崔 振,李昌曉,李曉雪,賀燕燕(西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 北碚400715)
工業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)活動(dòng)帶來(lái)的重金屬污染問(wèn)題已成為全球主要的環(huán)境問(wèn)題之一[1]。近年來(lái),由于人類活動(dòng)的影響,土壤中的部分重金屬元素含量超標(biāo)現(xiàn)象嚴(yán)重,并通過(guò)植物富集進(jìn)入食物鏈,影響人類健康[2]。鎘(Cd)是一種毒性較強(qiáng)的重金屬,易遷移、難降解。鎘能夠干擾植物營(yíng)養(yǎng)元素的吸收和酶活性,導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧(ROS)累積,引起氧化損傷[3],進(jìn)而抑制植物的光合作用和呼吸作用,限制植物生長(zhǎng)發(fā)育,甚至導(dǎo)致死亡[4]。
據(jù)統(tǒng)計(jì),在過(guò)去的50年里,世界范圍內(nèi)進(jìn)入土壤的鎘總量為2.2萬(wàn)噸[5]。目前,我國(guó)受鎘等重金屬污染的耕地面積近2 000萬(wàn)hm2,約占耕地面積的1/5[6]。隨著我國(guó)西部大開(kāi)發(fā)戰(zhàn)略的深入實(shí)施,西部地區(qū)的重金屬污染問(wèn)題,特別是鎘的污染有可能變得更為嚴(yán)重,以銀川市為例,其道路和工業(yè)區(qū)鎘污染已達(dá)到了重度污染水平[7-8],當(dāng)?shù)刂亟饘冁k污染土壤的修復(fù)問(wèn)題急需得到高度重視和切實(shí)解決。
針對(duì)重金屬污染土壤,植物修復(fù)技術(shù)因成本低、效率高,同時(shí)具有美觀和長(zhǎng)時(shí)間適用性等特點(diǎn)而備受關(guān)注[9],而喬灌木樹(shù)種具有龐大的根系和生物量,表現(xiàn)出很好的修復(fù)潛能和修復(fù)效率[10],因此近年來(lái)其在重金屬污染土壤修復(fù)中的作用日益凸顯。檉柳(Tamarixramosissim)具有抗干旱、耐鹽堿、耐風(fēng)蝕和沙埋等特點(diǎn),在西部地區(qū)得到廣泛推廣種植[11]。銀水牛果(Shepherdiaargentea)于2002年從美國(guó)科羅拉多(Colorado)引進(jìn)到中國(guó)西北地區(qū),用于當(dāng)?shù)氐闹脖恢亟ㄅc綠化,具有耐大風(fēng)、耐貧瘠土壤、耐鹽、耐寒等特點(diǎn)[12-13]。而檉柳和銀水牛果是否適合在鎘污染土壤區(qū)栽植,并應(yīng)用于寧夏銀川及西部同類地區(qū)鎘污染土壤的綠化與生態(tài)修復(fù),還未見(jiàn)研究報(bào)道。因此,本研究以寧夏地區(qū)適生的本土物種檉柳和外來(lái)引進(jìn)物種銀水牛果為研究材料,探究其對(duì)不同質(zhì)量濃度鎘的生理生化響應(yīng)機(jī)制和耐受積累特征,以探明2種樹(shù)是否能有效用于寧夏乃至整個(gè)西部地區(qū)表層土壤鎘污染區(qū)域的植物修復(fù)。
試驗(yàn)材料為銀川市森淼植物園提供的生長(zhǎng)基本一致的檉柳和銀水牛果2年生苗木。為模擬當(dāng)?shù)貙?shí)生植物生長(zhǎng)的土壤類型——沙壤土,使盆栽試驗(yàn)的植物生活在一個(gè)與當(dāng)?shù)丨h(huán)境類似的土壤生境條件下,將采自寧夏銀川市森淼植物園的土壤配制成含沙量為50%~60%的沙壤土。供試土壤初始鎘含量為0.31 mg/kg 。2015年5月,將沙壤土過(guò)4 mm篩,將CdCl2·2.5H2O以溶液形式均勻噴灑在沙壤土中,混合均勻。參照《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 15618-1995),設(shè)置對(duì)照(CK)、T1、T2和T3等4個(gè)處理組,分別添加鎘0,2,5和10 mg/kg(鎘添加以純鎘、風(fēng)干土壤質(zhì)量計(jì))。土壤陳化1月后,裝入高30 cm×寬30 cm的塑料桶中(防止?jié)菜畷r(shí)鎘流失),每桶裝土7.5 kg。于2015-06-10選取生長(zhǎng)一致的檉柳和銀水牛果幼樹(shù)隨機(jī)移栽入盛有含鎘土壤的塑料桶中,每處理 5盆,每盆 1株幼樹(shù),澆透水后置陰涼、通風(fēng)處緩苗。植物馴化1月后于2015-07-10將所有盆栽試驗(yàn)苗置于銀川市森淼植物園種苗生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)基地大棚(棚頂透明,四周開(kāi)敞)內(nèi)培養(yǎng),并進(jìn)入試驗(yàn)期。整個(gè)試驗(yàn)期間進(jìn)行常規(guī)田間管理,適時(shí)澆水。在試驗(yàn)進(jìn)行90 d時(shí)進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定,并進(jìn)行破壞性取樣。
