烏賊墨汁黑色素對(duì)糖尿病腎病小鼠腎臟的保護(hù)作用

董 慧，徐洋洋，王春琳,2，宋微微,2,*，母昌考,2，李榮華,2

（1.寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211；2.寧波大學(xué) 浙江海洋高效健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 寧波 315211）

糖尿病腎病作為糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎衰竭常見(jiàn)病因[1-2]。糖尿病腎病發(fā)病早期出現(xiàn)微量蛋白尿，不及時(shí)治療會(huì)發(fā)展到臨床蛋白尿期，表現(xiàn)為腎小球肥大、濾過(guò)能力減弱，出現(xiàn)蛋白尿，最終導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的腎衰竭，快速進(jìn)入尿毒癥期[3-4]。目前，對(duì)糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制未能完全明確，已知的主要是通過(guò)多元醇通路、氧化應(yīng)激的加速、血管活性物質(zhì)及促進(jìn)腎組織纖維化的細(xì)胞因子（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor β，TGF-β）和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connection tissue growth factor，CTGF））的激活、長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)發(fā)生非酶途徑產(chǎn)生過(guò)量的晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）、蛋白酶C的激活、激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)作用等途徑，它們之間的相互作用也會(huì)加速糖尿病腎病的產(chǎn)生[5]?，F(xiàn)行的治療策略主要是飲食療法和藥物療法，飲食療法見(jiàn)效慢，具有限制性；藥物干預(yù)法中，西藥雖見(jiàn)效快，但容易造成低血糖、乳酸中毒等副作用，中藥制劑雖然副作用小但服用量較大，較難為患者接受[6]。因此，開(kāi)發(fā)有效治療糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的安全有效藥物成為炙手可熱的研究。海洋作為一個(gè)開(kāi)放復(fù)雜的系統(tǒng)，孕育著豐富的動(dòng)植物和微生物，它們的成分與陸地生物不同，富含化學(xué)結(jié)構(gòu)特異的高效活性物質(zhì)。目前，從海洋生物如刺參中提取的巖藻聚糖硫酸酯[7]和文蛤中的極性提取物均能夠調(diào)控糖尿病小鼠的高血糖癥狀[8]，另外還有研究表明，從多管藻中提取的總酚[9]和海參蟲(chóng)草復(fù)劑等海洋活性物質(zhì)都能夠通過(guò)修復(fù)糖尿病模型小鼠胰島β細(xì)胞損傷和降低氧化酶活性的途徑，控制糖尿病小鼠空腹血糖濃度[10]。因此，有效開(kāi)發(fā)海洋生物活性物質(zhì)，成為了當(dāng)今的熱潮。

