濃縮血小板產(chǎn)品在創(chuàng)傷外科應(yīng)用中的問題與思考

程 飚

創(chuàng)傷始終伴隨人類社會的發(fā)展過程，創(chuàng)傷外科的治療概念也始終在不斷的發(fā)展和進步，再生醫(yī)學(xué)給創(chuàng)傷外科的組織或器官理想修復(fù)帶來無限的遐想。當(dāng)前再生醫(yī)學(xué)的研究熱點多集中在干細(xì)胞、組織工程等方面，作為再生醫(yī)學(xué)構(gòu)成的重要部分——生物活性因子，理應(yīng)受到更大的關(guān)注，它不僅直接參與(干)細(xì)胞增殖、遷移、分化活動，并與組織工程材料血管化、微環(huán)境緊密相關(guān)。生物活性因子種類繁多，目前臨床上使用的人工合成生物活性因子多僅限于外用，體內(nèi)應(yīng)用的安全性尚無定論，且生物效應(yīng)單一，缺乏“綜合”、“瀑布式”的效果。體內(nèi)本身存在一種可釋放多種生物學(xué)活性物質(zhì)的細(xì)胞——血小板，當(dāng)其濃縮后再活化所產(chǎn)生的多重生物學(xué)效用更加顯著，越來越受到創(chuàng)傷組織與再生領(lǐng)域?qū)W者們的青睞與關(guān)注[1]。

血小板作為一種分泌型細(xì)胞，平時處于休眠狀態(tài)，當(dāng)組織受損后，其首先在損傷部位發(fā)生聚集，隨后形態(tài)改變，通過胞吐方式釋放顆粒，包含多種活性物質(zhì)。既往人們關(guān)注的是血小板在血栓和止血中的作用。近些年來研究發(fā)現(xiàn)，除傳統(tǒng)的止凝血作用，血小板釋放的活性物質(zhì)還參與體內(nèi)組織損傷修復(fù)和再生的過程。特別是集中在生長因子方面，主要包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血小板衍生生長因子(plateletderived growth factor,PDGF)、胰島素樣生長因子-Ⅰ(insulin-likegrowth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)等。隨著人們對血小板在組織修復(fù)中所扮角色的深入認(rèn)識，事實上發(fā)現(xiàn)，它可分泌十幾類上百種的活性分子，如趨化因子(chemokines)、細(xì)胞因子(cytokines)、細(xì)胞骨架蛋白(cytoskeletal proteins)、氧化應(yīng)激酶(如NADPH)等，甚至凋亡蛋白。這些產(chǎn)物激活炎癥細(xì)胞(巨噬細(xì)胞等)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等，不僅促進壞死組織的降解和移除，而且參與新生組織的再生調(diào)控[2]。而血小板體外濃縮后再應(yīng)用時以上這些作用更加顯著[1]。

1 有關(guān)濃縮血小板的命名與定義

目前有關(guān)濃縮血小板的命名紛繁復(fù)雜[3]，較為流行的如富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)和富血小板纖維蛋白(platelet rich fibrin,PRF)，甚至被人為的定義為一代、二代產(chǎn)品。另外，還有濃縮生長因子(concentrate growth factors，CGF)、富血小板濃縮液(platelet-rich concentrate,PRC)、濃縮的富血小板血漿(concentrated platelet-rich plasma,cPRP)、富集血小板血漿(platelet-enriched plasma,PeRP)、血小板膠(platelet gel， PG)、血小板釋放生長因子(platelet-released growth factors,PRGF)、富含生長因子的血漿(plasma rich in growth factors,PRGF)、改進型PRF(advanced PRF,A-PRF)、含白細(xì)胞的富血小板血漿或纖維蛋白(leukocyte- and platelet-rich plasma/fibrin,L-PRP/L-PRF)(leucocyte-platelet-rich)、純富血小板血漿或纖維蛋白(pure platelet-rich plasma /fibrin,P-PRP/ P-PRF)。諸多的稱謂不利于濃縮血小板在臨床上廣泛、合理和科學(xué)使用。