取植物相同葉位健康成熟的功能葉(萌條頂端完全展開(kāi)的葉片),充分研磨、浸提后,用普析TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于645 和663 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,根據(jù)高俊鳳[14]的方法計(jì)算葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)及總?cè)~綠素(Chls)含量。
使用直尺測(cè)量植株株高,收獲植物全株,地上部分用超純水徹底洗凈;根部用超純水洗凈后,用 20 mmol/L EDTA-Na2去除根表面吸附的鎘離子,然后再迅速用超純水沖洗干凈,用直尺測(cè)量各根長(zhǎng)度并求平均值。將植株在105 ℃下殺青30 min,80 ℃烘干,稱量地上部和地下部干質(zhì)量。計(jì)算耐性指數(shù)(Ti)[15]:
Ti=(LR+LS+WR+WS)/4×100%。
式中:LR、LS、WR、WS分別為鎘脅迫組平均總根長(zhǎng)、株高增長(zhǎng)量、根部平均生物量、地上部分平均生物量與對(duì)照組相應(yīng)指標(biāo)的比值。
取植株相同葉位的葉片,用于測(cè)定各項(xiàng)生理生化指標(biāo):超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[16]測(cè)定;過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法[17]測(cè)定;過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚比色法[16]測(cè)定;抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性采用紫外分光光度法測(cè)定[17]。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)氧化法[16]測(cè)定。
使用球磨儀將植物粉碎,存放于聚乙烯管中備用。用萬(wàn)分之一分析天平精確量取植物各部分(根、莖、葉)樣品干粉各0.050 g,用微波消解儀(Leeman SW-4,German)進(jìn)行消解定容。采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-OES,ThermoFisher iCAP 6300,UK)測(cè)定消解液中重金屬Cd2+的含量。計(jì)算轉(zhuǎn)移系數(shù)(Translocation factor,TF),以評(píng)價(jià)檉柳和銀水牛果將鎘轉(zhuǎn)移到地上部分的能力[18],其計(jì)算公式為:
TF=CA/CR
式中:CA、CR分別為植物地上部分和根中的鎘含量。
利用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 22.0和Excel 2010進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析與處理。采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)分析不同質(zhì)量濃度重金屬鎘脅迫對(duì)檉柳和銀水牛果生長(zhǎng)、生理與生物量的影響及對(duì)鎘吸收積累的影響,并用Duncan檢驗(yàn)法檢驗(yàn)每個(gè)指標(biāo)在不同處理組的差異顯著性。采用Origin 8.5作圖。
由圖1可知,鎘對(duì)植物葉片中的葉綠素合成有抑制作用,且除銀水牛果的葉綠素a/b外,對(duì)其他指標(biāo)的抑制程度隨鎘添加量的升高而加劇。隨鎘添加量的增大,檉柳和銀水牛果T1、T2和T3處理的葉綠素a含量顯著降低(P<0.05),分別為對(duì)照的97%,89%,72%和91%,85%,66%。與之類似,檉柳葉綠素b、總?cè)~綠素含量和葉綠素a/b及銀水牛果的總?cè)~綠素、葉綠素b含量均隨鎘添加量的增加而呈現(xiàn)出顯著降低趨勢(shì)。銀水牛果葉綠素a/b并未因鎘添加量的增加而降低,反而呈現(xiàn)上升趨勢(shì),并在T2處理下達(dá)到最大值,為CK的122%。
