羅非魚頭長鏈堿的分離純化及抗腫瘤活性

于曼曼，夏光華，李 川，申鉉日,*

（1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 海口 570228；2.海南大學(xué) 熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570228）

羅非魚，又稱非洲鯽魚，由于其生長迅速、肉質(zhì)鮮嫩，富含蛋白質(zhì)和多種不飽和脂肪酸，成為世界上水產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)培養(yǎng)的淡水養(yǎng)殖魚類[1-2]。我國是羅非魚生產(chǎn)大國，生產(chǎn)的成品多為冷凍羅非魚片，其加工過程中產(chǎn)生大量的魚頭廢棄物。因此本研究以羅非魚頭為原料進(jìn)行羅非魚頭長鏈堿（tilapia head long chain bases，TH-LCB）的制備，不僅可以增加羅非魚廢棄物的附加值，還可以減少廢棄物對環(huán)境的污染。

長鏈堿又稱鞘氨醇?jí)A基、鞘氨基醇，為長鏈多羥基脂肪胺，是鞘脂類的特征性結(jié)構(gòu)[3]。1876年首次在大腦中發(fā)現(xiàn)了腦苷脂，并且發(fā)現(xiàn)它含有一個(gè)脂肪鏈的堿基，即“sphingosines”，但鞘氨醇類化合物的作用機(jī)理至今仍是一個(gè)難解的謎。長鏈堿的結(jié)構(gòu)隨著生物進(jìn)化，在不同物種之間存在較大的差異，這些差異主要包括長鏈堿的碳骨架長短、支鏈位置和雙鍵數(shù)目及位置。天然存在的長鏈堿鏈長為12～22 個(gè)碳，以18 個(gè)碳居多。植物和真菌的長鏈堿以t18∶0為主要成分，主要以植物鞘氨醇（phytosphingosine）為主；哺乳動(dòng)物以d18∶1和d18∶0為主要成分，哺乳動(dòng)物體內(nèi)最常見的長鏈堿是神經(jīng)鞘氨醇（sphingosine，d18∶1），又稱鞘氨醇[4]；而水產(chǎn)類的長鏈堿組成比植物、真菌和哺乳動(dòng)物復(fù)雜，主要成分是雙不飽和的d18∶2長鏈堿[4,8]，還發(fā)現(xiàn)有特殊的多不飽和d18∶3和d19∶3長鏈堿。長鏈堿的相對分子質(zhì)量范圍為238.4～320.5[5]。長鏈堿屬于強(qiáng)效的生長抑制劑，外源性長鏈堿可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞系周期阻滯和凋亡，如人白血病HL-60細(xì)胞[6]、人大腸癌HT-29細(xì)胞和HCT-116細(xì)胞[7-8]、人肝癌HepG2細(xì)胞[9]等。長鏈堿還可以使細(xì)胞內(nèi)溶酶體快速破裂，釋放出組織蛋白酶D、B和L，激活Caspases酶系，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。這一過程可能伴隨著線粒體釋放細(xì)胞色素c，激活Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-7等，以及抑制AKT激酶通路和絲氨酸/蘇氨酸激酶通路等抗凋亡途徑[11]。

本研究以羅非魚頭為原料，制備純化的TH-LCB，以人白血病K562細(xì)胞為細(xì)胞模型，初步探討了不同質(zhì)量濃度TH-LCB對K562細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡率及Caspse-3蛋白表達(dá)量的影響，為開發(fā)靶向治療白血病的天然抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人慢性髓源白血病癌細(xì)胞系K562細(xì)胞株 中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。

羅非魚頭 海南泉溢食品有限公司；胎牛血清、青霉素、鏈霉素、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）和RPMI1640培養(yǎng)基 美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜和鹽酸阿霉素 美國Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿 美國Thermo Scientif i c公司；細(xì)胞周期試劑盒、Annexin V細(xì)胞凋亡試劑盒 德國Merck Millipore公司；Caspase-3抗體美國Cell Signaling公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒碧云天生物技術(shù)研究所；GAPDH抗體 杭州賢至科技公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；MuseTM細(xì)胞分析儀 德國Merck Millipore公司；多功能酶標(biāo)儀、細(xì)胞計(jì)數(shù)器、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀 美國伯樂公司；低溫離心機(jī) 美國Sigma公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱 美國Thermo Scientif i c公司。