烏賊墨汁是由直徑為120～180 nm的黑色素顆粒形成的黑色懸濁液，在烏賊加工過(guò)程中一直被視為廢棄物，中醫(yī)中把它作為一種止血?jiǎng)┦褂茫s為烏賊總體質(zhì)量的1.28%，其主要成分為黑色素，是開(kāi)發(fā)保健黑色素產(chǎn)品的價(jià)廉質(zhì)高的原料[11]。烏賊墨汁黑色素（melanin extracted from cuttlefish ink sacs，MECIS）屬于真黑色素，它是由吲哚單體5,6-二羥基吲哚和5,6-二羥基吲哚-2羧酸組成[12-13]，在長(zhǎng)期高糖環(huán)境下容易失去2 個(gè)電子而發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從某些途徑有效地拮抗高糖并發(fā)癥的侵害[14]。在對(duì)頭足類黑色素資源開(kāi)發(fā)過(guò)程中，已陸續(xù)證明黑色素可參與許多生理、病理活動(dòng)[15]，如抗炎[16]、抗腫瘤、抗紫外輻射[17]、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、清除自由基[18]、增強(qiáng)免疫功能[19-20]和DNA光保護(hù)作用。雷敏[21]研究發(fā)現(xiàn)，魷魚(yú)墨汁黑色素能夠?qū)?shí)驗(yàn)性高脂血癥小鼠脂代謝紊亂起調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)室先前研究發(fā)現(xiàn)，曼氏無(wú)針烏賊墨汁黑色素能夠很好地清除D-半乳糖所致的衰老模型小鼠體內(nèi)積累的過(guò)氧化物以及自由基，起到很好的抗氧化作用[22]；另外，曼氏無(wú)針烏賊墨汁黑色素能緩解免疫低下模型小鼠的炎癥反應(yīng)，降低糖基化模型小鼠體內(nèi)的AGEs及其受體水平?；谝延械难芯?，本實(shí)驗(yàn)以鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠以其自然病程發(fā)展成的腎病模型[23]為研究對(duì)象，主要從烏賊墨汁黑色素是否調(diào)控高糖引起的氧化應(yīng)激和降低糖尿病腎病組織纖維化復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞核心因子表達(dá)量2 條研究途徑出發(fā)，評(píng)價(jià)烏賊墨汁黑色素能否對(duì)糖尿病腎病模型小鼠病情起到緩解作用，為開(kāi)發(fā)烏賊墨汁黑色素的藥用價(jià)值提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康ICR品系雄性小鼠70 只，體質(zhì)量（20.8±3.6）g，由浙江省動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001；冰凍烏賊25 kg（平均每只體質(zhì)量（560.8±18.6）g）購(gòu)于寧波市路林市場(chǎng)，剖開(kāi)取墨囊，放入-80 ℃冰箱保存。

STZ 美國(guó)Sigma公司；堿性蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司；鹽酸二甲雙胍片 中美上海施貴寶制藥有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒 南京建成生物工程研究所；Trizol試劑 美國(guó)Invitrogen公司；Trans實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒、Trans Start?Top Green定量PCR（quantitative PCR，qPCR）預(yù)混液 北京全式金生物有限公司；高爾寶尿八聯(lián)試紙 廣州市花都高爾寶生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

貝克曼庫(kù)爾特AU5800血液自動(dòng)生化分析儀 美國(guó)Beckman Coulter公司；尼康E200照相顯微鏡 南京兆坤儀器有限公司；FreeZone4.5臺(tái)式冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司；Spectra max190酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；強(qiáng)生穩(wěn)擇易血糖儀及配套血糖試紙 強(qiáng)生（中國(guó)）醫(yī)療器材有限公司；Eppendorf RT-qPCR儀 寧波歐普儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 烏賊墨汁黑色素的提取

常溫下解凍冰凍的烏賊墨囊，采用先前研究的酶法提純獲取高濃度烏賊墨汁黑色素[11,24]。具體步驟為：擠壓沖洗烏賊墨囊獲得墨汁→3 層紗布過(guò)濾→重復(fù)2 次離心（8 000 r/min、10 min）→冷凍干燥獲黑色素粗品→堿性蛋白酶精提黑色素（2%的粗品黑色素和1.5%的堿性蛋白酶在pH 10.3、溫度50 ℃條件下酶解4～5 h）→酶解產(chǎn)物離心6 次（6 000 r/min、10 min）→冷凍干燥獲得高純度黑色素。

1.3.2 糖尿病腎病模型小鼠的制備及分組

糖尿病腎病模型小鼠的制備：同批次70 只小鼠暫養(yǎng)4 周后，隨機(jī)選10 只作為正常組，其余小鼠禁食不禁水12 h，連續(xù)2 d進(jìn)行腹腔注射STZ溶液（劑量為45 mg/kg（以體質(zhì)量計(jì)，下同），用pH 4.2的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在冰浴中新鮮配制），正常組注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。為了防止小鼠休克，在注射STZ之前給小鼠灌胃10%的葡萄糖溶液。72 h后對(duì)造模小鼠禁食不禁水12 h，剪尾采血后用血糖儀測(cè)定空腹血糖，以血糖值高于11.1 mmol/L者作為建模成功小鼠[25]。

