乳源酪蛋白糖巨肽對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞抗炎及血管生成因子表達(dá)水平的影響

王秋萍，賈 彥，曹江鳴，趙 培，崔文靜，馬新穎，趙林森，閆亞麗,*，陳慶森,*

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134；2.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050899）

乳源酪蛋白糖巨肽（casein glycomacropeptide，CGMP）除了具有良好的營養(yǎng)特性之外，還有提高智力發(fā)育、促益生菌增殖以及免疫調(diào)節(jié)等活性[1-8]。結(jié)直腸癌是人類常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個由遺傳和環(huán)境等諸多因素經(jīng)過多步驟及內(nèi)外因交互作用的結(jié)果，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為結(jié)直腸癌的主要發(fā)病機(jī)制分為原癌基因和抑癌基因的突變、基因組的不穩(wěn)定性[9]；其中基因組不穩(wěn)定性包括染色體不穩(wěn)定、微衛(wèi)星不穩(wěn)定和核苷酸對（CpG island，GPG）、甲基化表型[10]、鋸齒狀途徑[11]。部分研究學(xué)者還認(rèn)為炎癥、腫瘤與結(jié)直腸癌密切相關(guān)，尤其是炎癥性腸病最可能發(fā)展成結(jié)直腸癌，有報道指出約20%的潰瘍性結(jié)腸炎患者在發(fā)病后的30 年左右可發(fā)展成結(jié)直腸癌[12]。核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear transcription factor，NF）-κB廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞中，在60%～80%的結(jié)腸癌細(xì)胞中都有所表達(dá)，約40%的結(jié)腸癌細(xì)胞中表現(xiàn)有NF-κB的活性，處于活性狀態(tài)的NF-κB開啟了調(diào)控一系列炎癥靶基因的工作，使其在細(xì)胞周期、凋亡和代謝病理過程中發(fā)揮重要作用[5-6,10]。近年來，本實驗室系統(tǒng)地從乳源CGMP對腸道免疫調(diào)控系統(tǒng)、腸道菌群變化的影響以及和腸道炎癥反應(yīng)的相關(guān)性等方面進(jìn)行了研究。證實乳源CGMP具有抗炎活性，在一定程度上可以改善、緩解和治愈炎癥性腸病。朱晨晨等[13]用惡唑酮誘導(dǎo)建立潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型，研究乳源CGMP對其結(jié)腸黏膜固有層CD4、CD8、SIgA及免疫信號通路MEKK1、Smad7表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)乳源CGMP也可顯著降低結(jié)腸黏膜固有層中CD4、CD8的表達(dá)，促進(jìn)SIgA的表達(dá)。同時抑制MEKK1和Smad7蛋白的表達(dá)，說明乳源CGMP具有維持腸黏膜免疫調(diào)節(jié)的平衡和保護(hù)腸黏膜免疫屏障功能。李偉等[14]研究了乳源CGMP對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群、腸系膜淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞亞群和派爾集合淋巴結(jié)（peyer patch，PP）淋巴細(xì)胞亞群的影響，通過實驗結(jié)果分析，長期灌胃乳源CGMP能夠介導(dǎo)腸黏膜免疫，促進(jìn)脾臟和PP結(jié)T淋巴細(xì)胞亞群顯著增多，說明乳源CGMP能夠引起這些外周免疫器官產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答。脾淋巴細(xì)胞的增殖是感染反應(yīng)的一個環(huán)節(jié)，抑制脾淋巴細(xì)胞增殖表現(xiàn)為抑制免疫應(yīng)答，Otani等[15]發(fā)現(xiàn)在小鼠的食物中加入乳源CGMP，可抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)小鼠脾臟細(xì)胞的增殖，進(jìn)而表明乳源CGMP具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用。Monnai等[16]發(fā)現(xiàn)乳源CGMP干預(yù)后的細(xì)胞，家族細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-lra通過與IL-1的受體結(jié)合從而阻止了IL-1的作用，因此不能啟動脾臟細(xì)胞的擴(kuò)增。Requena等[17]研究指出NF-κB及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號可由牛乳糖巨肽（bovine glycomacropeptide，BGMP）激活，從而使人體巨噬細(xì)胞（human acute monocytic leukemia cell line，THP）-1的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、IL-8和IL-1b的含量增加。Requena等[18]研究還發(fā)現(xiàn)，BGMP可激活NF-κB和MAPK信號通路，上調(diào)人單核細(xì)胞TNF、IL-1β和IL-8的分泌，并認(rèn)為BGMP在腸道中可能起到抗炎的作用。Requena等[19]研究也證BGMP可以降低腸道炎癥的發(fā)生，BGMP可以抑制由刀豆蛋白誘導(dǎo)的脾細(xì)胞TNF-α和干擾素（interferon，IFN）-γ的表達(dá)。Rhoades等[20]證實了乳源CGMP可以抑制3 株腸致病性大腸桿菌對結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞株的黏附能力，從而緩解結(jié)直腸癌的發(fā)展。這些都充分說明乳源CGMP在結(jié)腸炎方面具有一定的抗炎作用。Yun等[21]通過研究乳源CGMP對LPS刺激的脾臟細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）A的濃度升高。乳源CGMP能夠促進(jìn)正常B淋巴細(xì)胞的增殖，所以能夠增強機(jī)體的體液免疫系統(tǒng)。李榮華等[22]利用乳源CGMP刺激體外培養(yǎng)的小鼠骨髓源樹突細(xì)胞（dendritic cell，DCs），發(fā)現(xiàn)乳源CGMP可刺激DCs的成熟，并強烈地刺激生物相容復(fù)合體抗原（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅱ，在DCs對外源抗原的提呈過程中，MHC-Ⅱ發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，說明乳源CGMP通過調(diào)節(jié)DCs中MHC-Ⅱ來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