首先，各類濃縮血小板產(chǎn)品所含生物活性成分(特別是生長因子)的濃度相差幾倍甚至更高。PRP最早出現(xiàn)在1965年，當(dāng)時關(guān)注的是血小板吞噬與聚合作用。因此，PRP的定義依然停留在20世紀(jì)60年代，將超過血液中血小板均值3～5倍的濃縮血小板稱為PRP，更有人將其設(shè)定為6～8倍。應(yīng)該說，伴隨濃縮血小板濃度、活性與功能關(guān)系的深入認(rèn)識，這一概念明顯滯后，也不夠嚴(yán)謹(jǐn)。諸多研究顯示，不同濃度血小板在不同細(xì)胞和組織中的作用迥異。當(dāng)前所用濃縮血小板產(chǎn)品應(yīng)該是單位體積(每mL)條件下，功能完備的血小板數(shù)量(number of platelets/mL)≥106才能發(fā)揮強大的組織修復(fù)與再生作用。濃度只是眾多問題中的一部分。

另一方面，不同的制備方法得到的濃縮血小板產(chǎn)品所包含的活性成分和生物學(xué)效用大相徑庭。所涉及的不僅僅是所含生物活性產(chǎn)物構(gòu)成比，且立體的分子構(gòu)象千差萬別，發(fā)揮的生物學(xué)作用也各有千秋[4]。傳統(tǒng)的PRP血漿成分中的纖維素、纖連蛋白及粘連蛋白是良好的細(xì)胞黏附分子，可作為生長因子的載體應(yīng)用于某些特定類型損傷的修復(fù)。而PRF與傳統(tǒng)的PRP四分子結(jié)構(gòu)不同，多經(jīng)過緩慢自然聚合，產(chǎn)生纖維蛋白為三分子立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其凝膠組織較為疏松、孔隙大、彈性高，有利于組織細(xì)胞及循環(huán)血中的干細(xì)胞快速長入，細(xì)胞/生長因子被大量的滯留，并與纖維蛋白發(fā)生化學(xué)鍵結(jié)合。PRF的纖維蛋白構(gòu)成(干)細(xì)胞附著、遷移，以及分化提供所需的微環(huán)境，并能充分發(fā)揮多因子間的協(xié)同作用。PRF纖維蛋白基質(zhì)內(nèi)所含免疫細(xì)胞的數(shù)量調(diào)控炎癥反應(yīng)。CGF則富含紅細(xì)胞、血小板以及鐵、鈣和其他基本元素，多制備1～2mm的微粒用于組織受損后的缺損與腔隙，起著充填、支撐作用，也可用于粘合傷口。在組織工程中，CGF可加速移植生物材料的融合與重塑，減少感染機會，其獨特的三維結(jié)構(gòu)充分發(fā)揮所含生長/細(xì)胞因子的協(xié)同效用，纖維蛋白原和纖維蛋白降解產(chǎn)物可促進中性粒細(xì)胞的遷移，并參與噬菌、免疫調(diào)控和酶降解過程。同時，在組織損傷時，不僅引導(dǎo)損傷組織的再血管化、免疫調(diào)控，還能捕獲循環(huán)血中的干細(xì)胞，參與組織修復(fù)與再生，甚至與其他生物材料混合后，參與組織損傷后再生微環(huán)境的構(gòu)成。

隨著對影響濃縮血小板產(chǎn)品中血小板數(shù)量因素、活化后成分構(gòu)成差異、空間構(gòu)造和不同功能認(rèn)識的深入，以及其應(yīng)用范圍和模式不斷拓展與改變，對濃縮血小板治療技術(shù)應(yīng)有全面創(chuàng)新性的思考。以往眾多的命名各有特點，但都離不開“濃縮”“富集”的基礎(chǔ)，針對不同組織(骨、軟骨、肌肉、脂肪、皮膚等)、不同目的(增殖、遷移、促分化、充填/支架、血管化、吞噬、氧化-還原應(yīng)激)可能需要不同形式的濃縮血小板，因此稱之為濃縮血小板治療(enriched platelet therapy or enriched platelet treatment,EPT)技術(shù)更為合理[5]。作為這項治療技術(shù)，PRP、PRF、濃縮生長因子(CGT)等都是它的內(nèi)涵，且可根據(jù)組織損傷后修復(fù)所需啟動的信號通路和關(guān)鍵蛋白，選擇合適形式的濃縮血小板產(chǎn)品(是否含中性粒細(xì)胞或淋巴，是否外源或體內(nèi)激活等)，對進一步豐富治療手段，提高臨床治療效果具有重大意義。