糖尿病腎病模型小鼠分組及灌胃：選取造模成功的小鼠50 只，隨機(jī)分為糖尿病腎病模型組、陽(yáng)性治療組、烏賊墨汁黑色素低、中、高劑量組（120、240、480 mg/kg），每組10 只，分籠暫養(yǎng)1 周后進(jìn)行灌胃，模型組和陽(yáng)性治療組小鼠分別灌胃生理鹽水和鹽酸二甲雙胍溶液（120 mg/kg），其余3 組按以上劑量灌胃烏賊墨汁黑色素懸濁液。灌胃體積為10 mL/kg，每日1 次，連續(xù)灌胃4 周，期間小鼠自由進(jìn)食、飲水，觀察并記錄小鼠基本生長(zhǎng)情況。4 周后使用尿糖試紙測(cè)定各組小鼠尿糖濃度及尿蛋白水平（定性測(cè)定）。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 腎臟指數(shù)及腎功能指標(biāo)

最后1 次給藥后，對(duì)小鼠進(jìn)行禁食不禁水5 h，乙醚麻醉處理，稱量小鼠體質(zhì)量，眼球取血500 μL，3 500 r/min離心15 min，取上清液，上清液采用血液自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，以肌酐和尿素氮水平為指標(biāo)判斷各組小鼠腎功能。

迅速剝離雙腎，生理鹽水清洗，濾紙吸干，肉眼觀察腎臟表面形態(tài)，剝離外包膜后稱雙腎質(zhì)量。腎臟指數(shù)按照下式計(jì)算。

式中：m1為小鼠雙腎總質(zhì)量/g；m2為小鼠體質(zhì)量/g。

1.3.3.2 腎臟組織學(xué)觀察

迅速剝離各組小鼠雙腎后留取部分右腎組織置于配制好的波恩氏液中固定24 h，然后經(jīng)脫水、透明、常規(guī)石蠟包埋并以5 μm厚度連續(xù)切片、蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色后，于顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3.3 腎組織相關(guān)抗氧化酶活力測(cè)定

同1.3.3.1節(jié)操作方法。剪一小塊腎臟，按照為1∶9（m/V）的比例加入生理鹽水，用組織勻漿機(jī)冰上勻漿后2 500 r/min離心10 min，取上清液，即10%的組織勻漿備用。測(cè)定小鼠腎臟的SOD、CAT、GSH-Px的活力及MDA含量。操作步驟嚴(yán)格遵從試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.3.4 RT-PCR檢測(cè)腎組織促纖維化細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量

取各組新鮮的腎組織，Trizol法提取總RNA，并測(cè)定總RNA提取質(zhì)量。參照Trans反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，隨后將反轉(zhuǎn)后的cDNA按照說(shuō)明書(shū)的量加入到含SYBR Green的RT-PCR反應(yīng)體系中，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行記錄和分析。與內(nèi)參基因β-actin標(biāo)化后，以2-ΔΔCT值表示各目的基因，即與誘導(dǎo)糖尿病腎病相關(guān)的4 個(gè)轉(zhuǎn)化因子，分別為TGF-β及其Ⅱ型受體（TGF type Ⅱ receptor，TβRⅡ）、CTGF和參與抗炎癥因子的過(guò)氧化酶體增殖物活化受體（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPAR-γ）的表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，退火30 s，72 ℃延伸45 s，最后72 ℃延伸10 min，不同基因的引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度、退火溫度和循環(huán)數(shù)見(jiàn)表1。

表 1TGF-β、TβRII、CTGF、PPAR-γ和β-actin的引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度、退火溫度和循環(huán)數(shù)Table1 Primer sequences, product lengths, annealing temperatures and cycles for PCR analysis ofTGF-β, TβRII, CTGF,PPAR-γ and β-actin

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）和Duncan test檢驗(yàn)方法進(jìn)行組間比較，其中P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理組小鼠的生長(zhǎng)情況

誘導(dǎo)糖尿病腎病小鼠模型成功后，與正常組相比，其余各組小鼠逐漸出現(xiàn)毛色枯黃無(wú)光澤、精神萎靡、脫毛嚴(yán)重、體質(zhì)量減輕，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿、腳部明顯脫皮，眼球發(fā)紅等表觀現(xiàn)象，灌胃黑色素的小鼠上述狀況明顯改善，且尿糖癥狀減輕（表2）。

