不卡av网站在线观看| 国产精品.久久久| 亚洲精品视频女| 99香蕉大伊视频| av天堂久久9| 国产精品熟女久久久久浪| 国产精品蜜桃在线观看| 国产成人精品在线电影| av福利片在线| 一边亲一边摸免费视频| 免费大片18禁| 在线观看www视频免费| 极品少妇高潮喷水抽搐| 另类亚洲欧美激情| 国产免费福利视频在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 有码 亚洲区| 毛片一级片免费看久久久久| a级毛色黄片| 久久婷婷青草| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久99蜜桃精品久久| 日韩大片免费观看网站| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲精品第二区| 在线观看人妻少妇| 欧美人与善性xxx| 精品福利永久在线观看| 精品一区二区免费观看| 国产高清国产精品国产三级| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 新久久久久国产一级毛片| 九草在线视频观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美人与性动交α欧美软件 | 母亲3免费完整高清在线观看 | 伦精品一区二区三区| av网站免费在线观看视频| 一级毛片 在线播放| 美女内射精品一级片tv| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品久久久av美女十八| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 亚洲国产最新在线播放| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久久精品免费免费高清| 老司机影院毛片| 少妇高潮的动态图| 最新的欧美精品一区二区| 国国产精品蜜臀av免费| 老司机亚洲免费影院| 91成人精品电影| 99国产综合亚洲精品| 欧美bdsm另类| 久久久久人妻精品一区果冻| 成年人午夜在线观看视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 精品国产乱码久久久久久小说| 免费av中文字幕在线| 在线 av 中文字幕| 新久久久久国产一级毛片| 国产成人精品在线电影| 亚洲伊人久久精品综合| xxxhd国产人妻xxx| 性色av一级| 久久久精品免费免费高清| 免费观看av网站的网址| 国产一区二区在线观看日韩| 天堂8中文在线网| 国产69精品久久久久777片| 国产精品不卡视频一区二区| 国产黄色免费在线视频| 日韩制服骚丝袜av| 91在线精品国自产拍蜜月| 韩国av在线不卡| 另类亚洲欧美激情| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲综合色网址| 日韩 亚洲 欧美在线| 另类亚洲欧美激情| 男女下面插进去视频免费观看 | 国产日韩欧美视频二区| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲成国产人片在线观看| 好男人视频免费观看在线| av黄色大香蕉| 99国产综合亚洲精品| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲四区av| 另类亚洲欧美激情| 国产熟女午夜一区二区三区| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久久久久伊人网av| 亚洲精品久久午夜乱码| 18禁动态无遮挡网站| 成人免费观看视频高清| 女人精品久久久久毛片| 一二三四中文在线观看免费高清| 三上悠亚av全集在线观看| 久久久久国产网址| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美 亚洲 国产 日韩一| av线在线观看网站| 国产av精品麻豆| 免费在线观看黄色视频的| 久久99热这里只频精品6学生| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久久久久久久久人人人人人人| 极品人妻少妇av视频| 精品国产国语对白av| 老女人水多毛片| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 99热网站在线观看| 午夜老司机福利剧场| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 熟女电影av网| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 在线 av 中文字幕| 在线观看免费视频网站a站| 哪个播放器可以免费观看大片| 91精品国产国语对白视频| 三上悠亚av全集在线观看| 波野结衣二区三区在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久国内精品自在自线图片| 夜夜爽夜夜爽视频| 一级片免费观看大全| 国产亚洲最大av| 久久精品久久久久久久性| 国产一区二区三区综合在线观看 | 午夜激情av网站| 国产不卡av网站在线观看| 观看av在线不卡| 亚洲国产最新在线播放| 久久这里有精品视频免费| 2022亚洲国产成人精品| 两个人看的免费小视频| 欧美 日韩 精品 国产| 欧美最新免费一区二区三区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产精品久久久久久精品古装| 国产有黄有色有爽视频| 久久久国产一区二区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 免费看光身美女| 一区二区av电影网| 高清欧美精品videossex| 美女中出高潮动态图| 成人手机av| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 高清在线视频一区二区三区| 永久网站在线| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲av综合色区一区| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 免费黄色在线免费观看| 久久久久国产网址| 国产一区亚洲一区在线观看| 一级黄片播放器| 女人久久www免费人成看片| 成人国产av品久久久| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 插逼视频在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美 日韩 精品 国产| 日本黄大片高清| 黑人欧美特级aaaaaa片| 97在线人人人人妻| 交换朋友夫妻互换小说| 两个人看的免费小视频| 