柚皮苷與順鉑聯(lián)用對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響

裴 祎，張曉晶，鄭 珂，王 巍，邱恩鐸，李盛龍

0 引言

骨肉瘤是青少年中最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，雖然發(fā)病率較低，但是由于其惡性程度高，預(yù)后差，多發(fā)于青少年，往往會(huì)給家庭和社會(huì)帶來極大的負(fù)擔(dān)。放化療技術(shù)未成熟時(shí)，對(duì)骨肉瘤的治療多采取高位截肢或者關(guān)節(jié)離斷術(shù)，不過仍有80%左右的患者由于肺轉(zhuǎn)移的原因?qū)е律嫫跇O短[1]。隨著各種新型輔助化療藥物的推廣，各種化療手段的應(yīng)用，骨肉瘤的5年生存率顯著提高(60%～80%)。

阿霉素、甲氨蝶呤、順鉑和異環(huán)磷酰胺是目前最常見的骨肉瘤化療藥物。單個(gè)藥物治療骨肉瘤的效率不高，通常采用藥物聯(lián)用的方式，但是由于化療藥物本身的毒副作用，接受化療的患者生存質(zhì)量往往較差，所以，有必要尋找新的藥物來與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，以期降低化療藥物的使用濃度[2-5]。

柚皮苷(Naringin)屬于黃酮類化合物，是蕓香科植物中提取的單體，其廣泛存在于檸檬、葡萄汁和橘子等植物中。柚皮苷具有較強(qiáng)的清除自由基、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎和細(xì)胞保護(hù)作用，且可以抑制多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但是在骨肉瘤中報(bào)道較少[6-8]。

本研究以人骨肉瘤細(xì)胞系MG63為研究對(duì)象，觀察柚皮苷聯(lián)合順鉑對(duì)MG63細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的抑制效果，對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探索，為臨床優(yōu)化骨肉瘤的治療方案提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細(xì)胞株MG63(實(shí)驗(yàn)室凍存)，1640培養(yǎng)基(Invitrogen，美國(guó))，胎牛血清(天津?yàn)螅旖?，柚皮苷(Selleck，美國(guó))，順鉑注射液(貴州漢方制藥有限公司，貴州)，四甲基偶氮唑藍(lán)MTT(碧云天，上海)，0.4 %臺(tái)盼藍(lán)(碧云天，上海)，抗體：cyclin d1、MMP2、GAPDH、二抗(Santa，美國(guó))。

1.2 方法 細(xì)胞培養(yǎng)：將MG63細(xì)胞株用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(含50 IU/mL青霉素，50 IU/mL 鏈霉素)培養(yǎng)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

藥物處理濃度順鉑為臨床常用的化療藥物，根據(jù)體表面積計(jì)算公式S=1.15+(m-30)0.1/5 (其中m>30 kg)計(jì)算出MTT所需藥物濃度，順鉑取中(1×PPC)濃度。參照參考文獻(xiàn)，柚皮苷取20 μg/mL濃度。空白對(duì)照組為NaCl處理組。

MTT實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG63細(xì)胞，以2×104/mL濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，終體積200 μL，細(xì)胞培養(yǎng)12 h貼壁后更換培養(yǎng)基，加入不同濃度藥物，各劑量組及對(duì)照組(NaCl處理組)分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔。處理后的細(xì)胞于0、12、24、36、48 h分別加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃濕潤(rùn)環(huán)境中溫育4 h，棄去孔中的培養(yǎng)基和MTT，在孔中各加入200 μL DMSO，以溶解殘留的MTT-甲臜結(jié)晶，置回37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。15 min后，立即在490 nm處記錄吸光值。藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率計(jì)算公式為：抑制率=1-(劑量組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%。

Transwell實(shí)驗(yàn)：以1×105每孔的密度將細(xì)胞

接種于上室中，下室添加600 μL雙無培養(yǎng)基，12 h后添加不同處理因素。藥物作用24 h后，95%乙醇固定，0.4 %臺(tái)盼藍(lán)染色。200倍顯微鏡下觀察。

Western blot實(shí)驗(yàn)：RIPA裂解藥物處理24 h后的細(xì)胞，取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳(80～130 V)，轉(zhuǎn)膜(100 V，1 h)，5%脫脂奶粉封閉1 h后，一抗4 ℃過夜，二抗室溫1 h，洗膜發(fā)光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同處理因素對(duì)MG63細(xì)胞增殖的影響 分別采用5 μg/mL順鉑、20 μg/mL柚皮苷和5 μg/mL 順鉑+20 μg/mL柚皮苷聯(lián)合作用于MG63細(xì)胞上，隨后于不同時(shí)間點(diǎn)觀察藥物對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，柚皮苷能夠顯著提高順鉑對(duì)MG63細(xì)胞增殖的抑制作用。各組結(jié)果與對(duì)照組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