如表1所示,不同鎘脅迫處理對(duì)檉柳和銀水牛果株高和生物量有顯著影響。與CK相比,檉柳的株高、根系生物量、地上部生物量和總生物量均顯著降低(P<0.05),均在T3處理降至最低值,分別降低了48%,39%,53%和49%。隨鎘添加量的增加,銀水牛果的株高、根系生物量、地上部生物量和總生物量表現(xiàn)出與檉柳相同的降低趨勢(shì)(P<0.05),均在T3處理達(dá)到最低值,分別為CK的55%,27%,33%和31%。檉柳和銀水牛果的耐性指數(shù)Ti隨鎘添加量的增加而顯著下降。T1、T2、T3處理組檉柳和銀水牛果苗木Ti分別降為對(duì)照的67%,51%,35%和58%,45%,27%。
圖柱上標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示同一物種同一指標(biāo)不同處理間差異顯著(P<0.05)。下圖同The different lowercase letters on the column indicate the significant difference (P<0.05) between different treatments of the same species and same index.The same below圖1 不同水平鎘脅迫對(duì)檉柳和銀水牛果葉片葉綠素含量的影響Fig.1 Effects of different Cd concentrations on chlorophyll contents of T.ramosissima and S.argentea
表1 不同水平鎘脅迫對(duì)檉柳和銀水牛果株高、生物量和耐性指數(shù)的影響Table 1 Effects of different Cd concentrations on plant height,biomass and tolerance index of T.ramosissima and S.argentea
注:同一樹(shù)種同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。
Note:Different small letters indicate significant difference atP<0.05.
由圖2可知,鎘脅迫下檉柳和銀水牛果葉片的MDA含量均顯著增加,且鎘添加量越高,MDA增加趨勢(shì)越明顯。與檉柳相比,鎘脅迫處理銀水牛果葉片MAD含量的增加幅度更高,當(dāng)鎘添加量為2,5和10 mg/kg時(shí),其MDA含量分別為檉柳的1.34,1.29和1.29倍。
圖2 不同水平鎘脅迫對(duì)檉柳和銀水牛果葉片中丙二醛含量的影響Fig.2 Effects of different Cd concentrations on leaf MDA contents of T.ramosissima and S.argentea (mean±SE)
由圖3可知,總體而言,鎘脅迫可以提高檉柳和銀水牛果葉片的抗氧化酶活性,隨鎘添加量的增大,檉柳和銀水牛果葉片的SOD、POD、CAT、APX活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)(P<0.05),均在T2處理達(dá)到最大值,分別為CK的383%,165%,174%,191%和341%,177%,148%,254%。
由圖4可知,除檉柳葉部鎘含量隨著鎘添加量的增加先上升后下降外,2種供試植物根、莖和銀水牛果葉部的鎘積累量均隨鎘添加量的增加而升高,但升高幅度各不相同。對(duì)3個(gè)鎘處理組而言,檉柳根部和莖部鎘含量在T3處理達(dá)到最大值,分別為5.03,4.76 mg/kg,而葉鎘含量在T2處理達(dá)到最大值(9.64 mg/kg),均顯著高于其余處理(P<0.05)。銀水牛果根部、莖部、葉部鎘含量均在T3處理達(dá)到最大值,分別為2.58,1.44,0.50 mg/kg,均顯著高于其他處理組(P<0.05)。
由圖4可知,檉柳和銀水牛果的轉(zhuǎn)移系數(shù)均隨鎘添加量的增大呈先上升后下降趨勢(shì),檉柳T1、T2、T3處理的轉(zhuǎn)移系數(shù)均顯著大于CK組(P<0.05);銀水牛果T1、T2處理組的轉(zhuǎn)移系數(shù)顯著高于CK組,而T3組與CK無(wú)顯著性差異(P>0.05)。銀水牛果的轉(zhuǎn)移系數(shù)為0.75~0.81;檉柳的轉(zhuǎn)移系數(shù)為0.85~3.57,是銀水牛果的1.13~4.01倍。
圖3 不同水平鎘脅迫對(duì)檉柳和銀水牛果葉片抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effects of different Cd concentrations on leaf antioxidant enzyme activities of T.ramosissima and S.argentea