1.3 方法

1.3.1 TH-LCB的分離純化

1.3.1.1 羅非魚頭總脂的提取

羅非魚頭用組織搗碎機(jī)打漿，真空凍干。稱取100 g干燥樣品，剪碎加入1 000 mL無水乙醇超聲提取1.5 h，重復(fù)提取3 次，超濾取濾液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至浸膏狀（45 ℃）；以氯仿-甲醇-水（8∶4∶3，V/V）混懸，渦旋混合1 min，25 ℃、4 000 r/min離心10 min，棄上清液，收集下層有機(jī)相；有機(jī)相中加入20%體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9% NaCl溶液，渦旋混合1 min，離心（條件同上）棄上清液，將下層有機(jī)相真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干[12-13]。

1.3.1.2 羅非魚頭總脂的硅膠柱層析分離

羅非魚頭脂質(zhì)經(jīng)中壓純化與制備系統(tǒng)硅膠柱層析進(jìn)行分離。總脂溶解于少量氯仿，連接到中壓純化與制備系統(tǒng)硅膠柱，用不同極性的有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫，得到不同極性的洗脫組分。洗脫條件：進(jìn)樣量2 mL，進(jìn)樣質(zhì)量濃度20～30 mg/mL，流速10 mL/min，檢測波長205 nm，監(jiān)測波長210 nm。分別用氯仿、丙酮和甲醇進(jìn)行洗脫，得到氯仿（組分1）、丙酮（組分2）和甲醇洗脫物（組分3），真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干。

1.3.1.3 羅非魚頭不同極性脂質(zhì)的薄層層析

羅非魚頭脂質(zhì)的分布：展開系統(tǒng)：正己烷、乙醚、甲醇、乙酸混合液（90∶20∶5∶2，V/V）；顯色劑：碘蒸氣。將1.3.1.2節(jié)洗脫得到的氯仿洗脫物、丙酮洗脫物、甲醇洗脫物和羅非魚頭總脂分別進(jìn)行展開。將樣品點(diǎn)樣在薄層硅膠板上，點(diǎn)樣量約10 μL，將薄層板放入密閉的展開系統(tǒng)中，待溶劑遷移至硅膠板距上邊沿1 cm處，取出硅膠板揮干溶劑，放入碘蒸氣中顯色數(shù)秒，取出拍照。

丙酮洗脫物的檢識(shí)：展開系統(tǒng)：氯仿、甲醇、乙酸混合液（65∶15∶2，V/V）；顯色劑：莫氏試劑（15%α-萘酚、乙醇、硫酸、乙醇、水混合液，10.5∶6.5∶40.5∶4，V/V）。具體操作同上，丙酮洗脫物在展開溶劑中展開后，將薄層板浸沒在莫氏試劑中數(shù)秒，110 ℃烘箱中加熱顯色5 min，觀察顯色情況[14-15]。

1.3.2 TH-LCB的制備

1.3.2.1 糖脂的皂化

將濃縮的糖脂粗提物溶解于100 mL 0.4 mol/L KOH-CH3OH溶液，37 ℃水浴2 h；冷卻后加入100 mL水，在冰浴中用1 mol/L HCl溶液將pH值調(diào)至6。然后用100 mL氯仿萃取3 次，收集下層有機(jī)相。合并有機(jī)相減壓濃縮至干。

1.3.2.2 糖脂的水解

皂化后的糖脂中加入100 mL 10% HCl-CH3OH溶液，密封置于70 ℃水浴反應(yīng)18 h；用100 mL正己烷萃取3 次，收集下層甲醇相，用氨水將pH值調(diào)至7，減壓濃縮至干；用100 mL蒸餾水混懸，并用100 mL乙酸乙酯萃取3 次，將乙酸乙酯相減壓濃縮至干即得TH-LCB粗品（淡黃色粉末）。

1.3.3 TH-LCB的純化

1.3.3.1 HP-20大孔樹脂吸附

將大孔樹脂裝入層析柱（1.8 cm×30 cm）中，制備的TH-LCB粗品溶解于1 mL甲醇，濕法上樣；首先用甲醇（1 mL/min）洗脫2 個(gè)柱體積；接著用丙酮洗脫，以除去色素和未水解的脂質(zhì)；收集丙酮洗脫液，減壓濃縮至干。