2.2 不同處理組對(duì)MG63細(xì)胞周期蛋白的影響 如圖1所示，不同藥物處理時(shí)，順鉑和柚皮苷均可以在一定程度上抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin d1，二者協(xié)同作用時(shí)，抑制作用更為明顯。

2.3 不同處理因素對(duì)MG63細(xì)胞遷移的影響 見圖2。分別采用5 μg/mL順鉑、20 μg/mL柚皮苷和5 μg/mL 順鉑+20 μg/mL柚皮苷聯(lián)合作用于MG63細(xì)胞上，隨后于不同時(shí)間點(diǎn)觀察藥物對(duì)細(xì)胞遷移的作用。結(jié)果顯示，柚皮苷能夠顯著提高順鉑對(duì)MG63細(xì)胞遷移的抑制作用。

圖1 不同藥物作用下細(xì)胞周期蛋白的變化

表1 順鉑、柚皮苷單獨(dú)使用以及聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用(%)

注：*與順鉑組比較，P<0.01；#與柚皮苷組比較，P<0.01

圖2 不同藥物作用下細(xì)胞遷移的變化

2.4 不同處理因素對(duì)MG63細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白的影響 如圖3所示，不同藥物處理時(shí)，順鉑和柚皮苷均可以在一定程度上抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白MMP2，二者協(xié)同作用時(shí)，抑制作用更為明顯。

圖3 不同藥物作用下細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白的變化

3 討論

骨肉瘤惡性程度很高，約有1/5的骨性腫瘤為骨肉瘤，好發(fā)于長(zhǎng)骨的干骺端。股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端和肱骨近端尤其好發(fā)。約有近4/5的病例在確診骨肉瘤的時(shí)候已經(jīng)有肺部微小轉(zhuǎn)移灶，肺轉(zhuǎn)移是骨肉瘤患者死亡的主要原因。近年來，隨著各種化療技術(shù)和小分子藥物等不斷研發(fā)，骨肉瘤患者的生存期也有所延長(zhǎng)[9-15]。雖然化療藥物在很大程度上提高了骨肉瘤患者的生存率，但是由于骨肉瘤容易產(chǎn)生耐藥性，手術(shù)后的長(zhǎng)期生存率仍然不高，并且順鉑等化療藥物具有很強(qiáng)的毒副作用，患者可能出現(xiàn)較為嚴(yán)重的消化道反應(yīng)。因此，有必要尋找新的有效的藥物，配合或者取代化療藥物的使用，來提高骨肉瘤患者的生存質(zhì)量。許多天然藥物提取物能夠?qū)δ[瘤起到治療作用，但是效果較差，可配合化療藥物使用。有報(bào)道，柚皮苷對(duì)乳腺癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用[16-17]，其機(jī)制如下：通過影響Caspase-3的活性來調(diào)節(jié)HL-60的增殖與凋亡；通過調(diào)節(jié)黃曲霉素B參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)；通過抑制PI3K/AKT通路的過度激活來抑制腫瘤的生物學(xué)功能，并且通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路來提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性；通過調(diào)節(jié)TGF-β通路來影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移。

本研究通過將柚皮苷與骨肉瘤治療的常見藥物順鉑聯(lián)合應(yīng)用，檢測(cè)柚皮苷對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)節(jié)作用。MTT和Transwell結(jié)果指出，順鉑可以顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63的增殖和遷移，并且Western blot實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)順鉑對(duì)常見的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclin d1和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2有一定的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，柚皮苷可以通過抑制cyclin d1和MMP2來實(shí)現(xiàn)對(duì)MG63細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用。二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)MG63細(xì)胞的抑制作用顯著增強(qiáng)，其效果優(yōu)于二者單獨(dú)應(yīng)用，說明柚皮苷和順鉑聯(lián)合應(yīng)用可以起到協(xié)同作用。

綜上所述，柚皮苷與順鉑聯(lián)合應(yīng)用，可以降低順鉑治療骨肉瘤的使用濃度，進(jìn)而減少順鉑化療的毒副作用，對(duì)提高膠質(zhì)瘤的治療效果有一定的意義。同時(shí)柚皮苷是一種極具優(yōu)勢(shì)和潛力的化療輔助藥物。

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