基于以上的研究成果，本研究主要從炎癥因子和信號通路兩方面入手，以結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞為研究對象，探究乳源CGMP的抗炎性能和免疫調(diào)節(jié)作用。通過免疫熒光法確定LPS刺激HT-29細(xì)胞激活NF-κB信號通路，確定乳源CGMP通過抑制炎癥因子和血管生成因子的表達(dá)，從而達(dá)到減緩炎癥的程度，更為乳源CGMP作為功能性物質(zhì)應(yīng)用于結(jié)腸的健康提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CGMP 新西蘭Tatua公司；人類結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞江蘇齊氏生物科技有限公司。

LPS 美國Sigma公司；胎牛血清 美國Gibco公司；NF-κB激活-核轉(zhuǎn)運檢測試劑盒、Nc-細(xì)胞核/漿蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒 北京康為世紀(jì)科技有限公司；兔抗人p65多克隆抗體 英國Abcam公司；免疫熒光染色試劑盒-抗兔Cy3 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；4',6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI） 北京索萊寶有限公司；人8 種炎癥因子酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、人8 種血管生成因子ELISA試劑盒 美國Signosis公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HERAcell 240iCO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；SpectraMax M5多功能讀板機(jī) 美國Molecular Devices公司；TE2000倒置拍照顯微鏡 日本Nikon公司；X-OMAT醫(yī)用X射線膠片 銳珂（廈門）醫(yī)療器材有限公司；3K15高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；DYCZ-24DN迷你雙垂直電泳槽、DYCZ-40D迷你轉(zhuǎn)印電泳槽、DYY-2C電泳儀 北京六一儀器廠；QB-9001多孔振蕩器海門市其林貝爾儀器；Gel doc XR凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及乳源CGMP溶液制備

結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及乳源CGMP溶液制備等方法參見文獻(xiàn)[7]。

1.3.2 免疫熒光法確定LPS刺激HT-29細(xì)胞激活NF-κB信號通路

1.3.2.1 LPS細(xì)胞實驗分組

LPS溶液的配制：準(zhǔn)確稱取50 mg LPS于5 mL的DMEM高糖培養(yǎng)基中，針頭過濾器過濾，-20 ℃凍存，使用時用DMEM培養(yǎng)基梯度稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度。

HT-29細(xì)胞正常培養(yǎng)，傳代進(jìn)行2～3 次，然后進(jìn)行分組：正常對照組、LPS組1（0.01 μg/mL）、LPS組2（0.1 μg/mL）、LPS組3（1 μg/mL）、LPS組4（10 μg/mL），每組3 個復(fù)孔。

1.3.2.2 細(xì)胞爬片的制備

在48 孔板內(nèi)滴入2 μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），然后用鑷子放入玻片以確保其固定在孔板內(nèi)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3 次，胰酶消化后用于計數(shù)；用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/mL，均勻接種細(xì)胞爬片，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。取出孔板棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌1 次，正常對照組加100 μL完全培養(yǎng)基，LPS組加入不同質(zhì)量濃度的LPS溶液100 μL，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。用彎針頭挑出細(xì)胞爬片置于培養(yǎng)皿蓋上，PBS洗滌1 次。

