雞卵類黏蛋白過敏原性的在體與離體實驗

王麗娟，吳子健，劉 露，陳一華，裴高鑫，王 勇

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134）

雞蛋具有豐富的營養(yǎng)價值，是最物美價廉的食物之一，也是嬰幼兒早期主要的膳食蛋白來源，還是許多加工食品的主要組成成分。然而，雞蛋也是易引起過敏的常見食物之一[1-2]。從雞蛋的營養(yǎng)價值和食品安全的角度考慮，開發(fā)低致敏性或無致敏性的蛋類食品十分必要。動物實驗是評價食品潛在致敏性最直接的方法[3]。因此，建立可靠的過敏動物模型是檢測食品過敏原的重要環(huán)節(jié)。卵類黏蛋白是雞蛋過敏反應(yīng)中致敏性最強、最普遍的蛋白質(zhì)[1,4-5]，而研究卵類黏蛋白在體致敏性的動物模型鮮見明確報道。本實驗選擇豚鼠為研究對象，以卵白蛋白為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）為陰性對照[6]，通過比較卵類黏蛋白與卵白蛋白的全身過敏反應(yīng)和對致敏豚鼠離體腸平滑肌收縮反應(yīng)（Schultz-Dale反應(yīng)）的影響，建立卵類黏蛋白過敏實驗的整體實驗和離體器官實驗的動物模型，為深入研究卵類黏蛋白過敏及進一步開發(fā)與評價低敏或無致敏性蛋類食品中過敏原的消減效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

英國種Hartly豚鼠（白色），2～3 月齡，體質(zhì)量250～320 g，雌雄兼用，清潔級，由天津市實驗動物中心提供；合格證號：SCXK津2010-0002。雌雄分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，室溫（20～25 ℃），光線充足。

卵類黏蛋白（純度＞94%） 天津市食品生物技術(shù)重點實驗室；卵白蛋白（純度≥90%，Ⅱ型）美國Sigma公司；羊抗兔免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）杭州華安生物技術(shù)有限公司；丙酮（分析純） 天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司；馬來酸氯苯那敏（撲爾敏，批號140103） 黑龍江百泰藥業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BL-420F生物信號采集系統(tǒng)、HW-1000超級恒溫水浴成都泰盟軟件有限公司；Spectra Max 190光吸收酶標(biāo)儀美國美谷分子儀器有限公司；2000ES全自動四元梯度高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配套UV1000紫外檢測儀） 美國SSI/Alltech公司；TDZ4-WS臺式低速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 卵類黏蛋白的制備

采用三氯乙酸丙酮工藝提取卵類黏蛋白[7]。在規(guī)定的實驗條件下，手工分離蛋清和蛋黃，將蛋清進行預(yù)處理降低黏度。向蛋清中加入等體積的體積分?jǐn)?shù)10%三氯醋酸溶液并混合均勻，調(diào)節(jié)pH 4.0，4 ℃靜置4 h。4 ℃、4 000 r/min離心15 min后取上清液加入3 倍體積預(yù)冷丙酮，在冰浴里放置至少4 h。再次離心后取上清液用水稀釋，調(diào)節(jié)至pH 4.0，加入3 倍體積預(yù)冷丙酮，冰浴中靜置4 h以上。4 ℃、4 000 r/min離心15 min后將上清液透析凍干即得卵類黏蛋白，經(jīng)HPLC檢測，純度≥94%。

1.3.2 過敏性休克動物模型的建立

實驗前期，豚鼠在實驗室適應(yīng)1 周，將30 只健康合格豚鼠按體質(zhì)量隨機分為5 組，每組6 只，雌雄各半。各組的致敏與激發(fā)物質(zhì)分別為PBS、1 mg/mL卵白蛋白、1、2、4 mg/mL卵類黏蛋白。致敏方法為腹腔注射，每只注射1.0 mL，隔日1 次，共3 次，于末次腹腔注射后第10天進行激發(fā)。激發(fā)時豚鼠行靜脈注射，2.0 mL/只，非一次注射成功者舍棄[6,8]。激發(fā)后立即觀察并記錄60 min內(nèi)豚鼠的反應(yīng)[9]，觀察指標(biāo)及過敏反應(yīng)評定方法[6,8]見表1。

表1 豚鼠過敏反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)Table1 Criteria for systemic allergic reaction assessment in guinea pig

1.3.3 致敏豚鼠離體回腸平滑肌過敏原攻擊實驗

將25 只豚鼠按體質(zhì)量隨機分為5 組，每組5 只。分組情況及致敏方法同1.3.2節(jié)。末次注射后第14天進行腸平滑肌過敏原攻擊實驗（Schultz-Dale反應(yīng)）。取致敏豚鼠，放血處死，取出回腸一段，按離體器官裝置進行安裝并描記，浴管內(nèi)均加入25 mL臺氏液，并保持恒溫、供氧。待腸平滑肌收縮活動平穩(wěn)后，用相應(yīng)過敏原攻擊，觀察并記錄攻擊前后的腸收縮曲線。比較各組腸收縮力的變化，根據(jù)下式計算腸收縮變化率[9]。