表2 各組小鼠生長(zhǎng)狀況及尿糖、尿蛋白測(cè)定結(jié)果（n＝10）Table2 Growth status, urine sugar and urinary protein in mice from all groups (n= 10)

2.2 烏賊墨汁黑色素對(duì)不同處理組小鼠腎臟指數(shù)和腎功能的影響

表3 烏賊墨汁黑色素對(duì)小鼠腎臟指數(shù)和腎功能的影響（n＝10）Table3 Effect of melanin extracted from cuttle fish ink sacs on kidney index and kidney function (n= 10)

由表3可知，連續(xù)灌胃4周后，與正常組相比，糖尿病腎病模型組小鼠的腎臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05），陽(yáng)性治療組（鹽酸二甲雙胍組）和烏賊墨汁黑色素處理組無(wú)差異；與模型組相比，陽(yáng)性治療組（鹽酸二甲雙胍組）和黑色素高劑量組的腎臟指數(shù)顯著降低（P＜0.01、P＜0.05），黑色素低、中劑量組分別降低了6.0%、6.1%；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，黑色素高劑量組差異不顯著（P＞0.05），黑色素低、中劑量組腎臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，烏賊墨汁黑色素能緩解糖尿病腎病模型小鼠腎臟腫脹。

肌酐和尿素氮指標(biāo)可間接反映腎臟的損傷程度。由表3可知，與模型組相比，陽(yáng)性治療組和黑色素處理組中、高劑量組肌酐水平極顯著降低（P＜0.01），雖然黑色素低劑量組與模型組相比，肌酐水平有所降低，但不存在顯著差異；與陽(yáng)性治療組相比，黑色素中、高劑量組肌酐水平差異不顯著（P＞0.05）。與模型組相比，陽(yáng)性治療組、3個(gè)黑色素處理組的尿素氮水平極顯著降低（P＜0.01），但與正常組相比差異顯著（P＜0.05、P＜0.01）；與陽(yáng)性治療組相比，而黑色素中、高劑量組的尿素氮水平不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但低劑量組差異極顯著（P＜0.01）。因此，結(jié)果表明烏賊墨汁黑色素能夠?qū)δI功能損傷起到修復(fù)作用，且高劑量組的效果最佳。

2.3 烏賊墨汁黑色素對(duì)小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)HE染色，光學(xué)顯微鏡下400倍觀察結(jié)果如圖1所示。正常組小鼠（圖1A）腎小球外形規(guī)則飽滿，腎小球血管球充盈，腎間質(zhì)清晰可見(jiàn)，細(xì)胞核形狀圓潤(rùn)且排列規(guī)則，腎小囊邊界清晰；糖尿病腎病模型組（圖1B）腎小體血管球體積肥大，形狀不規(guī)則且排列雜亂無(wú)章，內(nèi)部充斥著大量細(xì)胞炎癥因子，腎間質(zhì)的纖維化程度高，細(xì)胞核形狀亦變?yōu)闄E圓形，細(xì)胞核表現(xiàn)為空核，腎小囊腔變窄，基質(zhì)沉淀明顯增加；灌胃高劑量黑色素后（圖1C），腎小體血管球形狀有所改善，稍微規(guī)則，炎癥因子減少，腎間質(zhì)纖維化程度降低，細(xì)胞核形狀也恢復(fù)接近正常，內(nèi)容物充盈，緩解了腎小球肥大和基質(zhì)沉淀。

圖1 烏賊墨汁黑色素對(duì)糖尿病腎病小鼠腎臟組織形態(tài)的影響（400×）Fig.1 Effect of melanin extracted from cuttlef i sh ink sacs on renal histology of diabetic mice (400 ×)

