單增李斯特菌食品分離株LM201的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析

張 娜， 歐 婭， 鄭金水， 劉 梅,,3*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)實驗室，湖北 武漢 430070； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，湖北 武漢 430070; 3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430070)

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenges,Lm)是導(dǎo)致人獸共患病—李斯特菌病(listeriosis)的食源性病原菌。Lm的易感者為免疫缺陷和免疫力低下者，其侵入人和動物機體導(dǎo)致胃腸炎、腦膜炎、腦炎、敗血癥、流產(chǎn)和死胎等病癥。李斯特菌病雖發(fā)病率不高，但病死亡率可達20%～30%[1]。近幾年，我國不斷有人和動物感染李斯特菌病的報道[2]，而且報告病例涉及我國大部分省市，嚴重威脅著人們的健康和畜牧業(yè)發(fā)展。因此，對Lm毒力調(diào)控方面的研究工作不容忽視。Lm于外界環(huán)境中時是腐生菌，侵入宿主機體內(nèi)則變?yōu)橹虏【?，其轉(zhuǎn)變機制主要是Lm中有一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子—PrfA，它像一個開關(guān)，當(dāng)Lm處于外界環(huán)境時，PrfA處于低活性狀態(tài)，受其調(diào)控的相關(guān)毒力基因表達水平低；當(dāng)Lm侵入宿主細胞后，PrfA被激活，進而誘導(dǎo)InlA、InlB、LLO、PlcA、PlcB、Hpt和ActA等毒力因子基因的表達，使得Lm能在宿主細胞中繁殖及在細胞間傳播[3]。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子活性的激活，需要細菌首先感應(yīng)環(huán)境變化，然后將信號傳遞至菌體內(nèi)，從而做出相應(yīng)的調(diào)控反應(yīng)，這個過程涉及到細菌的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，其中雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(Two-component signal transduction systems，TCSs)在細菌的信號傳導(dǎo)過程中起至關(guān)重要的作用[4]。TCSs參與調(diào)控細菌的生長代謝、生物被膜形成以及病原菌的毒力等。因此，研究Lm的TCSs是探究Lm致病機制的重要方面[5]。TCSs通過調(diào)控蛋白質(zhì)磷酸化來實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。典型的TCS由組氨酸蛋白激酶(Histidine kinase，HK)和應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(Response regulator，RR)組成，HK和RR通常是由基因組上同一個操縱子的兩個鄰近基因編碼。其經(jīng)典調(diào)控機制為HK感受胞外信號并自體磷酸化、HK將磷酸基團轉(zhuǎn)移給RR使之活化、活化的RR結(jié)合到靶序列從而調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達。研究發(fā)現(xiàn)，細菌TCSs中的HK除能激活同源RR外，還能激活非同源RR，或兩個不同的HK可以激活同一RR，即形成one-to-many 或 many-to-one的交叉調(diào)控模式，這有利于菌體更快更好地適應(yīng)外界環(huán)境[6]。Lm的TCSs的交叉調(diào)控模式是怎樣的呢？目前關(guān)于Lm的TCSs研究主要針對單對TCS、單個HK或RR的研究，關(guān)于Lm的TCSs交叉調(diào)控方面的系統(tǒng)化研究則鮮有報道。研究TCSs的交叉調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，首先需要全面統(tǒng)計分析和了解目標(biāo)菌株所含有的TCSs的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能。本研究以本實驗室已完成全基因組測序的Lm食品分離株LM201[7]為研究對象，應(yīng)用生物信息學(xué)方法，對LM201的TCSs進行了數(shù)量統(tǒng)計、結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測，從而為進行Lm的TCSs交叉調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

基因組序列：Lm菌株LM201是從冷凍肉中分離得到，經(jīng)本課題組測定，其血清型為4b，有中等生物被膜形成能力，小鼠LD50為6.3×106CFU。本課題組已完成LM201全基因組測序工作，其序列(AYPT00000000)[7]已提交至NCBI。L.innocuaClip11262 (NC_003212.1)、L.ivanoviisubsp.ivanoviiPAM 55(FR687253.1)、Bacillussubtilis168 (NZ_CP010052.1)和L.monocytogenesEGD-e (AL591824.1)的全基因組序列均來自GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)。

