超臨界CO2萃取薄荷總黃酮的工藝研究

華燕青 王云云 李娟麗

（楊凌職業(yè)技術(shù)學院，陜西楊凌712100）

薄荷為唇形科植物薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）的干燥地上部分，具有疏散風熱、清利頭目、利咽、透疹、疏肝行氣的功效[1]，其主要化學成分有揮發(fā)油、黃酮類、蒽醌類、酚酸類等[2]。藥理學研究表明，薄荷黃酮具有良好的抗病毒、抗氧化、抗炎等作用，其中含量較高的橙皮苷、香葉木苷、香蜂草苷、蒙花苷具有抗流感病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力等良好的藥理活性[3]。目前薄荷中總黃酮的提取工藝主要采用了有機溶劑提取法和超聲波提取法[4-7]，相對于這些提取方法，超臨界CO2萃取技術(shù)以超臨界狀態(tài)下的流體作為萃取劑，能有效從植物中萃取有效成分，具有萃取速度快、操作溫度低、提取效率高、有機溶劑用量少等優(yōu)點[8]，該技術(shù)已在植物黃酮類成分的提取中得到廣泛應用[9-10]。本研究采用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)對薄荷進行萃取，并探討優(yōu)化萃取工藝條件，以期為薄荷的進一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與設備 HA120-50-01型超臨界萃取裝置（江蘇南通華安超臨界萃取有限公司）；UV1800紫外-可見分光光度儀（上海美譜達儀器有限公司）；RA-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；電子分析天平（常州科源電子儀器廠）；KQ-100DE超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑 薄荷藥材，購于北京同仁堂陜西經(jīng)銷部；二氧化碳，純度99.5%，購于楊凌建一工業(yè)氣體供應站；蘆丁標準品（批號110753-201415）購于中國藥品生物制品檢定所；水為自制超純水；無水乙醇、石油醚（30-60）、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉均為分析純。

2 方法

2.1 薄荷總黃酮的提取方法 薄荷干燥莖葉粉碎過10目篩，準確稱取干粉100g裝入1L萃取釜中，啟動冷循環(huán)，設定萃取與分離溫度，達到設定溫度后，打開鋼瓶閥門，開啟CO2泵，CO2經(jīng)過濾后由壓縮機壓縮入萃取罐，達到設定壓力，加入一定量的夾帶劑進行超臨界萃取，一定時間后收集萃取物，將萃取物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至膏狀。所得膏狀物用石油醚萃取除去脂溶性雜質(zhì)，收集萃余相，用70%乙醇溶解，得總黃酮萃取溶液。

2.2 蘆丁標準溶液的測定 吸收光譜的測定：準確稱取干燥并恒重的蘆丁標準品0.0121g，用70%的乙醇稀釋定容至25mL量瓶中，搖勻，超聲溶解，放冷，配成0.2mg/mL蘆丁標準液。分別取2支25mL比色管，標記為1號、2號管。1號管作空白，準確吸取蘆丁標準液1.0mL置于2號管中，兩管各加入70%的乙醇至10.0mL，加入5%的亞硝酸鈉1mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁1mL，搖勻，放置6min，再加4%氫氧化鈉10mL，加水至刻度，搖勻，放置15min。用1號管作空白對照，在190～600nm對2號管進行掃描，經(jīng)過比較，確定其最佳吸收波長為510nm。

標準溶液工作曲線的繪制：準確吸取蘆丁標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分別置于25mL量瓶中，按標準溶液相同方法顯色，以70%乙醇為空白，在510nm下測定不同濃度標準溶液的吸光度，繪制標準曲線，得到吸光度（A）-蘆丁標準溶液質(zhì)量濃度（C）的回歸方程：A=14.859C-0.056，相關(guān)系數(shù)r=0.9993。

2.3 樣品溶液的測定 準確吸取總黃酮萃取溶液各1.0mL置于25mL比色管中，采用與標準溶液相同的方法顯色，測定總黃酮濃度，根據(jù)下式計算薄荷總黃酮提取率，式中C為總黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL），V為總黃酮萃取液體積（mL），m為薄荷原料質(zhì)量（g）。

提取率（%）=C×V×稀釋倍數(shù)/m×10-3×100%

3 結(jié)果

3.1 夾帶劑的選擇 黃酮類成分極性較大，所以采用CO2作為超臨界流體進行萃取時需加入夾帶劑。夾帶劑種類首選乙醇，黃酮苷一般易溶于熱水、甲醇、乙醇、稀堿液等強極性溶劑中。薄荷中含有大量的黃酮苷類物質(zhì)，使用較大極性的溶劑提取效果較好[7]。由于低濃度的乙醇在制冷過程中容易造成超臨界流體萃取管路堵塞，因此選擇50%、60%、70%、80%、90%乙醇為夾帶劑，改變流體極性，進行超臨界萃取，比較不同濃度乙醇對提取率的影響。

按照2.1項下的提取方法，控制萃取條件：萃取壓力25MPa，萃取溫度55℃，萃取時間60min，CO2流量25L/h，夾帶劑加入量600mL，考察總黃酮提取率的變化。結(jié)果表明采用70%乙醇體積分數(shù)時，總黃酮提取率最高，見表1，所以選定70%乙醇作為夾帶劑進行超臨界萃取。