圖4 不同水平鎘脅迫檉柳和銀水牛果根、莖、葉的鎘含量及轉(zhuǎn)移系數(shù)Fig.4 Cd contents in roots,stem and leaf and translocation factors of T.ramosissima and S.argentea under different Cd concentrations
生長(zhǎng)在重金屬鎘環(huán)境中的植物,其葉綠素的生物合成會(huì)受到影響[19],而作為光合作用的主要色素,葉綠素含量的減少會(huì)影響植物的光合作用,導(dǎo)致植物光合產(chǎn)物積累減少,最終導(dǎo)致植物的生物量降低[20]。本研究中,檉柳和銀水牛果植株葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量均隨鎘添加量的增加而顯著下降(P<0.05),這與萬(wàn)雪琴等[21]對(duì)楊樹(shù)(Populusdeltoides)和朱宇林等[22]對(duì)銀杏(Ginkgobiloba)的研究結(jié)果一致。鎘脅迫會(huì)減少色素合成酶含量,影響植物對(duì)Fe、Mg等元素的吸收[23-24],導(dǎo)致葉綠素合成減少。各鎘脅迫處理組檉柳葉綠素a/b值隨鎘添加量的增加而顯著降低,且T2、T3處理小于3,這可保證檉柳有充足的聚光色素參與光能合成作用,使葉綠素a與b的比例更加合理,使得檉柳朝著最優(yōu)化的光合作用方向發(fā)展[25],是檉柳在逆境脅迫下的一種適應(yīng)機(jī)制。而銀水牛果葉綠素a/b值隨鎘添加量的增大而先上升后下降,3個(gè)鎘脅迫處理的比值均顯著高于對(duì)照,表明鎘脅迫使銀水牛果植物體內(nèi)的葉綠素b更容易被抑制,鎘脅迫降低葉綠素b對(duì)光能的吸收和傳遞作用,維持捕光色素復(fù)合體Ⅱ(LHCⅡ)穩(wěn)定性的功能遭到破壞[26]。
許多研究表明,重金屬鎘能對(duì)植物產(chǎn)生很強(qiáng)的毒害作用[27],導(dǎo)致一系列脅迫癥狀產(chǎn)生,如干擾礦質(zhì)元素吸收和碳水化合物代謝[28],影響根系形態(tài)[29],降低植物的光合作用,導(dǎo)致植物葉片衰老、生物量下降甚至死亡[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn),隨鎘添加量的增加,檉柳和銀水牛果株高和生物量積累均受到抑制,這與對(duì)生長(zhǎng)在鎘介質(zhì)中的其他植物的研究結(jié)果[32-33]一致。
基于植物生長(zhǎng)和生物量指標(biāo)的耐性指數(shù)Ti可反映植物對(duì)重金屬耐性的大小。有研究者將植物耐性分為敏感型(Ti<35)、中等程度耐受性(35
植物在遭受逆境脅迫時(shí),體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧[36],這些活性氧與脂膜的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),產(chǎn)生MDA,MDA的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷,因此可通過(guò)MDA了解膜脂過(guò)氧化的程度,以間接測(cè)定膜系統(tǒng)受損程度[37-38]。本研究發(fā)現(xiàn),鎘脅迫顯著增加了檉柳和銀水牛果葉片中的MDA含量,鎘的添加量增大時(shí),檉柳和銀水牛果葉片中的活性氧(ROS)大量產(chǎn)生,膜系統(tǒng)損傷加劇。在相同鎘添加量處理下銀水牛果體內(nèi)MDA含量大于檉柳,表明在相同條件下,鎘對(duì)銀水牛果的毒害作用更大。當(dāng)植物體內(nèi)ROS因脅迫作用大量產(chǎn)生時(shí),植物體內(nèi)具有的SOD、POD、CAT、APX將參與活性氧的代謝,其中SOD催化分解超氧陰離子自由基,使之轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫(H2O2);而POD、CAT、APX則被認(rèn)為是清除植物H2O2的酶,其活性變化在一定程度上反映了植物體內(nèi)活性氧的代謝情況[39]。