2.4 烏賊墨汁黑色素對(duì)各組小鼠腎組織相關(guān)氧化酶活力的影響

通過(guò)對(duì)各組小鼠腎組織SOD、CAT、GSH-Px活力及MDA含量測(cè)定分析烏賊墨汁黑色素對(duì)模型小鼠腎臟抗氧化酶指標(biāo)的影響，結(jié)果如表4所示，與模型組相比，陽(yáng)性治療組和烏賊墨汁黑色素中、高劑量組的SOD活力相比極顯著升高（P＜0.05、P＜0.01），黑色素低劑量處理組雖然升高了12.3%，但差異不顯著（P＞0.05）；與正常組相比，陽(yáng)性治療組、黑色素中、高劑量組小鼠的腎SOD活力無(wú)顯著性差異（P＞0.05），模型組和低劑量組的SOD活力差異顯著；與陽(yáng)性治療組相比，黑色素低、中劑量組的SOD活力無(wú)顯著差異（P＞0.05），而高劑量組卻存在顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果表明，烏賊墨汁黑色素可明顯提高糖尿病腎病模型小鼠的SOD活力。

表4 烏賊墨汁黑色素對(duì)糖尿病腎病模型小鼠相關(guān)氧化酶活力的影響（n＝ 10）Table4 Effect of melanin extracted from cuttle fish ink sacs on antioxidant enzyme activities in kidney (n= 10)

與模型組相比，3個(gè)烏賊墨汁黑色素劑量組的CAT活力升高但不顯著（P＞0.05）；與正常組相比，3個(gè)黑色素劑量組的CAT活力顯著下降（P＜0.05）；與陽(yáng)性治療組相比，3個(gè)黑色素劑量組的CAT活力極顯著下降（P＜0.01）。因此可推斷，烏賊墨汁黑色素能夠提高糖尿病腎病模型小鼠的CAT活力，但仍達(dá)不到正常組水平。

與模型組相比，陽(yáng)性治療組和烏賊墨汁黑色素高劑量組小鼠腎臟的GSH-Px活力升高，差異極顯著（P＜0.01），而黑色素低、中劑量組活力也有所升高，但差異不顯著（P＞0.05）；與正常組相比，陽(yáng)性治療組和3個(gè)黑色素劑量組的GSH-Px活力雖然有所升高，但差異極顯著（P＜0.01）。

陽(yáng)性治療組和黑色素中、高劑量組的MDA含量與模型組相比顯著降低（P＜0.05、P＜0.01），而黑色素低劑量組差異不顯著（P＞0.05）；與正常組相比，陽(yáng)性治療組和黑色素高劑量組的MDA含量基本上已達(dá)到正常組水平，差異不顯著（P＞0.05），而黑色素低、中劑量組與正常組相比，MDA含量極顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果表明，烏賊墨汁黑色素中、高劑量組對(duì)糖尿病腎病模型小鼠起到很好的抗脂質(zhì)氧化作用。

2.5 各組小鼠腎皮質(zhì)中促纖維化炎癥細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)情況

為進(jìn)一步研究烏賊墨汁黑色素對(duì)糖尿病腎病模型小鼠腎臟保護(hù)作用的機(jī)理，實(shí)驗(yàn)分析了腎皮質(zhì)中轉(zhuǎn)化因子及受體、促纖維化炎癥的細(xì)胞因子和抗炎、抗增生轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況。

圖2 各處理組小鼠腎皮質(zhì)中促纖維化細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量Fig.2 mRNA expression levels of renal fibrogenic cytokines in mice from all groups

由圖2A和圖2B可知，陽(yáng)性治療組和烏賊墨汁黑色素高劑量組的小鼠腎皮質(zhì)TGF-β及其受體TβRⅡ的mRNA表達(dá)量與模型組相比極顯著降低（P＜0.01），與正常組相比不存在顯著性差異（P＞0.05），已經(jīng)達(dá)到了正常水平；雖然黑色素低、中處理組的二者的mRNA表達(dá)量有所降低，但與模型組和正常組相比均差異顯著（P＜0.05）。