1.3.2.3 免疫熒光圖的觀測

1）固定：每個細(xì)胞爬片加入100 μL 4%多聚甲醛固定液固定10 min。2）洗滌：吸除固定液，用洗滌液洗滌3 次，每次4 min，注意每次在洗滌過程中盡量吸盡殘余液體，同時要保證表面的濕潤度，最后一次完全去除洗滌液。3）封閉：加入100 μL的免疫染色封閉液，室溫封閉1 h。4）一抗反應(yīng)：吸除免疫染色封閉液，加入封閉液稀釋的NF-κB p65抗體（封閉液與抗體體積比為80∶1），在4 ℃條件下孵育過夜。5）洗滌：重復(fù)步驟2）。6）二抗反應(yīng)：加入免疫染色封閉液稀釋抗兔Cy3抗體（封閉液與抗體體積比為100∶1）100 μL，避光室溫孵育1 h。隨后的步驟都要避光進(jìn)行操作。7）洗滌：重復(fù)步驟2）。8）細(xì)胞核染色：加入細(xì)胞核染色液DAPI，室溫染色5 min。9）洗滌：重復(fù)步驟2）。10）熒光倒置顯微鏡觀察。

1.3.3 乳源CGMP對炎癥因子和血管生成因子表達(dá)的影響

HT-29細(xì)胞正常培養(yǎng)，傳代進(jìn)行2～3 次，然后進(jìn)行分組：正常對照組、LPS組、實驗組（CGMP組1：10-6mg/mL、CGMP組2：10-5mg/mL、CGMP組3：10-4mg/mL、CGMP組4：10-3mg/mL、CGMP組5：10-2mg/mL）。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，PBS洗5 min，洗2 次，正常組加入完全培養(yǎng)基，LPS組和實驗組均加入LPS（1 μg/mL），均在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，然后LPS組和實驗組吸去LPS，之后LPS組加入完全培養(yǎng)基，實驗組加入不同質(zhì)量濃度的乳源CGMP溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，1 200 r/min離心2 次，每次5 min。將得到的上清液直接進(jìn)行8 種炎癥因子的檢測，對于血管生成因子檢測前用截留分子質(zhì)量為3 ku的蛋白超濾管進(jìn)行濃縮，10 000 r/min條件下離心5 次，每次10 min，將細(xì)胞上清液濃縮至1 mL后進(jìn)行測定。其余操作按照試劑盒說明書，在多功能讀板機(jī)測量每個孔在450 nm波長處的吸光度（A450nm）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件中的Duncan模型進(jìn)行方差分析與多重比較，處理結(jié)果以表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫熒光法確定LPS刺激HT-29細(xì)胞激活NF-κB信號通路

圖1 不同LPS質(zhì)量濃度刺激下HT-29細(xì)胞免疫熒光圖Fig.1 immunof l uorescence images of HT-29 cells under LPS stimulation at different concentrations

NF-κB開啟轉(zhuǎn)錄功能的前提是NF-κB（p65）從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，而目前研究NF-κB的活化方法主要有凝膠電泳遷移實驗、熒光素酶報告基因測定NF-κB DNA結(jié)合活性以及免疫熒光技術(shù)等技術(shù)。其中免疫熒光技術(shù)可更為簡單直觀地觀察到p65的核移位情況。本研究采用DAPI和Cy3雙色熒光進(jìn)行標(biāo)記。DAPI是一種可以透過完整細(xì)胞膜與DNA強力結(jié)合的藍(lán)色熒光染料，即可對細(xì)胞核內(nèi)的DNA染色而顯示出細(xì)胞核；因此，在熒光顯微鏡下藍(lán)色熒光圖像指示的為細(xì)胞核區(qū)；Cy3（箐類染料）是標(biāo)記NF-κB（p65）抗體的紅色熒光染色劑。