表1 不同夾帶劑對提取率的影響

3.2 單因素試驗

3.2.1 夾帶劑用量 按照2.1項下提取方法，在萃取溫度55℃、萃取壓力25MPa、萃取時間60min，以70%乙醇做夾帶劑，分別按3、4、5、6、7mL/g加入夾帶劑，考察不同用量的夾帶劑對薄荷總黃酮提取率的影響。結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著夾帶劑用量的增加，總黃酮提取率逐漸增大，70%乙醇用量為6mL/g時的提取效果較好，用量增大后提取率變化不顯著，進一步增大夾帶劑用量會造成乙醇損耗增加，故選擇6mL/g為適宜夾帶劑加入量。

圖1 夾帶劑用量對提取率的影響

3.2.2 萃取壓力 超臨界流體具有很大的可壓性，在一定溫度下，壓力增大，超臨界流體的密度增加，溶質(zhì)在流體中的溶解度增大，萃取效率提高，有利于提高總黃酮的萃取量。按照2.1項下的提取方法，設定萃取溫度55℃，以70%乙醇為夾帶劑，用量6mL/g，考察萃取壓力為10、15、20、25、30MPa時，超臨界萃取60min后，總黃酮提取率的變化。結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著萃取壓力增大，提取率升高。壓力為30MPa的提取率相對于25MPa的提取率雖有小量增幅，但萃取壓力過高，生產(chǎn)成本、不安全因素也會增加，因此萃取壓力選擇25MPa。

圖2 萃取壓力對提取率的影響

3.2.3 萃取溫度 按照2.1項下的提取方法，在萃取壓力25MPa，70%乙醇夾帶劑用量6mL/g時，考察萃取溫度分別為45、50、55、60、65℃時，超臨界萃取60min后，考察不同萃取溫度下總黃酮提取率的變化。結(jié)果見圖3。由圖3可知，總黃酮的提取率隨溫度升高呈上升趨勢，萃取溫度為55℃達到一個最大值，之后減小，因此正交試驗選擇50℃、55℃、60℃作為試驗值。

圖3 萃取溫度對提取率的影響

3.2.4 萃取時間 按照2.1項下的提取方法，在萃取溫度55℃、萃取壓力25MPa、夾帶劑用量6mL/g條件下，選擇萃取時間30、60、90、120、150min，考察不同萃取時間對薄荷總黃酮提取率的影響。結(jié)果見圖4。由圖4可知，萃取時間增加，總黃酮提取率逐漸增大，但增加趨勢緩慢，萃取90min時，提取率最高，隨后提取率下降。因此，正交試驗選擇60min、90min、120min為試驗值。

圖4 萃取時間對提取率的影響

3.3 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設計L9（34）正交試驗因素水平，見表2，通過正交試驗測定不同組合下薄荷總黃酮的提取率，并對所得試驗數(shù)據(jù)進行極差分析，結(jié)果見表3。結(jié)果表明正交試驗各因素的影響主次關(guān)系為：夾帶劑用量＞萃取壓力＞萃取時間＞萃取溫度。通過極差分析結(jié)果可知，最佳的工藝條件為：A3B3C2D2，即夾帶劑用量6mL/g、萃取壓力25MPa、萃取溫度55℃、萃取時間90min。采用此優(yōu)化的工藝條件進行超臨界萃取操作，所得薄荷總黃酮的最高提取率達到3.72%，重復3次驗證試驗的平均提取率為3.58%，基本接近正交試驗結(jié)果，故此法的最優(yōu)工藝條件穩(wěn)定可靠。

表2 正交試驗水平

表3 正交試驗設計結(jié)果

4 討論

超臨界CO2萃取技術(shù)在中草藥有效成分的萃取中應用頗多，適用于非極性或極性小的化合物的提取，但對極性物質(zhì)的溶解度很低。薄荷中含有大量的黃酮苷類物質(zhì)和少量的游離黃酮類，應采用強極性溶劑萃取，試驗中使用40%乙醇為夾帶劑時，物料容易結(jié)塊，影響萃取效果。單因素試驗中隨著萃取溫度的升高，超臨界CO2流體的密度會下降，但物質(zhì)的擴散系數(shù)和傳質(zhì)效率增大，使CO2流體溶解能力與溫度成正比，導致物質(zhì)在CO2流體中的溶解度增大。但黃酮類物質(zhì)化學結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定，部分隨溫度升高而分解，最終導致其含量下降。超過一定溫度，CO2的密度降低，其溶解能力會降低，黃酮類成分的萃取率也下降。

本試驗以采收期薄荷莖葉為材料，研究超臨界CO2萃取薄荷中黃酮類成分的最佳工藝條件，采用紫外分光光度法測定總黃酮含量，優(yōu)選夾帶劑種類，通過單因素試驗和正交試驗，探究夾帶劑用量、萃取壓力、萃取溫度等對萃取率的影響。結(jié)果表明最佳的工藝條件為：以70%乙醇為夾帶劑，其用量6mL/g，萃取壓力25MPa，萃取溫度55℃，萃取時間90min。超臨界CO2萃取法具有提取率高，產(chǎn)品的純度好，有機溶劑用量少，工藝簡單方便的優(yōu)點。

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