式中：F0為攻擊前的腸平滑肌收縮力/g；F1為攻擊后的腸平滑肌收縮力/g。

1.3.4 撲爾敏對卵類黏蛋白致敏作用的影響

0.16 μg/mL撲爾敏對組胺即有明顯的阻斷作用[6]。豚鼠致敏方法同1.3.2節(jié)。于末次致敏后第14天進行Schultz-Dale反應(yīng)檢測，離體腸段處置方法同1.3.3節(jié)。待腸平滑肌收縮活動平穩(wěn)后，首先給予0.16 μg/mL撲爾敏，觀察腸段的變化，待腸收縮穩(wěn)定后再加入相應(yīng)的過敏原進行攻擊，通過比較給予撲爾敏前后腸收縮力的變化，分析腸平滑肌的過敏反應(yīng)與組胺釋放的關(guān)系。

1.3.5 間接ELISA法測定血清抗體效價

豚鼠致敏方法同1.3.2節(jié)。末次致敏第14天，自頸總動脈放血至離心管中，靜置10 min后3 000 r/min離心5 min得到血清，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

按間接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-l i n ke d immunosorbent assay，ELISA）步驟操作[10]。經(jīng)測試，包被抗原的最佳工作質(zhì)量濃度為20 μg/mL，酶標(biāo)抗抗體（二抗）選擇羊抗兔IgG-HRP，底物選擇鄰苯二胺。終止反應(yīng)后立即用酶標(biāo)儀測定，在492 nm波長處測定不同稀釋倍數(shù)待測卵類黏蛋白致敏豚鼠血清的OD值，每個樣品平行測3 次，取平均值。以陽性O(shè)D值為陰性對照2 倍時血清的稀釋倍數(shù)為抗體效價。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 卵類黏蛋白的過敏性休克反應(yīng)

根據(jù)激發(fā)后豚鼠的反應(yīng)，按表1中的評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分，各組的評分結(jié)果見表2。

表2 豚鼠過敏反應(yīng)結(jié)果Table2 Evaluation of systemic allergic reactions in guinea pig

由表2可以看出，PBS溶液（陰性對照）組的過敏率為0，1 mg/mL卵白蛋白（陽性對照）組豚鼠100%出現(xiàn)了過敏反應(yīng)，并因過敏性休克而死亡，表現(xiàn)過敏反應(yīng)極強陽性，評分達(dá)4分。1～4 mg/mL卵類黏蛋白各組豚鼠也出現(xiàn)明顯的過敏反應(yīng)，其反應(yīng)強度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，即隨致敏和激發(fā)劑量增加，過敏反應(yīng)程度加強。4 mg/mL卵類黏蛋白與1 mg/mL卵白蛋白的致敏性相近（P＞0.05）。

2.2 Schultz-Dale反應(yīng)

于末次致敏第14天進行過敏原攻擊實驗，攻擊時均加入相應(yīng)過敏原0.2 mL，結(jié)果見表3。

表3 卵類黏蛋白對豚鼠離體腸平滑肌的作用Table3 Effects of ovomucoid on the isolated ileum smooth muscle from the guinea pig

剪輯各組腸收縮曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 致敏腸平滑肌在過敏原攻擊前后的收縮曲線Fig.1 Contraction curves of isolated ileum smooth muscle before and after allergic attack

由圖1可知，PBS組在攻擊后無明顯反應(yīng)（且存在run-down現(xiàn)象），1 mg/mL卵白蛋白組攻擊后的腸平滑肌收縮幅度較攻擊前明顯加大（P＜0.01）；1～4 mg/mL卵類黏蛋白各組受攻擊后的腸平滑肌收縮力較攻擊前也明顯加強（P＜0.01），與1 mg/mL卵白蛋白組的反應(yīng)相近（P＞0.05），表明卵類黏蛋白具有強致敏性。不同質(zhì)量濃度卵類黏蛋白組間比較，2 mg/mL卵類黏蛋白對致敏腸平滑肌的攻擊作用強于1 mg/mL卵類黏蛋白組，而4 mg/mL卵類黏蛋白的攻擊作用有所減弱，這可能是隨卵類黏蛋白過敏原致敏劑量加大，致敏性增強，使其在致敏強化期間就有部分過敏活性物質(zhì)釋放，引起腸平滑肌的基礎(chǔ)張力增高，致使在過敏原攻擊后的收縮力增強幅度減小（表3、圖1）。

2.3 卵類黏蛋白致敏豚鼠血清抗體效價

用20 μg/mL包被抗原包被酶標(biāo)板，加入不同稀釋度的各待測血清，酶標(biāo)儀測定OD492nm，計算抗體效價，結(jié)果致敏劑量為1、2 mg/mL和4 mg/mL的卵類黏蛋白各組豚鼠，其血清IgG效價分別為64、96和192，其致敏豚鼠血清的抗體效價水平與其過敏的臨床表現(xiàn)趨勢相一致，具有劑量依賴關(guān)系。