細(xì)胞靜息狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的NF-κB很少被激活而存在細(xì)胞質(zhì)中，這時的紅色主要為細(xì)胞質(zhì)的NF-κB。而激活后的NF-κB會轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，這時細(xì)胞核區(qū)也會出現(xiàn)紅色的熒光，核區(qū)紅色熒光越多，說明轉(zhuǎn)位的NF-κB（p65）越多，以此來代表NF-κB活化的程度。圖1顯示不同質(zhì)量濃度LPS刺激下的免疫熒光圖，不同的濾光鏡分別采取同一視野。由免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，在正常對照組圖1A1中，可清晰地看到呈現(xiàn)紅色熒光的細(xì)胞質(zhì)（圖中未顯示，下同），中間內(nèi)依稀可見空心的部分為細(xì)胞核，在圖1A3中通過與細(xì)胞核的藍(lán)色熒光染色疊加后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核的顏色與疊加前幾乎無差別，說明NF-κB（p65）沒有發(fā)生核移位。而通過觀察經(jīng)LPS刺激后的各組疊加后的圖片，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了p65從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)不同程度地轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)的現(xiàn)象。LPS組1疊加圖的胞核區(qū)染色不再是單一的藍(lán)色，伴隨輕微的紫色，原因是NF-κB的核移位使得細(xì)胞核內(nèi)也表現(xiàn)出紅色熒光，當(dāng)紅、藍(lán)顏色疊加后，便出現(xiàn)了藍(lán)紫色。NF-κB活化的程度越大，即核移位越多，胞核區(qū)的染色就越向紫色偏移，比較LPS組1～組4，發(fā)現(xiàn)LPS組3的胞核區(qū)疊加后的紫色更明顯，表明胞核內(nèi)的紅色熒光更多；所以，LPS組3（1 μg/mL）是刺激HT-29細(xì)胞活化NF-κB信號通路的最適劑量。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)考察了乳源CGMP對炎癥因子和血管生成因子表達(dá)的影響。

2.2 乳源CGMP對炎癥因子和血管生成因子表達(dá)的影響

2.2.1 乳源CGMP干預(yù)激活后的HT-29細(xì)胞的8 種炎癥因子表達(dá)水平

圖2 各細(xì)胞炎癥因子相對表達(dá)量的比較Fig.2 Comparison of relative expression levels of inf l ammatory factors

免疫因素是結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制的重要因素之一，大量的T淋巴細(xì)胞分泌各種促炎（TNF-α、IFN、IL-1、IL-6、IL-8）和抑炎（IL-4、IL-10）的炎癥因子，還包括趨化因子和集落刺激因子等，這些因子的反饋性又加重炎癥的損傷。采用ELISA試劑盒的方法測定細(xì)胞中炎癥因子相對表達(dá)量的結(jié)果如圖2所示，其中表達(dá)量相對較多的是GMCSF、GCSF、INF-γ、TNF-α、IL-8 5 種因子，剩余3 種因子的表達(dá)量一般。LPS組各種因子都明顯高于對照組和乳源CGMP組。同時綜合8 種因子經(jīng)乳源CGMP的調(diào)節(jié)后，發(fā)現(xiàn)CGMP組2、CGMP組3和CGMP組4的對炎癥因子表達(dá)有明顯的影響。

2.2.2 乳源CGMP干預(yù)激活后的HT-29細(xì)胞的8 種血管生成因子表達(dá)水平

腫瘤持續(xù)性生長必須要依賴于血管，血管是腫瘤營養(yǎng)的運輸系統(tǒng)，亦是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑。采用ELISA的方法測定的細(xì)胞中血管生成因子相對表達(dá)結(jié)果如圖3所示，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）與轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）β表達(dá)量最突出，乳源CGMP組不僅極顯著地下調(diào)了LPS刺激后的VEGF分泌，其表達(dá)量也低于正常對照組，具有極顯著性差異。其余的因子也呈現(xiàn)出LPS組的表達(dá)量最大，乳源CGMP均不同程度地抑制了各種因子的表達(dá)，總體趨勢均是先降低后升高。

圖3 各細(xì)胞血管生成因子相對表達(dá)量的比較Fig.3 Comparison of relative expression levels of angiogenic factors

3 討 論

NF-κB是一種高度保守的核轉(zhuǎn)錄因子，因其在細(xì)胞內(nèi)參與了炎癥因子的調(diào)控和表達(dá)，所以亦稱之為炎癥反應(yīng)鏈上的“基因開關(guān)”。在受到外界的刺激時，NF-κB可迅速產(chǎn)生反應(yīng)而影響機(jī)體。研究指出，NF-κB與結(jié)直腸癌的關(guān)系密切[23]，因此研究NF-κB信號通路在結(jié)腸癌的發(fā)展中具有重大意義。