1.2 方法

1.2.1 雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的預(yù)測 利用Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)中HKs的保守結(jié)構(gòu)域HATPase_c(Pfam02518)搜尋LM201的HKs，用RRs的保守結(jié)構(gòu)域 Response_reg (Pfam00072)搜尋RRs，通過NCBI的BLAST確認搜到的HKs和RRs。HATPase_c是HK的催化結(jié)構(gòu)域，是ATP結(jié)合的激酶功能區(qū)，位于 HK 的 C-末端；Response_reg是RR的磷酸受體結(jié)構(gòu)域，位于 RR 的 N-末端，屬于REC超家族的成員。

1.2.2 結(jié)構(gòu)與功能分析 功能域分析利用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)來完成。蛋白質(zhì)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域用TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services /TMHMM-2.0/)進行預(yù)測。利用ClustalW軟件進行多重序列比對。采用BLASTP (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)進行同源性比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 LM201的TCSs統(tǒng)計及序列比對分析

利用Pfam數(shù)據(jù)庫對LM201基因組的TCSs進行了搜尋和統(tǒng)計。從數(shù)量上講， LM201有14對HK/RR和2個孤兒RR，與同種同血清型的L.monocytogenesF2365 (4b型)數(shù)量一致；比同種不同血清型的L.monocytogenesEGD-e (1/2a型)少一對雙組分(lmo1061/lmo1060)；與同屬不同種的L.ivanovii和L.innocua的TCSs數(shù)量相近；與同目不同屬的Bacillussubtilis數(shù)量則相距甚遠(表1)。

通過序列比對分析發(fā)現(xiàn)，LM201的TCSs與同種同血清型菌株F2365的TCSs的組成和結(jié)構(gòu)一致；與同種不同血清型菌株EGD-e的TCSs有一一對應(yīng)關(guān)系(結(jié)果圖略)。

表1 LM201基因組中TCS數(shù)目的預(yù)測結(jié)果

注：*作為對照

2.2 HK的結(jié)構(gòu)域組成

利用SMART對預(yù)測的14個HKs進行了結(jié)構(gòu)域的分析(表2)。LM201的HKs具有11種不同組成結(jié)構(gòu)，所有HK的C端均具有典型結(jié)構(gòu)域HATPase_c (激酶催化結(jié)構(gòu)域)；N端具有不同結(jié)構(gòu)域，包括HAMP、PAS、PAC和GAF等。HAMP主要存在于熱休克蛋白HSP90、甲基轉(zhuǎn)移酶等與ATP結(jié)合的蛋白質(zhì)中，其主要功能可能是感應(yīng)與細菌細胞滲透相關(guān)的信號[8]；PAS (Per-Arnt-SIM)含有與血紅素蛋白和光敏黃蛋白結(jié)合的固定區(qū)域，可感應(yīng)氧化還原電位、光及氧等信號，參與調(diào)控細菌氧化還原反應(yīng)[9]；PAC 可以修飾PAS，可能有助于PAS的折疊[10]；GAF存在于光合細菌及非光合細菌中，主要通過與核苷酸及其他小分子配體結(jié)合，改變配體構(gòu)象而發(fā)揮催化調(diào)節(jié)活性功能[11]。

HK02 (RS05925)的N端為HPT結(jié)構(gòu)域，中部有H-Kinase dim區(qū)域，C端是CheW受體結(jié)構(gòu)域。HPT (Histidine phosphotransfer)只存在于真細菌中，其所含有的組氨酸殘基參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，介導(dǎo)HK和RR的信號傳遞[12]；H-Kinase dim是含有該結(jié)構(gòu)域的組氨酸激酶CheA形成二聚體的區(qū)域[13]；CheW受體結(jié)構(gòu)域存在于參與細菌趨化性調(diào)控的TCS中，含有該結(jié)構(gòu)域的組氨酸激酶CheA可以和連接蛋白CheW偶聯(lián)，CheW參與細菌的趨化性信號傳導(dǎo)[14]。