本試驗(yàn)表明,隨鎘添加量的增大,檉柳體內(nèi)的SOD、POD、CAT、APX活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì),均在T2處理達(dá)到最大值,當(dāng)鎘添加量超過(guò)5 mg/kg時(shí)4種酶活性下降,表明檉柳在鎘添加量為5 mg/kg時(shí),體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)響應(yīng)最為積極,以清除體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)多活性氧,但當(dāng)鎘添加量增加到10 mg/kg時(shí),其體內(nèi)活性氧的增加超過(guò)了正常的歧化能力,對(duì)組織和細(xì)胞多種功能膜及酶系統(tǒng)造成破壞,從而使SOD、POD、CAT、APX活性下降[40]。銀水牛果體內(nèi)的POD、APX活性在T1、T3處理組與CK組無(wú)顯著性差異,SOD、CAT活性在T1、T3組顯著高于CK組,可見(jiàn)在T1、T3處理組銀水牛果主要通過(guò)SOD、CAT來(lái)清除H2O2。當(dāng)鎘添加量達(dá)到5 mg/kg時(shí),銀水牛果體內(nèi)SOD、POD、CAT、APX活性表現(xiàn)出與檉柳相同的變化趨勢(shì),并在T2處理達(dá)到最大值,表明在T2處理?xiàng)l件下,其具有較好的抗氧化酶反應(yīng)體系,抵抗鎘脅迫的能力較強(qiáng)。
植物能否成功用于土壤重金屬污染的植物修復(fù)主要取決于該植物的生物量、金屬積累能力和金屬在植物體內(nèi)的積累位置[41]。檉柳和銀水牛果隨土壤鎘添加量的增加,根和地上部分生物量下降而鎘含量上升,說(shuō)明其體內(nèi)高的鎘積累能力和高生物量不可能同時(shí)出現(xiàn),高的鎘積累能力會(huì)對(duì)植物體產(chǎn)生損傷,導(dǎo)致潛在的生物量下降[42]。檉柳根部鎘的最大積累量為5.03 mg/kg,地上部分的轉(zhuǎn)移系數(shù)為0.85~3.57,可見(jiàn)檉柳向地上部分轉(zhuǎn)移鎘的能力較強(qiáng),這可能與檉柳體內(nèi)的金屬硫蛋白基因(MT2)的表達(dá)有關(guān),該基因編碼的MT蛋白能夠與Cd2+結(jié)合,降低體內(nèi)的鎘含量,提高植物抗重金屬的能力[43]。同時(shí),檉柳體內(nèi)的真核翻譯起始因子1A(eIF1A)基因能夠參與檉柳對(duì)鎘脅迫的應(yīng)答。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)檉柳eIF1A基因的T2代煙草進(jìn)行CdCl2脅迫,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)eIF1A基因煙草各株系的SOD、POD活性顯著提高[44]。由此可見(jiàn),鎘脅迫時(shí)檉柳體內(nèi)積極的抗氧化酶系統(tǒng)響應(yīng)可能與eIF1A基因的表達(dá)有關(guān),該基因增強(qiáng)了植物抗氧化能力,從而提高了植株對(duì)金屬鎘的抗性水平。就銀水牛果而言,其各部分鎘含量表現(xiàn)為根>莖>葉,鎘的轉(zhuǎn)移系數(shù)為0.75~0.81,吸收的鎘主要集中于根部,這可能是植物為減少重金屬對(duì)自身其他部位損傷而采取的防御措施。而根部作為接觸重金屬的第一道屏障,對(duì)重金屬有很強(qiáng)的阻礙作用[45],根細(xì)胞壁由木質(zhì)素、纖維素組成,尤其是其中的低聚果糖能夠結(jié)合二價(jià)和三價(jià)的重金屬離子,將重金屬離子結(jié)合至細(xì)胞壁,減少對(duì)重金屬的吸收[46]。此外,植物根部吸收的鎘進(jìn)入根毛區(qū)表皮細(xì)胞后,通過(guò)質(zhì)外體途徑向根內(nèi)運(yùn)輸,即通過(guò)細(xì)胞壁和細(xì)胞間隙等以橫向流形式穿過(guò)皮層而在內(nèi)皮層組織中積累。而緊密排列的內(nèi)皮層細(xì)胞壁上栓質(zhì)化的凱氏帶結(jié)構(gòu)阻斷了質(zhì)外體通路,限制重金屬離子的進(jìn)一步運(yùn)輸[47]。由此可見(jiàn),銀水牛果將吸收的鎘固定于根部,以減少鎘向地上部分轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生危害。
檉柳具有較好的地下部分鎘積累能力及地上部分鎘轉(zhuǎn)移能力,在土壤鎘含量為5.31 mg/kg時(shí)耐受能力較強(qiáng),在寧夏地區(qū)乃至整個(gè)西部土壤表層鎘污染嚴(yán)重地區(qū)有較強(qiáng)的推廣應(yīng)用潛力。銀水牛果雖然在土壤鎘含量為5.31 mg/kg時(shí)也具有較高的鎘耐受能力,但其根部向地上部分轉(zhuǎn)移鎘的能力較差,相較于檉柳而言其應(yīng)用潛力大大降低。
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