1.3.3.2 TH-LCB的硅膠柱層析

將吸附后的甲醇洗脫物溶解于少量氯仿，用氯仿和甲醇以一定體積比進(jìn)行線性洗脫。洗脫條件：流速10 mL/min，檢測波長210 nm，檢測波長230 nm，使用氯仿-甲醇（體積比由22∶1變?yōu)?8∶1）進(jìn)行線性洗脫，根據(jù)紫外檢測器下的洗脫峰進(jìn)行收集[16]。

1.3.4 TH-LCB的薄層層析

展開系統(tǒng)：氯仿、甲醇、氨水混合液（40∶10∶1，V/V）；顯色劑：2%茚三酮-乙醇溶液（0.1 g茚三酮溶解于50 mL乙醇）。當(dāng)溶劑遷移到硅膠板9 cm處時(shí)，取出薄層板，待溶劑揮干，浸沒入顯色劑中數(shù)秒，110℃烘箱中顯色5 min，觀察顯色情況[17]。

1.3.5 TH-LCB對K562細(xì)胞增殖的影響

收集對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，吸取10 μL細(xì)胞懸液加入細(xì)胞檢測板，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至6×104個(gè)/mL，接種于96 孔板，每孔90 μL，培養(yǎng)24 h；實(shí)驗(yàn)設(shè)置對照組、TH-LCB組和鹽酸阿霉素對照組，每孔給相應(yīng)質(zhì)量濃度的藥物10 μL，使TH-LCB終質(zhì)量濃度為25、50、100、200 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)重復(fù)。分別培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，每孔加入三聯(lián)溶解液100 μL，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，在酶標(biāo)儀上于570 nm波長處測定各孔的吸光度A570nm。按照下式計(jì)算細(xì)胞存活率。同時(shí)TH-LCB對K562細(xì)胞增殖抑制作用也可用半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）表示。TH-LCB的IC50通過SPSS 20.0軟件計(jì)算。

式中：A實(shí)驗(yàn)組、A對照組分別表示給藥組、對照組的吸光度。

1.3.6 TH-LCB對K562細(xì)胞凋亡率的影響

對數(shù)生長期的K562細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的TH-LCB處理后，冰上收集細(xì)胞，4℃、1 000 r/min離心5 min棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2 遍，離心，加培養(yǎng)基重懸，使細(xì)胞濃度達(dá)到5×105個(gè)/mL；在新的EP管中加100 μL細(xì)胞懸液，再加100 μL細(xì)胞凋亡試劑，在室溫下培養(yǎng)20 min；渦旋振蕩，用MuseTM細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測，重復(fù)3 次。

1.3.7 TH-LCB對K562細(xì)胞周期的影響

將900 μL細(xì)胞懸液（6×104個(gè)/mL）接種于24 孔板，培養(yǎng)24 h后，用不同質(zhì)量濃度TH-LCB處理細(xì)胞24 h，每孔100 μL，TH-LCB的終質(zhì)量濃度為25、50、100、200 μg/mL。根據(jù)細(xì)胞周期試劑盒的說明書，冰上收集TH-LCB處理后的細(xì)胞，4℃、1 000 r/min離心5 min，吸棄培養(yǎng)液；用預(yù)冷的PBS洗滌2 遍，離心去上清液；分別加入冰的70%乙醇混懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到5×105個(gè)/mL；在-20 ℃下固定至少3 h，在1.5 mL EP管中加入200 μL固定的細(xì)胞，離心后去上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌2 遍，離心；每個(gè)EP管中加入200 μL細(xì)胞周期試劑，在室溫下黑暗培養(yǎng)30 min，用MuseTM細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測，重復(fù)3 次。