2.4 卵類黏蛋白致敏類型的初步分析

表4 撲爾敏對卵類黏蛋白過敏原致敏作用的影響Table4 Blocking effect of chlorphenamine on the sensitization efficiency of ovomucoid

在Schultz-Dale反應(yīng)實驗中，預(yù)先給予撲爾敏，則卵類黏蛋白的攻擊作用明顯被拮抗，結(jié)果見表4和圖1F。攻擊前、后腸平滑肌收縮力差異不顯著（P＞0.05），2 mg/mL卵類黏蛋白與4 mg/mL卵類黏蛋白組差異也不顯著（P＞0.05）。提示組胺的釋放在卵類黏蛋白致敏過程中起重要作用，卵類黏蛋白引起的過敏反應(yīng)極大可能是由IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)。

3 討 論

過敏癥是在全世界廣泛流行的一類常見的變態(tài)反應(yīng)性疾病。由于其種類繁多，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，危害廣泛且難以根治，成為長期以來醫(yī)學(xué)界的一大難題[11]。食物過敏是常見的食物不良反應(yīng)之一，多數(shù)食物過敏為由IgE介導(dǎo)的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。

食物過敏的實驗研究方法分整體動物體內(nèi)實驗、哺乳動物離體器官實驗和體外檢測過敏原實驗。體外檢測不能反映食物進入體內(nèi)的過敏反應(yīng)進程，具有很大的局限性，而人體實驗又存在安全與倫理方面的問題。因此，哺乳動物體內(nèi)實驗與離體器官實驗是評價食品安全性的主要研究手段。食物過敏動物模型則是評價新型食物或蛋白潛在致敏性主要的也是最直接的研究方法[12-13]，可直接、準(zhǔn)確地反映食物中過敏原的存在與否。然而，研究食物過敏的動物模型還不夠成熟，也不穩(wěn)定，不同動物對食物中過敏原的過敏反應(yīng)存在量與質(zhì)的差異。目前，常用于食物過敏模型研究的動物主要有小鼠（ICR小鼠[14]、BALB/c小鼠[15-17]、C3H/HeJ小鼠[18]等）、大鼠（BN大鼠[19-21]）、豚鼠[5,22]、幼豬[23]、狗[24]等。各種動物對不同過敏原的反應(yīng)性有所差異，其反應(yīng)與過敏原的性質(zhì)、純度等因素有關(guān)[25]。豚鼠血清中含有豐富的補體，易于致敏，與其他動物相比，具有與人類相似的過敏原識別機制，更適于進行過敏性實驗研究[26-27]。

雞蛋是引發(fā)食物過敏最常見的食物之一。雞蛋中有4 種主要過敏原（卵類黏蛋白、卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶），其中卵類黏蛋白是雞蛋過敏反應(yīng)中致敏性最強、最普遍的蛋白質(zhì)之一[4,25]。雞蛋中的4 種主要過敏原中，卵白蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)等已研究的較為透徹，并容易獲得。因此，在很多研究中，已將其作為建立食物過敏動物模型中的對照品[28-29]。目前，關(guān)于卵類黏蛋白過敏實驗動物模型的研究尚鮮見明確的報道。

本研究結(jié)果顯示，1 mg/mL卵清白蛋白即可使豚鼠100%致敏并出現(xiàn)過敏性休克死亡，與文獻[6,27-28]報道相符。卵類黏蛋白引起的過敏性休克反應(yīng)與卵清白蛋白相似，且不同劑量卵類黏蛋白的過敏反應(yīng)呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。即增加過敏原的接觸劑量，過敏反應(yīng)陽性率增加，過敏反應(yīng)程度加重；降低劑量到一定水平，陽性率也大大降低，與藥物過敏反應(yīng)的發(fā)生比較一致，確證了過敏反應(yīng)與卵類黏蛋白間的因果關(guān)系。Schultz-Dale反應(yīng)是觀察和評價Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)常用的方法。致敏動物的腸平滑肌在抗原攻擊時釋放過敏介質(zhì)，使平滑肌收縮。通過比較過敏原攻擊前后的腸平滑肌收縮力，分析過敏原的致敏性。卵類黏蛋白與卵白蛋白的Schultz-Dale反應(yīng)結(jié)果與全身過敏反應(yīng)趨勢相似。組胺是一種自體活性物質(zhì)，在暴露的抗原反應(yīng)中，組胺釋放后進入組織[30]，然后與外周組胺H1受體結(jié)合，引起呼吸道和胃腸道中速發(fā)濃度依賴的平滑肌收縮[11]。撲爾敏為組胺H1受體拮抗劑，能對抗由組胺引起的上述反應(yīng)。本研究結(jié)果提示卵類黏蛋白引起的過敏反應(yīng)可能為Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)。間接ELISA法測定卵類黏蛋白致敏豚鼠血清抗體的效價水平與在體、離體器官實驗結(jié)果相一致。

綜上，選擇豚鼠為觀察對象，以卵白蛋白為對照建立的卵類黏蛋白過敏實驗動物模型是可靠的，結(jié)合間接ELISA法檢測血清抗體水平，結(jié)果將更加可靠。

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