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    免疫原性HER2突變體蛋白對小鼠T細胞亞群分化的影響

    2018-03-20 06:56:34寧宏宇姚文兵
    中國藥科大學學報 2018年1期
    關鍵詞:苯丙氨酸免疫原性硝基

    寧宏宇,江 濤,張 瑞,何 羽,姚文兵,田 浤*

    (中國藥科大學 1江蘇省生物藥物成藥性研究重點實驗室;2生命科學與技術學院,南京 210009)

    免疫原性氨基酸是指能提高蛋白質(zhì)免疫原性的一類氨基酸,如硝基酪氨酸、對硝基苯丙氨酸等。在自體蛋白中引入免疫原性氨基酸能誘使機體突破免疫耐受,產(chǎn)生針對自體蛋白的特異性抗體[1]。Hardy等[2]用化學合成的方法將抗原表位肽中的酪氨酸置換成硝基酪氨酸,證實了僅在一個位點引入免疫原性氨基酸即可明顯影響MHC I類限制性抗原表位的識別。另有文獻報道,將對硝基苯丙氨酸定點引入至小鼠的腫瘤壞死因子(TNF-α)中,免疫小鼠后產(chǎn)生了能夠與原TNF-α發(fā)生交叉反應的中和抗體。利用此方法,對小鼠進行LPS過度刺激,突變蛋白免疫后的小鼠能夠存活,證明抗體的存在能夠有效地控制小鼠體內(nèi)TNF-α的含量[1,3-4]。

    盡管免疫原性氨基酸突破自身免疫耐受的作用已被研究證實,但其誘導機體產(chǎn)生抗體的作用機制尚不完全清楚。前期研究已證實,免疫原性氨基酸并非通過形成新的B細胞表位誘導抗體產(chǎn)生,其誘導機體產(chǎn)生的抗體能與未引入非天然氨基酸的原型蛋白產(chǎn)生廣泛的交叉反應[5-7]。因此推測,免疫原性氨基酸可能是通過影響T細胞而誘導機體產(chǎn)生自身抗體。

    本課題組前期以人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)為模型分子,制備了一系列含對硝基苯丙氨酸的HER2突變體[8-10]。本研究利用含對硝基苯丙氨酸的HER2突變體免疫小鼠后,對小鼠CD4+T細胞的不同亞群比例及Bcl-6、FOXP3等主要轉(zhuǎn)錄因子進行了分析,以探討對硝基苯丙氨酸在蛋白質(zhì)中的定點引入對T細胞亞群分化的影響。

    1 材 料

    1.1 試 劑

    異丙基硫代半乳糖苷(IPTG),HRP偶聯(lián)山羊抗鼠IgG(南京鼎國公司);鄰苯二胺(OPD),小鼠脾臟淋巴細胞、分離液(天津市灝洋公司);RPMI1640培養(yǎng)基,胎牛血清(美國Gibco公司);鋁佐劑、PMA和離子霉素(美國Sigma公司);BFA,Staining buffer,流式固定破膜液以及流式抗體等(美國BD公司);RNA提取試劑盒、cDNA第一條鏈合成試劑盒、qPCR試劑盒(北京全式金公司);引物合成(南京金斯瑞公司);小鼠IL-21 ELISA試劑盒(美國eBioscience公司);其他試劑均為市售分析純。

    1.2 儀 器

    ELISA酶標條,細胞培養(yǎng)板(美國Corning公司);全波長酶標儀(美國Thermo公司);FACS Calibur 流式細胞儀(美國BD公司);LightCycler96實時熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)。

    1.3 動 物

    BALB/c小鼠,6~8周齡,購自揚州大學比較醫(yī)學中心,合格證號:No.201713517。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