1.3.8 TH-LCB對K562細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)量的影響

對數(shù)生長期的K562細(xì)胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度的TH-LCB處理后，冰上收集細(xì)胞；用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，通過BCA試劑盒測定各組的蛋白質(zhì)量濃度，將細(xì)胞濃度調(diào)整一致；蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，然后用含5%的脫脂乳粉的TBST溶液封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST溶液漂洗3 遍，每次15 min，二抗37 ℃孵育1 h，TBST溶液漂洗3 遍，用顯色劑ECL試劑盒顯色。以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算Caspase-3蛋白的表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以的形式表示。各處理組間比較采用單因素方差分析，P＜0.01，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚頭不同極性脂質(zhì)的分離及薄層檢識(shí)結(jié)果

羅非魚頭經(jīng)無水乙醇超聲提取后，通過萃取和鹽析去除水溶性組分和蛋白質(zhì)。由于不同脂質(zhì)在固定相和流動(dòng)相上吸附與解吸附能力不同，將羅非魚頭總脂進(jìn)行硅膠柱分離，以硅膠為吸附介質(zhì)，用不同極性的溶劑洗脫，得到不同極性的脂質(zhì)。如圖1A所示，根據(jù)紫外檢測器下的洗脫峰進(jìn)行收集，氯仿洗脫出現(xiàn)第1個(gè)洗脫峰，收集得到極性最小的組分1；丙酮洗脫出現(xiàn)第2個(gè)洗脫峰，收集得到極性較大的組分2；甲醇洗脫出現(xiàn)第3個(gè)洗脫峰，收集得到組分3。

圖1 羅非魚頭總脂的硅膠柱層析圖譜和不同組分的薄層層析圖Fig.1 Silica gel column chromatography of total lipids from tilapia head and TLC analysis of lipid fractions

在同一展開系統(tǒng)下，不同極性脂質(zhì)在薄層板上的展開距離不同。極性較小的脂質(zhì)，硅膠對其吸附能力弱，展開距離較短。羅非魚頭不同極性脂質(zhì)在碘蒸氣下顯色的結(jié)果如圖1B所示。沿著薄層板，極性大的組分3保留在原點(diǎn)，極性較大的組分2靠近原點(diǎn)，極性小或無極性的組分1遷移距離相對較大。從圖1B可以看出，經(jīng)過硅膠柱層析，不同極性的羅非魚頭脂質(zhì)分離效果較好。組分2的檢識(shí)結(jié)果如圖1C所示，組分2在莫氏試劑顯色下呈紅紫色斑點(diǎn)。因?yàn)樘腔跐饬蛩嶙饔孟拢撍煽啡┘翱啡┭苌?，后者能與α-萘酚（莫氏試劑）生成紫紅色物質(zhì)。因此可以判斷組分2是糖脂，可以用于后續(xù)的研究。

2.2 TH-LCB的硅膠柱層析及薄層色譜檢識(shí)結(jié)果

糖脂的水解方式主要有酸水解和堿水解，二者的水解產(chǎn)物有較大差別，堿水解的水解程度較低，所得的長鏈堿含量少，但其他非長鏈堿雜質(zhì)含量少；酸水解對糖脂的水解比較完全，所得含量較高，組成復(fù)雜，為了保證TH-LCB的得率，使用10% HCl-CH3OH溶液對羅非魚頭糖脂進(jìn)行酸水解，從而得到TH-LCB；TH-LCB經(jīng)過大孔樹脂吸附，去除色素等雜質(zhì)；然后將TH-LCB經(jīng)過硅膠柱層析進(jìn)行純化。硅膠柱層析圖譜（圖2A）表明，洗脫時(shí)間為10 min，出峰時(shí)間為1.0～4.5 min。收集紫外檢測器下的洗脫峰即脫除部分雜質(zhì)的TH-LCB組分。洗脫的雜質(zhì)可能是腦苷脂水解不完全而產(chǎn)生的神經(jīng)酰胺以及TH-LCB與糖結(jié)合產(chǎn)生的產(chǎn)物。

圖2 TH-LCB的硅膠柱層析譜圖（A）及薄層層析圖（B）Fig.2 Silica gel column chromatography (A) and TLC (B)analysis of TH-LCB

如圖2B所示，TH-LCB采用薄層層析檢識(shí)，顯色結(jié)果為紫紅色斑點(diǎn)，其比移值為0.32。特征顯色結(jié)果表明TH-LCB為鞘氨醇類化合物。這一結(jié)果與馮婷玉[17]的結(jié)果相似，可初步判斷皂化水解得到的組分是TH-LCB。另外，茚三酮顯色結(jié)果表明，紫紅色斑點(diǎn)清晰，無其他斑點(diǎn)，說明制備TH-LCB純度較高，雜質(zhì)較少，糖脂水解完全。

