高粱種子EMS誘變處理的研究

白鴻雁 楊 偉 武 擘

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所，晉中 030600）

農(nóng)作物化學(xué)誘變育種是指用化學(xué)誘變劑處理作物品種材料，以誘發(fā)材料產(chǎn)生可以遺傳的變異，然后根據(jù)育種目標(biāo)，對產(chǎn)生的變異進(jìn)行多世代的選擇和鑒定，育成生產(chǎn)上可利用的品種或品系[1]。由于化學(xué)誘變具有使用方便、成本低廉、點突變比例高、突變頻率高等特點[2]，近年來被育種者廣泛使用。在眾多的化學(xué)誘變劑中，甲基磺酸乙酯（EMS，ethyl methyl sulfonate）被認(rèn)為是最高效、安全的一種，其主要誘發(fā)點突變，能對作物品種的某一個性狀進(jìn)行改良，應(yīng)用最為廣泛[3-8]。目前，國內(nèi)利用EMS化學(xué)誘變育種技術(shù)，在大豆、花生、大麥、春小麥、水稻等的誘變選育中獲得了巨大成就[9]。關(guān)于EMS化學(xué)誘變育種技術(shù)在高粱中的應(yīng)用比較少，呂鑫等[10]用EMS對高粱無融合生殖系1094和2083的種子進(jìn)行誘變處理，得到了株高、穗長、育性及結(jié)實率等突變體材料。張會等[11]以甜高粱品種能飼1號為野生型構(gòu)建EMS化學(xué)誘變突變體庫，最后篩選得到3份特異突變體材料：SM83、SM197、SM305。為了更有效地開展高粱EMS誘變育種，創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，選擇育種上常用的6個高粱恢復(fù)系材料，研究了EMS對種子發(fā)芽率、成苗率、發(fā)芽勢的影響，以探討其對高粱的誘變效應(yīng)，為進(jìn)一步開展高粱化學(xué)誘變育種工作提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料供試品種為高粱恢復(fù)系三尺三、M2016、晉粱五號、R111、SP91、112097，2016年種植于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所修文試驗基地，收獲后保存。試驗于2017年在高粱遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新山西省重點實驗室進(jìn)行。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同EMS濃度對高粱種子的誘變試驗設(shè)置EMS溶液的濃度分別為0.1%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%和0.5%。選取子粒飽滿成熟的R111種子，分裝于小紗袋中，每袋100粒，分別放置于7個燒杯中，分別加入不同濃度的EMS溶液浸泡15h，然后將EMS溶液倒掉，用流水沖洗3h，除去殘留的EMS溶液。將種子取出后放入7個培養(yǎng)皿中的無菌濾紙上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱的溫度為25±1℃，7d后分別統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)和正常生長的苗數(shù)并計算發(fā)芽率和成苗率。以蒸餾水浸泡的R111種子作為對照。試驗重復(fù)3次。

1.2.2 不同EMS處理時間對高粱種子的誘變試驗選取子粒飽滿成熟的R111種子，分裝于小紗袋中，每袋100粒，分別放置于6個燒杯中，加入濃度為0.25%的EMS溶液分別浸泡1h、5h、10h、15h、20h、25h后倒掉EMS溶液，無菌水沖洗3h，將種子取出后放入6個培養(yǎng)皿中的無菌濾紙上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱的溫度為25±1℃，7d后分別統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)和正常生長的苗數(shù)，并計算發(fā)芽率和成苗率。以不浸泡的種子作為對照，試驗重復(fù)3次。

1.2.3EMS對不同基因型材料的誘變試驗挑選三尺三、M2016、晉粱五號、R111、SP91、112097高粱恢復(fù)系飽滿成熟的種子，分別裝于小紗袋中，后全部放入一個大燒杯中，加入濃度為0.25%的EMS溶液浸泡10h，倒掉EMS溶液后用流水不斷沖洗3h，除去殘留的EMS溶液。取出種子分別放入6個培養(yǎng)皿中的無菌濾紙上進(jìn)行培養(yǎng)，溫度為25±1℃。以蒸餾水浸泡的種子作為對照，試驗重復(fù)3次。3d后統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)并計算發(fā)芽勢，7d后統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)和正常苗數(shù)，并計算發(fā)芽率和成苗率。