    2 方 法

    2.1 HER2突變體的表達與純化

    實驗室前期分別將編碼HER2蛋白的5號,26號和79號位氨基酸的密碼子突變?yōu)殓昝艽a子TAG,并將3種突變體基因引入質(zhì)粒pET28a,命名為pET28a-5TAG-HER2質(zhì)粒,pET28a-26TAG-HER2質(zhì)粒,pET28a-79TAG-HER2質(zhì)粒,將3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞,構建為3種重組菌,將3種重組菌分別培養(yǎng)8 h后,加入IPTG(終濃度1 mmol/L)進行誘導,同時加入對硝基苯丙氨酸(終濃度100 mmol/L),37 ℃,220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)18 h,離心收取菌體沉淀。將菌體按10 mL/g的比例加入0.10 mol/L NaCl緩沖液中重懸,超聲破碎,離心收集包涵體沉淀。每克包涵體沉淀加入含20 mmol/L咪唑的包涵體變性液10 mL,重懸并在4 ℃變性過夜,完全溶解后將變性液過Ni親和色譜柱,用濃度梯度為20~500 mmol/L的咪唑緩沖液梯度洗脫,檢測合并含目的蛋白的洗脫液,按體積比1∶4的比例加入復性緩沖液,用PBS(pH 8.0)緩沖液透析,超濾濃縮,加入等體積甘油混合均勻,分別命名為5-HER2,26-HER2和79-HER2,保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 HER2突變體免疫原性分析

    將6~8周齡C57BL/6雌性小鼠隨機分為8組,每組6只,分別為PBS組、佐劑組、WT-HER2(原型HER2)組、WT-HER2加佐劑組、5-HER2組、26-HER2組、79-HER2組、79-HER2加佐劑組。分別于實驗的第1天和第8天。PBS組注射PBS溶液150 μL,WT-HER2、5-HER2、26-HER2、79-HER2組分別注射WT-HER2、5-HER2、26-HER2和79-HER2;WT-HER2加佐劑組和79-HER2加佐劑組分別注射WT-HER2和79-HER2與鋁佐劑按體積比1∶1混合的混合溶液,蛋白劑量均為1 μg/g。免疫后每周取血,分離血清,共取5周。利用間接ELISA法檢測小鼠血清中抗HER2抗體含量,用WT-HER2蛋白包被酶標條,加入各組小鼠血清孵育2 h,PBST清洗后加入HRP偶聯(lián)羊抗鼠IgG孵育1 h,清洗后加入反應底物,反應30 min 后加入終止液,用酶標儀在492 nm處測定吸收度。

    2.3 免疫后小鼠淋巴結Th細胞亞群分析

    2.3.1 小鼠淋巴結淋巴細胞的分離 取免疫后小鼠的淋巴結,分別研磨過70 μm篩網(wǎng),用PBS沖洗收集至15 mL離心管中,離心收集細胞,用PBS 1 mL重懸,在新的15 mL離心管中加入小鼠脾臟淋巴細胞分離液3 mL,傾斜離心管,沿離心管壁緩慢加入細胞懸液,保持液面清晰,2 000 r/min室溫離心20 min,用巴斯德吸管吸取乳白色云霧狀的淋巴細胞層至一個新的15 mL離心管中,加入10倍體積的PBS洗滌細胞2次,用PBS 1 mL重懸淋巴細胞,計數(shù)。

    2.3.2 Th細胞亞群檢測 Th1細胞用CD4/IFN-γ標記,Th2細胞用CD4/IL-4標記,Tfh細胞用CD4/CXCR5/ICOS標記,Treg細胞用CD4/FOXP3標記。

    用于標記Th1/Th2的細胞預先用RPMI1640培養(yǎng)基(10%FBS)重懸,鋪于6孔板中,加入20 ng/mL PMA,1 μg/mL離子霉素以及1 μL/mL GolgiStop(均用終濃度表示)孵育6 h,收集離心,計數(shù)。

    染色方法如下:取1×106個淋巴細胞至2 mL EP管中,2 000 r/min離心棄上清液,加入anti-CD4(Th1/Th2/Treg)或anti-CD4/anti-CXCR5/anti-ICOS(Tfh)染色工作液20 μL,4 ℃避光孵育30 min,用PBS清洗2次,Th1/Th2/Treg細胞另加入Cytofix/Cytoperm緩沖液250 μL重懸細胞沉淀,4 ℃避光孵育20 min,Perm/Wash緩沖液洗滌細胞2次,加入anti-IFN-γ(Th1)/anti-IL-4(Th2)/anti-FOXP3(Treg)染色工作液20 μL,4 ℃暗處孵育30 min,Perm/Wash緩沖液清洗2次。上流式細胞儀檢測。