2.3 TH-LCB對K562細(xì)胞形態(tài)的影響

圖3 TH-LCB對K562細(xì)胞形態(tài)的影響（200×）Fig.3 Morphological change of K562 cells after treatment with different concentrations of TH-LCB (200 ×)

如圖3所示，正常對照組K562細(xì)胞生長狀態(tài)良好，邊緣光滑清晰，細(xì)胞透明、大小均一，細(xì)胞核完整均勻；細(xì)胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度TH-LCB作用24 h后，K562的生長增殖受到抑制，細(xì)胞密度明顯減少，細(xì)胞形態(tài)大小不一，發(fā)生了明顯的形態(tài)改變，細(xì)胞碎片增多，碎片呈小片狀。當(dāng)TH-LCB的質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，細(xì)胞生長增殖被顯著抑制，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化。Sugawara等[7,18]的研究表明，小麥粉長鏈堿和海參長鏈堿可使細(xì)胞核凝聚，染色質(zhì)碎片化，從而引起人結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞形態(tài)的變化。

2.4 TH-LCB對K562細(xì)胞增殖的抑制作用

圖4 TH-LCB對K562細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Viability of K562 cells after treatment with various concentrations of TH-LCB

由圖4可知，隨著TH-LCB質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞增殖受到顯著抑制，呈明顯的劑量依賴效應(yīng)。TH-LCB作用于K562細(xì)胞24 h和48 h后的IC50分別為42.207、39.494 μg/mL。MTT測定結(jié)果表明，TH-LCB顯著地抑制細(xì)胞增殖活性。杜磊[19]發(fā)現(xiàn)了海參和海星長鏈堿顯著抑制S180、HepG2、Caco-2和HGC-27等腫瘤細(xì)胞的增殖活性，呈明顯的劑量依賴性。Sugawara等[7]發(fā)現(xiàn)花刺參長鏈堿可以顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD-1、WiDr和Caco-2的生長增殖，且呈明顯的劑量依賴效應(yīng)。還有研究證明海綿長鏈堿可以顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞（U87）和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）的增殖活性[20]。

2.5 TH-LCB誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡

圖5 TH-LCB對K562細(xì)胞凋亡率的影響Fig.5 Apoptosis rates of K562 cells after treatment with various concentrations of TH-LCB

由圖5可知，早期凋亡細(xì)胞指Annexin-PE（+）和Dead Cell Marker（-）的細(xì)胞群；晚期凋亡細(xì)胞是指Annexin-PE（+）和Dead Cell Marker（+）的細(xì)胞群；總凋亡率為早期凋亡率與晚期凋亡率的總和。結(jié)果表明，TH-LCB顯著增加K562細(xì)胞的凋亡率，呈劑量依賴效應(yīng)。當(dāng)TH-LCB為25 μg/mL時(shí)，細(xì)胞凋亡主要是早期凋亡，隨著TH-LCB質(zhì)量濃度的增加，晚期凋亡的細(xì)胞群也逐漸增加，總凋亡率也逐漸增加。當(dāng)TH-LCB質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞幾乎全部凋亡。流式細(xì)胞儀的結(jié)果表明：TH-LCB抑制K562細(xì)胞的增殖是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。另外，當(dāng)TH-LCB質(zhì)量濃度高時(shí)，K562細(xì)胞存活率較低，細(xì)胞碎片化程度高，會(huì)影響流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果。Aida等[8]的研究表明，植物和真菌長鏈堿能誘導(dǎo)人類結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞凋亡。Hossain等[9]發(fā)現(xiàn)從海參中提取的長鏈堿可以通過提高DR5和降低p-AKT的蛋白表達(dá)，來誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡。Hung等[21]研究了鞘氨醇和其他長鏈堿通過激活Caspases來誘導(dǎo)人肝癌Hep3B細(xì)胞凋亡。本研究進(jìn)一步證明了TH-LCB能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來抑制細(xì)胞的增殖活性。