2 創(chuàng)傷外科應(yīng)用中濃縮血小板可能涉及的機制

骨組織損傷后，濃縮血小板中的多種生長因子具有促骨干細(xì)胞的增殖，以及間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移與轉(zhuǎn)化；增加Ⅰ、Ⅲ膠原表達，促進骨骼系統(tǒng)再生[6]。同時，濃縮血小板血漿凝膠結(jié)構(gòu)為大量的纖維交織，其所形成的支架含大量孔隙，且彼此相通，孔徑為200～1 000μm，孔隙率80%，對于制備骨的組織工程支架材料十分有益。軟骨組織受損后，自身再生修復(fù)能力極弱[7]。濃縮血小板所含豐富的生長因子及其組織再生的“必備因子”，可為軟骨細(xì)胞生存提供良好微環(huán)境，促進軟骨再生[8]，甚至對椎間盤的損傷后再生有較好的作用。肌肉組織受損后，不同濃縮血小板產(chǎn)品(PRP和PRF)可促進肌肉干細(xì)胞增殖分化，維持其多能性；募集、激活和動員衛(wèi)星細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，促進成肌細(xì)胞分化及血管生成，加速損傷部位愈合，并提高收縮強度，加速肌肉恢復(fù)，并在膠原降解沉積過程中發(fā)揮作用[9]。濃縮血小板治療肌腱損傷的機制可能涉及通過氧化應(yīng)激產(chǎn)生短暫的炎癥反應(yīng)、啟動再生信號通路；刺激肌腱細(xì)胞外基質(zhì)分子基因表達，直接促進肌腱細(xì)胞分化和血管生成；激活并募集外周循環(huán)來源的干細(xì)胞；增強血管化和代謝活性；促進干細(xì)胞向肌腱細(xì)胞的分化并增強肌腱組織生物力學(xué)性能。但肌腱修復(fù)所需最佳血小板濃度和白細(xì)胞組分參與與否尚無明確定論，不同臨床試驗的結(jié)果迥異[10]。神經(jīng)組織損傷后，濃縮血小板具有提高神經(jīng)特異性烯醇和膜相關(guān)蛋白-2、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子、突觸蛋白的作用，可促進脂肪干細(xì)胞向神經(jīng)分化；血漿及細(xì)胞因子和多種蛋白質(zhì)可營養(yǎng)神經(jīng)；直接促進雪旺氏細(xì)胞增殖，促進其分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子和膠質(zhì)細(xì)胞營養(yǎng)因子，加速神經(jīng)修復(fù)；一些生長因子可直接促進軸突生長與再生、大腦皮質(zhì)和脊髓生長[11]。當(dāng)皮膚損傷后，濃縮血小板釋放的多種蛋白質(zhì)可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，促進傷口修復(fù)啟動、皮膚成纖維細(xì)胞增殖與分化、肉芽組織增生、傷口收縮、血管增殖與遷移，有助于新血管生成；提高膠蛋白和纖連蛋白表達，抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解，激活大量的纖維蛋白構(gòu)成皮膚支架，是維持細(xì)胞增殖生長的必要條件；促進角質(zhì)形成細(xì)胞周期蛋白和周期素依賴蛋白激酶表達，加速再上皮化，具有一定的抗感染能力[12]；甚至有希望利用濃縮血小板將皮膚的修復(fù)向完美再生過渡，生成的皮膚不僅僅是覆蓋的結(jié)構(gòu)，而且有分泌和代謝(汗腺、皮脂腺等)的功能[13]。

特別要提出的是其對神經(jīng)的作用不僅僅表現(xiàn)在對促進神經(jīng)自身的修復(fù)與再生，而且能降低受損組織的神經(jīng)過度興奮，控制與恢復(fù)受損區(qū)域神經(jīng)軸突再生，使受損靶器官(骨、軟組織等)接受神經(jīng)再支配，調(diào)控這些組織損傷后的修復(fù)再生過程[14]。而新血管形成是所有組織損傷后修復(fù)、組織工程再血管化以及再生醫(yī)學(xué)的必要步驟。所有組織損傷時，血管內(nèi)皮細(xì)胞都會誘發(fā)血小板的聚集與活化，啟動后續(xù)一系列生物學(xué)活動。濃縮血小板通過釋放各種促血管形成的生長因子(PDGF、VEGF、bFGF等)和細(xì)胞因子(IL-8、IL-3、αvβ3-integrin 212等)，以及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)，相互協(xié)調(diào)完成新血管形成。機制包括：促使血管基膜降解，內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，血管腔形成，基膜重排以及外周或血管平滑肌細(xì)胞募集，周細(xì)胞的增殖、遷移，血管壁成熟。構(gòu)成新血管形成所需的微環(huán)境，募集和調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞。在組織工程材料方面，濃縮的血小板具有促間充質(zhì)干細(xì)胞增殖但不引起分化的優(yōu)勢[15]。