    2.4 小鼠淋巴結轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平分析

    用實時熒光定量PCR法檢測小鼠淋巴結中Bcl-6和FOXP3的表達。按照試劑盒說明,提取淋巴結總RNA,以隨機引物合成cDNA的第一條鏈,-20 ℃保存?zhèn)溆?。以cDNA為模板,以SYB GREEN標記熒光定量,檢測β-actin,Bcl-6及FOXP3基因表達情況。PCR引物序列如下:β-actin上游引物5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′,β-actin下游引物5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3′;Bcl-6上游引物5′-CACACCCGTCCATCATTGAA-3′,Bcl-6下游引物5′-TGTCCTCACGGTGCCTTTTT-3′;FOXP3上游引物5′-CTATGCCACCCTTATCCGA-3′,F(xiàn)OXP3下游引物5′-TCCTCTTCTTGCGAAACTCA-3′。

    反應程序為:95 ℃預變性20 s,95 ℃變性3 s,60 ℃退火延伸30 s(熒光檢測),40個循環(huán)。PCR反應及數(shù)據(jù)采集于LightCycler96系統(tǒng)上進行,記錄其循環(huán)閾值(Ct)。采用ΔΔCt法,以β-actin為內(nèi)參,相對定量各實驗組樣品內(nèi)目的基因的表達水平。

    2.5 免疫后小鼠血清中IL-21含量分析

    根據(jù)試劑盒說明書,采用雙抗夾心ELISA法檢測各組小鼠血清中IL-21的含量。

    2.6 統(tǒng)計學分析

    3 結 果

    3.1 含對硝基苯丙氨酸的HER2蛋白的表達與純化

    以79-HER2工程菌為例,工程菌培養(yǎng)8 h后,加入IPTG與對硝基苯丙氨酸進行誘導表達,采樣進行全菌電泳,如實驗結果(圖1-A)所示,誘導后在14 kD附近出現(xiàn)了目的條帶,與理論相對分子質(zhì)量相符。經(jīng)超聲破碎、變性、Ni柱純化、透析、超濾等步驟,獲得了電泳純的目的蛋白(圖1-B)。

    Figure1 SDS-PAGE analysis of protein expression of the bacteria containing pET28a-79TAG-HER2 plasmid

    (A) M:Protein marker;1:Total cell proteins of the reorganized strains before induction with pNO2Phe;2:Total cell proteins of the reorganized strains after induction without pNO2Phe;3:Total cell proteins of the reorganized strains after induction with pNO2Phe.

    (B) M:Protein marker;1:Purified 79-pNO2Phe-HER2

    3.2 含對硝基苯丙氨酸的HER2突變體的免疫原性分析

    對小鼠采取眼眶取血,離心后收集上層血清,用間接ELISA法檢測小鼠血清中抗WT-HER2抗體的效價,免疫后持續(xù)檢測5周(圖2)。免疫后,3種突變體HER2免疫的小鼠血清中抗HER2抗體滴度均隨著時間而增加,而WT-HER2,PBS和佐劑免疫的小鼠血清中則沒有檢測到抗HER2抗體的分泌。在第5周時,WT-HER2免疫的小鼠血清中抗體效價仍維持在較低水平,與PBS組不存在顯著性差異(P>0.05)。而5-HER2,26-HER2和79-HER2均能不同程度刺激小鼠產(chǎn)生抗HER2抗體,均與PBS組有極顯著差異(P<0.001)。

    A:Serum titer of anti-WT-HER2 antibody from week 1-5;B:Serum titer of anti-WT-HER2 antibody of mice vaccinated with PBS,WT-HER2 and 79-HER2 on week 5

    ***P<0.001;ns:P>0.05

    3.3 免疫后小鼠Th細胞亞群比例的分析

    從小鼠淋巴結中采用密度梯度離心法分離淋巴細胞,流式染色后檢測Th細胞亞群的比例。實驗結果(圖3)表明,WT-HER2和79-HER2免疫小鼠后,均不能使小鼠淋巴結中Th1和Th2的比例發(fā)生變化(P>0.05),而79-HER2免疫后,能使小鼠淋巴結中的Tfh細胞比例(8.74±1.99)%明顯上升,與PBS組(4.60±0.772)%和原型組(3.79±0.68)%均存在極顯著差異(P<0.001)。79-HER2免疫后,能使小鼠淋巴結中Treg細胞比例(1.11±0.67)%下降,與PBS組(4.89±1.33)%存在顯著性差異(P<0.05),而WT-HER2免疫小鼠后,淋巴結Treg細胞的比例(2.88±0.86)%與PBS組不存在顯著性差異(P>0.05)。