本研究以體外人源結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞為模型，通過觀測p65核移位的現(xiàn)象確定NF-κB信號通路激活狀態(tài)，研究用LPS刺激細(xì)胞以確保NF-κB（p65）從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。由圖1發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)紅色熒光的強弱依賴于LPS的質(zhì)量濃度，LPS的質(zhì)量濃度越高，疊加后的紫色熒光越明顯，充分說明NF-κB信號通路的激活越徹底。Hwang等[24]用LPS（20 μg/mL）刺激人臍靜脈內(nèi)皮血管細(xì)胞，同樣采用熒光技術(shù)，發(fā)現(xiàn)LPS可以激活NF-κB。Perkins等[25]以0.01、0.10、1.00 μg/mL的LPS刺激結(jié)腸癌SW620細(xì)胞1、3、6、12 h后測定Toll樣受體、NF-κB，結(jié)果顯示NF-κB的活化與LPS的質(zhì)量濃度和時間均呈現(xiàn)依賴性，表明1 μg/mL是最適的劑量，與本實驗結(jié)果相同。本研究為乳源CGMP干預(yù)后的HT-29細(xì)胞在體外細(xì)胞模型中處于激活狀態(tài)提供了保障。事實表明，炎癥反應(yīng)過程中細(xì)胞因子及相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)往往與特定免疫信號通路的激活有著必然的聯(lián)系。腸黏膜受到外界刺激后造成NF-κB激活，過量表達(dá)部分炎癥細(xì)胞因子，如前列腺素E2、IL炎癥因子不斷刺激腫瘤細(xì)胞加劇了其發(fā)展轉(zhuǎn)移；進(jìn)一步認(rèn)識炎癥因子對結(jié)直腸癌及其他免疫相關(guān)性疾病的影響機(jī)制有助于降低炎癥性腸病誘發(fā)腸道腫瘤的概率[12]。近年來，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB已被研究得較為透徹，絕大多數(shù)人認(rèn)為其在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)才代表NF-κB已具備轉(zhuǎn)錄活性，也有部分人認(rèn)為只有核內(nèi)磷酸化才能證明NF-κB被激活，對于p65的解釋更是充滿爭議。p65的磷酸化可以通過經(jīng)典通路中的細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)中NF-κB激酶抑制劑（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）的作用也可直接與酪氨酸激酶結(jié)合，然后將其磷酸化。在國內(nèi)的研究中發(fā)現(xiàn)p65蛋白的磷酸化位點具有多個，不同的位點磷酸化可產(chǎn)生不同的效果，其中研究較多的是第536位和第276位的絲氨酸（Ser）。Ser536的磷酸化都被解釋為有助于核因子的轉(zhuǎn)錄，在大鼠肉瘤（ratsarcoma，ras）、蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、核糖體S6蛋白激酶（ribosomal S6 kinase，RSK)通路增強核蛋白體S6能夠直接把核內(nèi)的p65的Ser536磷酸化，通過降低與抑制蛋白IκB的結(jié)合從而增強NF-κB的活性[25-26]。磷酸化p65不僅僅只存在于細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也同樣存在，并且影響著p65在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的定位。有研究發(fā)現(xiàn)276位的Ser磷酸化的p65能夠減少p65在細(xì)胞核內(nèi)的積累，基因敲除磷酸化p65的Ser276的蛋白激酶（protein kinases，PKA）會使p65在核內(nèi)的積累增多[27]，但也有學(xué)者認(rèn)為Ser276被PKA磷酸化后增強了NF-κB與DNA的親和性。結(jié)合四唑鹽比色法[7]和免疫熒光測定的結(jié)果，并測定了不同質(zhì)量濃度的CGMP對LPS刺激后的細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明實驗組均下調(diào)被LPS刺激的HT-29細(xì)胞內(nèi)p65的表達(dá)，質(zhì)量濃度10-5mg/mL和10-4mg/mL的乳源CGMP對p65的作用極其顯著；而低質(zhì)量濃度10-5、10-4mg/mL和10-3mg/mL的乳源CGMP對p65的影響極顯著；其他質(zhì)量濃度CGMP雖也在不同程度上降低了部分蛋白的表達(dá)，但與正常對照組相比，都沒有顯著性[7]。Ming Zhu等[8]研究了乳源CGMP對潰瘍性小鼠的影響，測定結(jié)腸組織的核蛋白內(nèi)的p65，揭示了乳源CGMP可以降低模型組的蛋白的表達(dá)，本實驗的結(jié)果與其結(jié)論一致。