由圖2C和圖2D可知，模型組小鼠腎臟固有細(xì)胞的促纖維化因子CTGF的mRNA表達(dá)量和正常組相比上調(diào)了大約4.5 倍，經(jīng)烏賊墨汁黑色素干預(yù)后，中、高劑量組分別下調(diào)了54.1%、57.2%，與模型組相比具有極顯著差異（P＜0.01），黑色素低劑量組雖然有所下調(diào)，但與模型組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。與模型組相比，在烏賊墨汁黑色素的干預(yù)下，低、中、高劑量組小鼠腎皮質(zhì)的PPAR-γ mRNA表達(dá)量分別上調(diào)了2.6、3.9、5.8 倍，與模型組相比具有極顯著差異（P＜0.01）。

3 討 論

本研究從不同水平分析了烏賊墨汁黑色素對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境會(huì)引發(fā)腎臟腫脹、腎小球基質(zhì)纖維化程度加重，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)功能減弱，出現(xiàn)嚴(yán)重的蛋白尿和尿糖癥狀[4]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)烏賊墨汁黑色素3個(gè)劑量組干預(yù)后，糖尿病腎病小鼠的腎臟指數(shù)顯著性降低，腎臟腫脹減輕，腎臟功能基本恢復(fù)；腎臟組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，腎小球系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)纖維化積聚程度變?nèi)?，?xì)胞核內(nèi)容物充盈，腎小球形態(tài)恢復(fù)正常，尿糖和尿蛋白程度減輕，且黑色素高劑量組效果最為顯著。

機(jī)體在正常狀況下，自由基在體內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)的維持主要依賴于自身完整的抗氧化酶系統(tǒng)。SOD與其他抗氧化酶如CAT、GSH-Px都屬于體內(nèi)抗氧化酶防御系統(tǒng)，SOD可以將體內(nèi)的轉(zhuǎn)化為H2O2，最終由CAT轉(zhuǎn)化為H2O；GSH-Px和CAT是動(dòng)物體內(nèi)重要的抗氧化酶，也可把H2O2還原為水，MDA是生物膜中多不飽和脂肪酸受到自由基攻擊后發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用所形成過(guò)氧化物的最終分解產(chǎn)物，能夠直接反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度，間接反映機(jī)體受自由基損傷的程度[26]。已有的研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體在持續(xù)高糖環(huán)境下，線粒體呼吸鏈中活性氧自由基（活性氧簇）生成過(guò)多，自由基超過(guò)了機(jī)體的清除能力，平衡狀態(tài)被破壞，就會(huì)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而引起機(jī)體損傷，導(dǎo)致抗氧化酶系統(tǒng)紊亂，持續(xù)氧化狀態(tài)下，會(huì)致使糖尿病患者引發(fā)糖基化終末產(chǎn)物堆積，進(jìn)而誘發(fā)各種糖尿病并發(fā)癥[27]。腎臟是對(duì)氧化應(yīng)激損傷敏感的器官，長(zhǎng)期氧化應(yīng)激刺激下，腎組織細(xì)胞正常清除自由基的能力被逐漸破壞，導(dǎo)致腎功能衰竭。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠腎皮質(zhì)中SOD、CAT和GSH-Px組成的抗氧化體系酶活力降低，腎皮質(zhì)中脂質(zhì)過(guò)氧化物的終產(chǎn)物MDA含量顯著升高，而使用烏賊墨汁黑色素3 個(gè)劑量灌胃4周后，小鼠腎皮質(zhì)中SOD、CAT、GSH-Px活力極顯著升高，抗氧化應(yīng)激能力增強(qiáng)，但仍與正常水平存在一定的差異；MDA含量較模型組顯著降低?？傮w來(lái)看，黑色素處理組小鼠的抗氧化能力增強(qiáng)，有效抑制了脂質(zhì)過(guò)氧化物和糖基化終末產(chǎn)物的堆積，較好地緩解了糖尿病腎病的進(jìn)一步發(fā)展。