表2 LM201的HKs的編號、基因組上的位置和結(jié)構(gòu)域組成

續(xù)表2

本研究通過TMHMM Server v.2.0對LM201中的HKs進行了跨膜結(jié)構(gòu)分析(結(jié)果圖略)。除HK11(RS11285)外，其余HKs的分析結(jié)果與表2第三欄所示的跨膜螺旋區(qū)(Transmembrane helix region，藍色矩形所示)結(jié)構(gòu)一致。TMHMM Server v.2.0分析結(jié)果顯示，HK11有兩個跨膜螺旋區(qū)，但用SMART預(yù)測時，只顯示了一個跨膜螺旋區(qū)(表2)，原因是另一個跨膜區(qū)與低復(fù)雜性結(jié)構(gòu)域(Low compositional complexity，粉紅色矩形所示)重疊了。

2.3 RR的結(jié)構(gòu)域組成與分類

RR的結(jié)構(gòu)域組成與分類利用SMART，本研究對預(yù)測的16個RRs的組成結(jié)構(gòu)和亞家族的歸屬進行了分析(表3)。LM201的 RRs的N端都含有基本結(jié)構(gòu)-磷酸受體結(jié)構(gòu)域REC(RR15 (RS05910)的REC在C端)，此結(jié)構(gòu)域中含有保守的Asp (天冬氨酸殘基)磷酸化位點，即RR的磷酸化位點；RRs的C端為輸出區(qū)域，具有多樣性，但多數(shù)RR的輸出區(qū)域為典型結(jié)構(gòu)Trans reg_C。通過分析RRs的輸出區(qū)域，發(fā)現(xiàn)LM201的16個RRs分屬于OmpR、CheV、CheY、NarL、LytTR、YesN和AmiR_NasR這7個亞家族(表3)。

表3 LM201的RRs的編號、基因組上的位置、結(jié)構(gòu)域組成和亞家族分類

續(xù)表3

其中RR01 (RS03875)、RR03 (RS01445)、RR04 (RS01850)、RR05 (RS02250)、RR06 (RS13770)、RR09 (RS09240)、RR10 (RS09890)、RR11 (RS11290)和RR13 (RS10265)這9個RRs的輸出區(qū)域為Trans reg_C，具有典型的翼狀螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋 (HTH) 結(jié)構(gòu)，屬OmpR亞家族，占LM201總RRs的56%。OmpR亞家族是目前已知數(shù)目最多的一類應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白[15]。RR08 (RS07570)和RR16 (RS01920)輸出區(qū)域為HTH-LuxR，屬NarL亞家族，是DNA結(jié)合區(qū)域，通常發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用[16]。RR07 (RS14980)輸出區(qū)域為LytTR，是一種新型的保守DNA結(jié)合域，屬于AlgR/AgrA/LytR轉(zhuǎn)錄調(diào)控亞家族，此類結(jié)構(gòu)域在GC含量較少的革蘭陰性菌中常見，參與細胞的自溶調(diào)控[17]。RR12 (RS08195)輸出區(qū)域為ANTAR，屬AmiR_NasR亞家族，目前發(fā)現(xiàn)只在細菌中有ANTAR，其是RNA結(jié)合域，通過接受磷酸基團發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抗終止作用[18]。RR14 (RS11565)輸出區(qū)域為HTH-ARAC，屬YesN亞家族，HTH為螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，是大多數(shù)細菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白結(jié)合DNA的模體，AraC是阿拉伯糖操縱子編碼的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，是含有HTH結(jié)構(gòu)比較多的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，其包含的兩個HTH結(jié)構(gòu)形成凹槽以結(jié)合同源的DNA[19]。RR15 (RS05910)輸出區(qū)域為CheW，位于N端，能與CheA發(fā)生偶聯(lián)，屬于CheV亞家族，主要影響趨化性調(diào)控的穩(wěn)定性[20]。