以上資料顯示，在組織損傷修復(fù)中，濃縮血小板發(fā)揮作用的機制可能包括：殺菌、調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞，啟動免疫反應(yīng)；調(diào)控修復(fù)(干)細(xì)胞的增殖、分化和遷移，以及凋亡過程；維持毛細(xì)血管上皮細(xì)胞完整性、有助于新血管形成；調(diào)控干細(xì)胞再生微環(huán)境、改變組織修復(fù)信號蛋白的濃度，影響信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，適用于所有創(chuàng)傷外科領(lǐng)域，如矯形外科、運動醫(yī)學(xué)、神經(jīng)外科、心胸外科、泌尿外科、口腔頜面外科、耳鼻喉、眼科、整形美容外科[16]，尤其是當(dāng)前熱門的組織工程和再生醫(yī)學(xué)。

3 濃縮血小板產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化問題

濃縮血小板產(chǎn)品表現(xiàn)出的越來越多生理功能，在各創(chuàng)傷領(lǐng)域也表現(xiàn)出一大批可喜的治療結(jié)果。但有部分臨床試驗顯示，運用濃縮血小板產(chǎn)品修復(fù)組織缺損的作用并不顯著。既然血小板是一種分泌型細(xì)胞，那么其應(yīng)用屬于生物細(xì)胞治療的一部分，這就存在所有細(xì)胞治療所面臨的共同問題，即標(biāo)準(zhǔn)化。每一次濃縮血小板產(chǎn)品的制備條件都會影響血小板的活化與功能[17]?？赡艿脑虬ǎ核醒“鍧饪s產(chǎn)品中活性物質(zhì)(包括生長因子、黏附分子、趨化因子等)含量的多少取決于其在血小板活化時的釋放情況。涉及研究人員及臨床工作者制備標(biāo)準(zhǔn)(離心速度、時間)、提取、純化技術(shù)的差異，以及所導(dǎo)致不同的血小板濃度比和血小板活化及碎裂程度的客觀因素(溫度、耗材等)。另外，特殊人群(年齡、貧血、代謝性疾病等)、服用藥物(阿司匹林等)情況對血小板功能本身有影響，其濃縮后的生物學(xué)效用差別極大[18]，如濃縮血小板激活產(chǎn)生大量的纖維蛋白支架的硬度與血小板數(shù)量非線性關(guān)系，且對間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生不同的影響。

即使限定血小板在血漿中的相對數(shù)量，也會由于生理周期的變化、制備條件導(dǎo)致濃縮血小板所含活性物質(zhì)的差異。另外，白細(xì)胞所占比例、血小板活化時釋放的細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicleis,EV)情況、各類生長因子含量的構(gòu)成比，以及其他很多活性成分(如thrombin)都影響著最終參與修復(fù)時啟動信號通路和活化蛋白的差異。各類修復(fù)細(xì)胞對不同濃度和質(zhì)量血小板的反應(yīng)并不相同。選擇性激活濃縮血小板達到對修復(fù)組織的要求，即構(gòu)建合理的微環(huán)境十分必要。更為關(guān)鍵的是，目前并不知道EPT完整作用的分子機制。對于濃縮血小板注射應(yīng)用時可能會導(dǎo)致局部組織的炎癥，如何減少或合理控制尚待進一步探討。因此，致力于濃縮血小板研究的學(xué)者們應(yīng)盡早制定一份關(guān)于EPT臨床使用的專家共識或指南，規(guī)范濃縮血小板產(chǎn)品的制備、儲存與轉(zhuǎn)運，不同組織使用和治療時的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，并不斷在深入研究中完善。國際和國內(nèi)相關(guān)機構(gòu)當(dāng)前應(yīng)加快進行一些關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)的指導(dǎo)與限定，但由于涉及領(lǐng)域多，既是優(yōu)勢也是弊病，同一材料不可能滿足不同組織修復(fù)的需求。這將是今后一個時期，這項治療手段面臨的重要問題之一。