腎組織中復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)因子的變化關(guān)系到糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。TGF-β是調(diào)控腎臟組織纖維化的細(xì)胞因子，主導(dǎo)糖尿病腎病的腎小球硬化、系膜基質(zhì)堆積，其基因的高表達(dá)能夠?qū)е履I間質(zhì)的纖維化[28]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病模型組腎皮質(zhì)TGF-β mRNA的表達(dá)水平明顯高于正常組；Iwano等[29]研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間處于高血糖狀態(tài)下TGF-β mRNA的表達(dá)水平升高，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驼T導(dǎo)成功，同時(shí)組織學(xué)結(jié)果也同樣驗(yàn)證了這一結(jié)論。TβRⅡ是TGF-β的活性受體，能夠與TGF-β結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成、抑制其降解，導(dǎo)致細(xì)胞膜外基質(zhì)堆積[30]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病模型組小鼠經(jīng)烏賊墨汁黑色素3 個(gè)劑量干預(yù)4 周后，腎臟中的TGF-β mRNA表達(dá)水平明顯降低，其受體TβRⅡ的表達(dá)量和TGF-β mRNA的降低具有很強(qiáng)的一致性。有研究證實(shí)，CTGF是TGF-β的下游調(diào)節(jié)因子，腎小球系膜細(xì)胞的TGF-β能夠調(diào)控CTGF mRNA的表達(dá)量[31]，而當(dāng)CTGF mRNA低表達(dá)時(shí)，糖尿病腎病小鼠的腎小球細(xì)胞外基質(zhì)積聚以及腎臟的纖維化程度均會(huì)得到明顯改善[32]；高表達(dá)時(shí)，可加強(qiáng)介導(dǎo)腎組織中TGF-β的促纖維化作用及系膜外基質(zhì)的增生積聚。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)烏賊墨汁黑色素3 個(gè)劑量組干預(yù)的糖尿病腎病小鼠，CTGF mRNA的表達(dá)量與模型組相比顯著降低，和TGF-β mRNA的表達(dá)量也具有一致性，因此，模型小鼠腎組織的纖維化積聚得到緩解。PPAR-γ是一類配體激活的活受體，是核轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，可通過(guò)調(diào)節(jié)血脂平衡、炎癥反應(yīng)等影響血管平滑肌細(xì)胞增生的作用，密切參與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。有研究表明，在糖尿病腎病的進(jìn)程中PPAR-γ能夠阻遏TGF-β/Smad（drosophila mothers against decapentaplegic）信號(hào)通路中TGF-β的上調(diào)，抑制TGF-β的活性，且能夠明顯抑制腎小球系膜外基質(zhì)增生和纖維化的增加[33]。3 個(gè)烏賊墨汁黑色素處理組小鼠的PPAR-γ mRNA均高表達(dá)，且高劑量組效果最顯著，與之前研究[33]相一致。由此可推斷，烏賊墨汁黑色素是通過(guò)上調(diào)PPAR-γ的mRNA表達(dá)來(lái)抑制TGF-β的活性，進(jìn)而影響其受體TβRⅡ和下游調(diào)節(jié)因子CTGF mRNA的表達(dá)，從而改善腎臟的結(jié)構(gòu)病變，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。

綜上所述，烏賊墨汁黑色素能夠通過(guò)改善腎組織的氧化應(yīng)激，保護(hù)高糖下敏感的腎組織；通過(guò)介導(dǎo)PPAR-γ/TGF-β代謝通路，緩解腎臟組織形態(tài)的病變，修復(fù)腎小球因炎癥產(chǎn)生的形變，減輕腎基質(zhì)間纖維化積聚程度，從而增強(qiáng)了腎功能，導(dǎo)致尿糖和尿蛋白程度減輕，進(jìn)一步改善了腎功能。另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，烏賊墨汁黑色素中、高劑量對(duì)糖尿病腎病能起到更好的控制作用。鑒于引發(fā)糖尿病腎病的途徑還有很多，另外，處于不同分期的病癥發(fā)病機(jī)制各異，還需進(jìn)一步探究，為輔助治療糖尿病開(kāi)發(fā)出安全有效、機(jī)制清楚的天然保健食品帶來(lái)新思路。

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