目前國內(nèi)外研究CGMP對結(jié)腸癌的抗炎方面還比較少，而大多數(shù)的研究集中在生物活性肽方面，H?versen等[28]的實驗結(jié)果表明乳鐵蛋白可以抑制NF-κB的活性和細(xì)胞因子的表達(dá)量。J?rgensen等[29]以小鼠的腸道細(xì)胞為模型，用LPS刺激細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，0.1 μg/mL LPS可最大程度活化NF-κB，牛初乳蛋白處理可顯著降低p65的轉(zhuǎn)錄。同時，Majumder[30]和Huang Wuyang[31]等從雞蛋清中提取的三肽可以抑制由細(xì)胞因子誘導(dǎo)的關(guān)鍵NF-κB信號通路，從而下調(diào)了在血管內(nèi)皮中表達(dá)的炎癥蛋白。本研究的結(jié)果也與以上眾多研究結(jié)論相符，進(jìn)一步說明了乳源CGMP可在炎癥相關(guān)的信號通路中發(fā)揮一定的作用，其作用機(jī)制為乳源CGMP進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)直接作用到經(jīng)典信號通路中的結(jié)點蛋白IKK上，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)就阻斷了p65的核移位和Ser536的磷酸化，使得細(xì)胞核的p65在不同程度上降低[6,8]。

無論是炎癥的產(chǎn)生還是血管的生成終歸咎于促炎因子與抑炎因子、血管生成因子與抑制血管生成因子之間的平衡被打破，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂[3]。研究顯示有近25%的腫瘤是由慢性炎癥引發(fā)的，如部分結(jié)腸癌的形成就是由炎癥反復(fù)刺激結(jié)腸黏膜導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎演變的。腸上皮屏障的損傷增加了上皮的通透性，細(xì)菌等進(jìn)入黏膜下層，刺激巨噬細(xì)胞、DCs產(chǎn)生促炎因子（TNF-α、IL-8、IL-1β）。這樣的炎癥微環(huán)境使腫瘤細(xì)胞分泌更多趨化因子和炎癥因子，招募免疫細(xì)胞并激活下游的信號通路。TNF-α可促使NF-κB途徑被激活，趨化巨噬細(xì)胞積累并轉(zhuǎn)錄大量的促炎因子而誘發(fā)結(jié)腸癌；中和TNF-α可以降低結(jié)腸癌的發(fā)生率[32]。腫瘤血管的生成是機(jī)體原有血管直接的實體瘤生長再血管化，血管形成的關(guān)鍵步驟是血管生成因子誘發(fā)細(xì)胞的增殖和游走。1971年Folkman等[33]從Walker256瘤細(xì)胞中提取了一種誘發(fā)血管生成物質(zhì)，并正式命其為腫瘤血管生成因子。至今，已發(fā)現(xiàn)10多種血管生成因子，代表有TGF、VEGF、EGF、TNF-α及纖維蛋白等，這些血管生成因子不斷促進(jìn)血管的生成。炎癥因子與血管生成因子存在一定的關(guān)聯(lián)，TNF-α不僅具有促炎因子的作用而且還發(fā)揮誘發(fā)血管生成因子的作用。更有研究證明粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子CMSCF在腸炎惡性轉(zhuǎn)化過程中高度表達(dá)，在LPS刺激結(jié)腸上皮細(xì)胞后可分泌CMCSF，更重要的是CMCSF又可促進(jìn)腸道腫瘤上皮細(xì)胞直接釋放VEGF[34]。本結(jié)果顯示LPS刺激HT-29細(xì)胞后，促炎因子中CMCSF的表達(dá)量最高，對應(yīng)的血管生成因子中VEGF也最為明顯，與前人的結(jié)果一致。結(jié)腸癌中的這些因子的轉(zhuǎn)錄由活化的NF-κB控制[35]。對于CMCSF促進(jìn)VEGF的表達(dá)可能與ERK通路存在關(guān)聯(lián)，已有研究證明ERK通路也可調(diào)控VEGF的表達(dá)，CMCSF通過促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子1α的入核而誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)[36]。

4 結(jié) 論

乳源CGMP具有調(diào)節(jié)激活后的NF-κB信號通路的能力，能有效抑制和改善結(jié)腸癌細(xì)胞的炎癥狀態(tài)，其機(jī)制為乳源CGMP可通過顯著下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中NF-κB信號通路的炎癥因子和血管生成因子的表達(dá)，從而達(dá)到減緩炎癥的程度。

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