4 展望

創(chuàng)傷外科應(yīng)用濃縮血小板產(chǎn)品的優(yōu)勢有：(1)自源性，避免外源性生長因子的免疫排斥和疾病傳染風(fēng)險；(2)制備簡便、快捷、方法成熟，目前市場上有多種儀器和套裝；(3)含多種高濃度生長因子協(xié)同作用，彌補單一因子不足；(4)根據(jù)促生長、充填、支架需要，可選擇不同的濃縮血小板形式；(5)制備對患者損傷小，只需從周圍取血即可；(6)具有抗菌能力，多種成分發(fā)揮抗菌活性；(7)能夠?qū)Πㄑ苌窠?jīng)在內(nèi)的多種組織同步修復(fù)，符合機體的生理需求。特別是近年提出在損傷組織的再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用，避免生物合成多肽應(yīng)用中安全性的顧慮。對于當(dāng)前創(chuàng)傷外科越來越多地使用生物材料(關(guān)節(jié)、骨水泥、殼聚糖、鈦網(wǎng)、硅膠等)，加用濃縮血小板在防止植入物發(fā)生細(xì)菌生物膜、引發(fā)感染，減少手術(shù)失敗方面是有益的[19]。

濃縮血小板在體內(nèi)還是體外激活對修復(fù)細(xì)胞的生物學(xué)行為影響很大，如近年來外泌體(exosome)的研究如火如荼。已有研究表明，血小板活化后所分泌的細(xì)胞外囊泡能釋放兩種微粒，一種是直徑>100nm的多囊泡體(MVBs)和α顆粒，另外一種則是由多囊泡體和α顆粒進一步激活后釋放的直徑40～100nm外泌體，這些細(xì)胞外囊泡對釋放生長因子、炎癥因子、黏附蛋白、信號通路蛋白、micrRNA等成分的構(gòu)成比對濃縮血小板的功能產(chǎn)生巨大影響，進而對細(xì)胞遷移和增殖、加速血管新生、調(diào)控細(xì)胞凋亡和存活，以及細(xì)胞間信號交互發(fā)生改變，顯示出組織修復(fù)和再生過程中各自獨特的生物學(xué)作用[20]。隨著外泌體在再生醫(yī)學(xué)的研究逐漸深入，將外泌體某些指標(biāo)作為濃縮血小板細(xì)胞治療的指標(biāo)，或許是解決細(xì)胞移植標(biāo)準(zhǔn)，使之科學(xué)、合理應(yīng)用于再生修復(fù)領(lǐng)域的重要途徑。另外新近研究表明，濃縮血小板影響周圍血單核細(xì)胞和樹枝狀細(xì)胞的分化，其免疫調(diào)控反應(yīng)對再生微環(huán)境的影響在組織損傷后的修復(fù)過程中不可忽視，甚至對修復(fù)結(jié)局的影響舉足輕重[21-22]。血小板的抗炎和抗菌肽[23]作用可能對當(dāng)前研究熱點——“微生物區(qū)(microbiota)”產(chǎn)生影響，微生物區(qū)可以干預(yù)修復(fù)進程[24-25]。新的激活方式(如超聲波、脈沖電場等)是否會提高濃縮血小板的活性產(chǎn)物釋放，滿足不同層及組織修復(fù)的需要，達到理想的治療效果值得探索[26]。而與新型生物材料聯(lián)合使用可能對濃縮血小板在創(chuàng)傷修復(fù)更廣闊范圍使用中有巨大的推動作用[27]。

總之，劑量(不同的修復(fù)組織或細(xì)胞)、時間(受損時間)、形式(是否激活、是否混合炎癥細(xì)胞、注射或外用)，以及在構(gòu)建組織工程進行創(chuàng)傷修復(fù)與再生時所需的最佳微環(huán)境濃度均是未來要關(guān)注的重點。在提倡精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)(治療)的今天，如何為創(chuàng)傷組織定制一個有益的濃縮血小板產(chǎn)品還需要進行大量的基礎(chǔ)研究和臨床驗證。