高清毛片免费看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 校园人妻丝袜中文字幕| 午夜免费观看性视频| 亚洲国产精品专区欧美| 99热这里只有是精品在线观看| 国产高清不卡午夜福利| av一本久久久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 制服丝袜香蕉在线| 欧美性感艳星| 男女午夜视频在线观看 | 精品少妇内射三级| 免费在线观看完整版高清| 国产麻豆69| 亚洲精品日本国产第一区| 在线精品无人区一区二区三| 大码成人一级视频| 男人舔女人的私密视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 精品久久久精品久久久| 日韩成人伦理影院| 亚洲国产欧美在线一区| 激情视频va一区二区三区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 中文字幕最新亚洲高清| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 免费观看a级毛片全部| 亚洲国产精品999| 最新的欧美精品一区二区| 国产亚洲精品久久久com| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产一级毛片在线| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 婷婷色综合www| 久久精品国产亚洲av涩爱| av又黄又爽大尺度在线免费看| 啦啦啦啦在线视频资源| 中文字幕人妻丝袜制服| 校园人妻丝袜中文字幕| 热99久久久久精品小说推荐| 日韩大片免费观看网站| 国产精品久久久久久久久免| 男的添女的下面高潮视频| 国产精品久久久久久av不卡| 午夜免费男女啪啪视频观看| 成人国语在线视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 丝袜喷水一区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 一区二区三区乱码不卡18| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲综合色网址| 内地一区二区视频在线| 国产精品无大码| 性色av一级| 久久久久久久久久久久大奶| 国产免费一区二区三区四区乱码| 99re6热这里在线精品视频| 国产亚洲欧美精品永久| 99久久人妻综合| 视频区图区小说| 性色av一级| 国产女主播在线喷水免费视频网站| av电影中文网址| 在线精品无人区一区二区三| av一本久久久久| 国产又爽黄色视频| 极品人妻少妇av视频| 丝袜在线中文字幕| freevideosex欧美| av不卡在线播放| 90打野战视频偷拍视频| 欧美性感艳星| 亚洲丝袜综合中文字幕| 少妇人妻久久综合中文| 飞空精品影院首页| 一级片免费观看大全| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品.久久久| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 日本欧美视频一区| 七月丁香在线播放| 美女视频免费永久观看网站| 久久免费观看电影| 久久国内精品自在自线图片| 国产成人精品福利久久| 亚洲色图综合在线观看| www.av在线官网国产| 国产成人免费无遮挡视频| 成人免费观看视频高清| 热re99久久国产66热| 老司机影院毛片| 美国免费a级毛片| 全区人妻精品视频| 久久国内精品自在自线图片| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产成人免费无遮挡视频| 捣出白浆h1v1| 亚洲情色 制服丝袜| 18禁国产床啪视频网站| 欧美国产精品一级二级三级| 夜夜爽夜夜爽视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲图色成人| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产熟女欧美一区二区| 嫩草影院入口| 色94色欧美一区二区| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产伦理片在线播放av一区| 激情五月婷婷亚洲| 午夜视频国产福利| 国国产精品蜜臀av免费| 免费人成在线观看视频色| 亚洲av.av天堂| 极品少妇高潮喷水抽搐| 少妇人妻久久综合中文| 丝瓜视频免费看黄片| 国产熟女午夜一区二区三区| 999精品在线视频| 中文欧美无线码| 国产精品一二三区在线看| 18在线观看网站| 少妇人妻精品综合一区二区| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品一区www在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲精品日本国产第一区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 精品国产国语对白av| 久久女婷五月综合色啪小说| 美女福利国产在线| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲 欧美一区二区三区| 99re6热这里在线精品视频| 国产成人av激情在线播放| 欧美+日韩+精品| 欧美性感艳星| 中国美白少妇内射xxxbb| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 蜜桃在线观看..| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 18+在线观看网站| 久久影院123| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 欧美激情 高清一区二区三区| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 另类精品久久| 亚洲国产精品专区欧美| 午夜免费观看性视频| 两个人看的免费小视频| 90打野战视频偷拍视频| 一本大道久久a久久精品| 国产成人精品无人区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲成人一二三区av| 久久精品国产自在天天线| 九九爱精品视频在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产深夜福利视频在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久久国产一区二区| h视频一区二区三区| 久久影院123| 精品酒店卫生间| 亚洲av免费高清在线观看| 国产极品天堂在线| 男人舔女人的私密视频| 在线观看三级黄色| 亚洲,欧美,日韩| 咕卡用的链子| 日韩av在线免费看完整版不卡|