    3.4 免疫后小鼠T細胞中Bcl-6和FOXP3轉(zhuǎn)錄水平的變化

    提取各實驗組總RNA后,用隨機引物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后以此為模板,采用實時熒光定量PCR法,進一步考察了小鼠淋巴結中Tfh細胞和Treg細胞的關鍵轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和FOXP3的基因表達水平變化。研究表明(圖4),79-HER2免疫小鼠后,小鼠淋巴結Bcl-6 mRNA水平相對PBS組和WT-HER2組均有顯著升高(P<0.001),而WT-HER2免疫小鼠后Bcl-6 mRNA水平相對PBS組則沒有顯著改變(P>0.05)。且79-HER2免疫后,能使小鼠淋巴結中FOXP3 mRNA表達相對PBS組(P<0.01)和WT-HER2組(P<0.05)均有顯著下降,而WT-HER2免疫小鼠則不能使FOXP3表達相對PBS組發(fā)生變化(P>0.05),實驗結果與流式結果基本一致。

    3.5 免疫后小鼠血清中IL-21含量的變化

    Tfh細胞是生發(fā)中心形成和B細胞成熟過程中的關鍵輔助性T細胞,而IL-21是Tfh細胞的主要效應細胞因子。免疫5周后,檢測各組小鼠血清中的IL-21含量,結果如圖5所示,與PBS組[(2.76±1.84) pg/mL]和WT-HER2組[(4.58±2.33) pg/mL]相比,79-HER2免疫小鼠后,小鼠血清中的IL-21 含量[(28.49±14.54) pg/mL]有顯著升高(P<0.05)。

    Figure3 79-HER2 induce the differentiation of T lymphocyte

    **P<0.01;***P<0.001;ns:P>0.05

    Figure4 mRNA abundance of Bcl-6 and FOXP3

    **P<0.01;***P<0.001;*P<0.05; ns:P>0.05

    *P<0.05;ns:P>0.05

    4 討 論

    免疫原性氨基酸的引入能顯著提高蛋白質(zhì)的免疫原性,使機體產(chǎn)生特異性抗體,但其誘導特異性抗體的機制及其對機體T細胞亞群分化的影響尚不明確。本研究表達了定點引入對硝基苯丙氨酸的HER2突變體。用含對硝基苯丙氨酸的HER2突變體免疫小鼠,分析其對小鼠T細胞亞群分化的影響。結果表明突變體HER2免疫能提高小鼠淋巴結中Tfh細胞的比例,同時使Treg細胞的比例下降,而對Th1和Th2細胞比例無明顯影響。

    Tfh細胞是生發(fā)中心的形成與其發(fā)揮功能的過程中的關鍵輔助細胞,以高表達CXC趨化因子受體5(CXCR5)為特征,CXCR5能引導Tfh細胞向濾泡中高表達CXCL13的B細胞區(qū)遷移[11-12],Tfh同時共表達ICOS,PD-1,細胞因子IL-21和Bcl-6[13-16]。Tfh細胞在B細胞成熟和其類型轉(zhuǎn)換和特異性成熟過程中起著關鍵作用,Tfh細胞選擇性的向能分泌高親和力、高特異性抗體的B細胞提供存活,增殖或分化信號[17],并使其發(fā)生體細胞突變,為BCR的突變多樣性提供了基礎。由抗原接觸活化的B細胞在Tfh細胞的輔助下由趨化因子和趨化因子樣介質(zhì)引導,遷移通過次級淋巴組織的多個區(qū)室,進入生發(fā)中心,在其中發(fā)生體細胞突變與親和力成熟,最終分化為能分泌高親和力與特異性抗體的漿細胞[18-19]。

    本研究檢測了CD4+CXCR5+ICOS+的Tfh細胞在淋巴結T細胞中的比例變化,結果顯示突變體HER2免疫后Tfh細胞比例顯著上升,且ICOS+細胞的比例無明顯變化,而CXCR5+細胞的比例有所上升。由于CXCR5通過識別CXCL13,將T、B細胞引導至B細胞濾泡,并使T細胞激活B細胞,而ICOS作為B7家族的共刺激分子,通過與其配體ICOSL結合,能刺激T細胞的活化和增殖,因此對硝基苯丙氨酸可能通過上調(diào)CXCR5的表達,從而增加歸巢至濾泡的Tfh細胞數(shù)量,從而促進漿細胞的分化,最終使機體分泌抗HER2抗體。

    本研究驗證了對硝基苯丙氨酸增加蛋白質(zhì)免疫原性的作用,證實了含對硝基苯丙氨酸的HER2蛋白免疫能使小鼠淋巴結Tfh細胞比例上調(diào),并使Treg細胞比例下降,但由于Tfh細胞在抗原刺激下分泌的IL-21,IL-4,CXCL13和CD40L等標志物在非特異性刺激下也會發(fā)生表達的提高,抗原特異性Tfh細胞的測定是十分困難的[20],因此,這些上調(diào)的Tfh細胞是否為HER2特異性Tfh細胞仍需進一步研究。

    [1] Gruenewald J,Tsao ML,Perera R,etal.Immunochemical termination of self-tolerance[J].ProcNatlAcadSciUSA,2008,105(32):11276-11280.