由表3可知，LM201中除RR02 (RS05920，屬CheY亞家族)無輸出區(qū)域外，其他的RRs都有C端輸出區(qū)域。C端輸出區(qū)域通常與靶DNA或靶蛋白結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能。當(dāng)RR缺乏輸出區(qū)域時，其通過其他方式發(fā)揮作用，例如，在大腸埃希菌中，與LM201的 RR02同類的RR蛋白CheY被磷酸化后，雖然CheY沒有C端輸出區(qū)域，但其直接結(jié)合到被調(diào)控蛋白—鞭毛運動調(diào)控蛋白FliM或者FliN上，使后者構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變細菌鞭毛的運動方向[21]。

2.4 功能預(yù)測

功能預(yù)測主要根據(jù)氨基酸序列一致性(identity)和蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測。以上HK和RR的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果為進行TCS的功能預(yù)測打下了基礎(chǔ)。利用BLASTP和參考相關(guān)文獻對搜尋到的TCSs進行了功能預(yù)測，結(jié)果見表4。比對結(jié)果選取一致性最高且功能驗證過的TCSs的功能作為參考。

LM201中有14對HK/RR和2個孤兒RR。其中，RS03880/RS03875、RS02245/RS02250和RS09895/RS09890編碼的3對TCSs以及RS05910編碼的孤兒RR的預(yù)測功能在Lm中未見報道，但在其他菌中有報道(表4**)；RS11570/RS11565編碼的TCS的功能為未知，在Lm和其他菌中均未見報道(表4***)；剩余的10對TCSs和一個孤兒RR (RS01920)的預(yù)測功能在Lm中已報道(表4*)。

Lm中已報道的TCSs的功能主要涉及毒力(VirSR，DegU)、抗生素抗性(CesKR，AgrAC)、細胞壁滲透壓(KdpDE，LiaSR)、氧化還原(ResDE)、趨化性(CheAY)和磷酸酶合成(PhoPR)等。

YycGF、HssSR、YclKJ和CheV的功能在Lm中未見報道，但在其他菌中已有報道，如：YycGF在枯草芽胞桿菌中調(diào)控細胞壁的合成[22]；HssSR在金黃色葡萄球菌中調(diào)控胞內(nèi)血紅素平衡和毒力，將該雙組分的RR缺失后，金黃色葡萄球菌對抗菌肽—菌絲霉素的抗性增強，而Lm的親本野生株與其HssSR的RR缺失突變株對該抗菌肽均不敏感[23]，可見，同類TCS在不同細菌中可能有不同的調(diào)控作用；YclKJ在枯草芽胞桿菌中調(diào)控厭氧生長[24]；CheV在枯草芽胞桿菌中調(diào)控趨化性[25]，與在Lm中已報道的CheAY位于同一個操縱子上，因此，推測CheV在Lm中也可能參與趨化性調(diào)控。YycGF、HssSR、YclKJ和CheV在Lm中的功能有待研究。

表4顯示，RS11570/RS11565編碼的雙組分的預(yù)測功能為未知，在Lm和其他菌中均未見報道。我們發(fā)現(xiàn)，RS11570編碼的HK在C端229～1734處存在一個YesM保守結(jié)構(gòu)域，RS11565基因編碼的RR含有一個YesN保守結(jié)構(gòu)域，對該雙組分進行一致性分析發(fā)現(xiàn)，其與枯草芽胞桿菌的YesM/YesN的一致性最高，分別為27%和40%，但其功能在枯草芽胞桿菌中未見報道。所以RS11570/RS11565編碼的雙組分在Lm中的功能有待探索。

表4 LM201的TCS一致性比較和功能預(yù)測

注：Bs：枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)；Lm：單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)；Sa：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；*：Lm中功能已被報道的雙組分；**：Lm中功能未見報道的雙組分，但該雙組分功能在其他菌中有報道；***：功能未知的雙組分

3 討 論

細菌耐藥性問題一直困擾著人們。細菌有TCSs，哺乳動物沒有TCSs，故以TCSs為靶標(biāo)研發(fā)新型抗菌藥物是解決細菌耐藥問題的有效辦法之一。探索Lm的TCSs的交叉調(diào)控模式能為該應(yīng)用前景提供理論依據(jù)。本研究通過生物信息學(xué)方法探明了Lm菌株LM201中TCSs的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、分類和預(yù)測功能，該結(jié)果為構(gòu)建Lm的TCSs的交叉調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供參考。

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