2.6 TH-LCB對K562細(xì)胞周期的影響

圖6 不同質(zhì)量濃度TH-LCB對K562細(xì)胞周期影響的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果Fig.6 Flow cytometric cell cycle analysis of K562 cells after treatment with various concentrations of TH-LCB

表1 不同質(zhì)量濃度TH-LCB對K562細(xì)胞周期的影響Table1 Effect of TH-LCB on cell cycle of K562 cells

細(xì)胞周期的調(diào)控在細(xì)胞增殖和凋亡過程中起著重要的作用。細(xì)胞周期可分為G0/G1、S、G2/M 3 個(gè)階段，其中G0/G1期是細(xì)胞進(jìn)行大量物質(zhì)合成的時(shí)期，為DNA的合成做準(zhǔn)備，在S期細(xì)胞完成DNA的復(fù)制及合成組蛋白，G2/M期是指DNA復(fù)制結(jié)束和開始有絲分裂的間隙[22-23]。在正常G0/G1期前出現(xiàn)一個(gè)DNA低染細(xì)胞群，稱為“sub-G0/G1”，即凋亡峰，該凋亡峰的大小代表凋亡細(xì)胞的多少。K562細(xì)胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度TH-LCB處理24 h后，檢測結(jié)果如圖6和表1所示，隨著TH-LCB質(zhì)量濃度的增加，sub-G0/G1（凋亡峰）呈上升趨勢，且S期的細(xì)胞群逐漸減少。細(xì)胞周期結(jié)果表明TH-LCB可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡。Ahn等[24]通過流式細(xì)胞儀測定鞘氨醇?jí)A作用結(jié)腸癌細(xì)胞后，sub-G0/G1期的細(xì)胞群逐漸增多，且將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。

2.7 TH-LCB對Caspase-3蛋白表達(dá)量的影響

圖7 TH-LCB對K562細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of TH-LCB on expression of caspase-3 in K562 cells

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖7）表明，0、25、50、100、200 μg/mL TH-LCB處理K562細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01），呈劑量依賴性。進(jìn)一步證明TH-LCB對K562細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用。Caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵酶和執(zhí)行者，處于細(xì)胞凋亡的下游[25]。經(jīng)典凋亡通路主要有：Bcl-2家族成員介導(dǎo)的線粒體凋亡通路和死亡受體通路，兩者都是通過激活下游的Caspase-3促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在死亡受體通路中，死亡信號(hào)的傳導(dǎo)依賴于靶細(xì)胞表面的死亡配體與攜帶凋亡信號(hào)的受體的專一性結(jié)合，并迅速將凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，激活下游的Caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26-27]。在線粒體途徑中，細(xì)胞受到凋亡刺激后，線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素c迅速從線粒體釋放到胞漿，細(xì)胞色素c、Apaf-1、dATP和Caspase-9酶原結(jié)合形成凋亡多聚復(fù)合物[28]，激活Caspase-9，接著激活下游的Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡[29-30]。但TH-LCB對K562細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)是通過死亡受體通路還是通過線粒體凋亡通路？還有待于進(jìn)一步的研究。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑提取法，從羅非魚頭中提取總脂，除雜后經(jīng)硅膠柱分離得到糖脂；接著進(jìn)行糖脂的皂化、酸水解，得到TH-LCB；最終經(jīng)過硅膠柱線性洗脫和大孔樹脂脫色，得到純化后的TH-LCB。純化后的TH-LCB經(jīng)薄層層析檢識(shí)，得到清晰單一的紅紫色斑點(diǎn)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究了TH-LCB對K562細(xì)胞的形態(tài)、增殖活性、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡率、Caspase-3蛋白表達(dá)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TH-LCB質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)細(xì)胞形態(tài)已發(fā)生明顯的變化；TH-LCB作用于K562細(xì)胞24 h和48 h后的IC50分別為42.207、39.494 μg/mL；經(jīng)流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果顯示，隨著TH-LCB質(zhì)量濃度的升高，K562細(xì)胞凋亡率逐漸上升，其sub-G0/G1（凋亡峰）也逐漸升高；Western blot結(jié)果顯示，TH-LCB處理K562細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的蛋白表達(dá)量上升，呈劑量依賴效應(yīng)。

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