    [2] Hardy LL,Wick DA,Webb JR.Conversion of tyrosine to the inflammation-associated analog 3′-nitrotyrosine at either TCR-or MHC-contact positions can profoundly affect recognition of the MHC class I-restricted epitope of lymphocytic choriomeningitis virus glycoprotein 33 by CD8 T cells[J].JImmunol,2008,180(9):5956-5962.

    [3] Xie J,Schultz PG.An expanding genetic code[J].Methods,2005,36(3):227-238.

    [4] Kessel C,Nandakumar KS,Peters FB,etal.A single functional group substitution in C5a breaks B cell and T cell tolerance and protects against experimental arthritis[J].ArthritisRheumatol,2014,66(3):610-621.

    [5] Hallam TJ,Wold E,Wahl A,etal.Antibody conjugates with unnatural amino acids[J].MolPharm,2015,12(6):1848-1862.

    [6] Grunewald J,Hunt GS,Dong L,etal.Mechanistic studies of the immunochemical termination of self-tolerance with unnatural amino acids[J].ProcNatlAcadSciUSA,2009,106(11):4337-4342.

    [7] Gauba V,Grunewald J,Gorney V,etal.Loss of CD4 T-cell-dependent tolerance to proteins with modified amino acids[J].ProcNatlAcadSciUSA,2011,108(31):12821-12826.

    [8] Zhang TJ,Tian H,Gao XD.Advances in research on antitumor activities of HER2-based peptide vaccines[J].ProgPharmSci(藥學進展),2013,37(10):516-521.

    [9] Zhang R,Tian H,Gao XD,etal.Application of next generation genome editing technology in gene therapy and biopharmaceuticals[J].JChinaPharmUniv(中國藥科大學學報),2014,45(4):504-510.

    [10] Yao DN,Xu XW,Yu HB,etal.Screening system for amber suppressor tRNA based on inducible high-copynumber plasmid[J].JChinaPharmUniv(中國藥科大學學報),2013,44(2):174-178.

    [11] Chen X,Ma W,Zhang T,etal.Phenotypic Tfh development promoted by CXCR5-controlled re-localization and IL-6 from radiation-resistant cells[J].ProteinCell,2015,6(11):825-832.

    [12] Moser B.CXCR5,the defining marker for follicular B helper T (T-FH) cells[J].FrontImmunol,2015,6:296.

    [13] Mcguire HM,Vogelzang A,Warren J,etal.IL-21 and IL-4 collaborate to shape T-dependent antibody responses[J].JImmunol,2015,195(11):5123-5135.

    [14] Choi YS,Yang JA,Yusuf I,etal.Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory[J].JImmunol,2013,190(8):4014-4026.

    [15] Liu X,Yan X,Zhong B,etal.Bcl6 expression specifies the T follicular helper cell programinvivo[J].JExpMed,2012,209(10):1841-1852.

    [16] Ozaki K,Spolski R,Ettinger R,etal.Regulation of B cell differentiation and plasma cell generation by IL-21,a novel inducer of Blimp-1 and Bcl-61[J].JImmunol,2004,173(9):5361-5371.

    [17] Crotty S.A brief history of T cell help to B cells[J].NatRevImmunol,2015,15(3):185-189.

    [18] Toellner KM.Cognate interactions:extrafollicular IL-4 drives germinal-center reactions,a new role for an old cytokine[J].EurJImmunol,2014,44(7):1917-1920.

    [19] Zhang Y,Garcia-Ibanez L,Toellner KM.Regulation of germinal center B-cell differentiation[J].ImmunolRev,2016,270(1):8-19.

    [20] Dan JM,Arlehamn CSL,Weiskopf D,etal.A cytokine-independent approach to identify antigen-specific human germinal center T follicular helper cells and rare antigen-specific CD4(+) T cells in blood[J].JImmunol,2016,197(3):983-993.

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