1.3 數(shù)據(jù)分析根據(jù)高粱種子發(fā)芽數(shù)計算種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢，成苗率以直觀統(tǒng)計為主，數(shù)據(jù)分析采用Excel軟件。

發(fā)芽率=（發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100%

成苗率=（7d后正常生長的苗數(shù)/供試種子數(shù)）×100%

發(fā)芽勢=（3d內(nèi)發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1EMS濃度對R111發(fā)芽率和成苗率的影響EMS

處理R111后，發(fā)現(xiàn)種子的發(fā)芽時間推遲，比沒處理的種子推遲2～3d，另外，發(fā)芽后苗的生長也受到抑制，苗高較矮，苗比較細(xì)小。由表1可知，隨著EMS濃度的升高，發(fā)芽率和成苗率下降，在EMS濃度為0.5%時，成苗率為0，所以高粱恢復(fù)系R111的EMS致死濃度為0.5%，按照成苗率近似對照的一半計算，半致死EMS濃度為0.25%，即為適宜的誘變濃度。

表1 EMS濃度對R111發(fā)芽率和成苗率的影響 （%）

2.2 處理時間對R111發(fā)芽率和成苗率的影響以濃度為0.25%的EMS溶液處理R111種子，考察不同處理時間對R111種子發(fā)芽率和成苗率的影響。如表2所示，隨著處理時間的延長，R111的發(fā)芽率和成苗率逐漸降低，當(dāng)處理時間為10～15h，其成苗率大約為對照的一半，所以高粱恢復(fù)系R111適宜的EMS誘變處理時間為10～15h。

表2 不同處理時間對R111發(fā)芽率和成苗率的影響

2.3EMS對不同基因型材料的誘變效果以濃度為0.25%的EMS溶液處理R111、三尺三、M2016、晉粱五號、SP91、112097的種子10h，比較EMS對不同基因型材料的誘變效果。結(jié)果表明，不同基因型材料的發(fā)芽率、成苗率和發(fā)芽勢明顯不同（表3）。在所試驗的濃度和時間下，有些材料的成苗率接近于對照的一半，其半致死濃度為0.25%，如R111、M2016、SP91；有些材料的成苗率低于對照的一半，其半致死濃度小于0.25%，如112097；有些材料的成苗率高于對照的一半，其半致死濃度大于0.25%，如三尺三、晉梁5號。說明不同基因型材料對EMS濃度的敏感程度不同，不同基因型材料有不同的半致死濃度。并且還發(fā)現(xiàn)不同基因型材料的發(fā)芽時間、幼苗高度、幼苗健壯程度都有明顯的差異，而且還會有畸形苗出現(xiàn)。

表3 EMS對不同基因型材料的處理效應(yīng)

3 討論

誘變劑濃度和處理時間是影響誘變處理效果的重要因素[12]。一般認(rèn)為，半致死濃度為適合的處理濃度，濃度過高時對種子的生理損傷大，易導(dǎo)致多數(shù)種子不發(fā)芽；濃度過低時，雖然對種子的生理損傷小，但誘變效果也會降低。根據(jù)本研究的結(jié)果，R111的半致死濃度為0.25%，因此R111適宜的EMS處理濃度為0.25%。而其他品種經(jīng)0.25%濃度的EMS溶液處理10h后，成苗率或接近對照的一半，或高于對照的一半，或低于對照的一半，其最適處理濃度，需要做進(jìn)一步的比較試驗才能得出。適宜的處理時間為使受處理材料完全水合和被誘變劑浸透，處理時間越長，誘變劑在材料中的滲透程度越強，造成材料的生理損傷越大[13]。本研究表明，在半致死濃度處理下，適宜的誘變處理時間為10～15h。EMS誘變處理不僅會對種子的發(fā)芽率和成苗率有影響，而且還會影響幼苗的生長狀態(tài)，試驗中可以觀察到，經(jīng)EMS誘變處理后，種子的發(fā)芽時間延長，幼苗纖細(xì)弱小，有的品種會出現(xiàn)莖部或者葉片發(fā)白現(xiàn)象，另外還觀察到一些畸形苗現(xiàn)象，這說明EMS對高粱種子的誘變效果非常明顯。

4 結(jié)論

EMS誘變處理對種子的發(fā)芽率、成苗率及幼苗的生長狀態(tài)都有明顯的影響，不同基因型對EMS的敏感性不同，半致死濃度有差異。R111的EMS致死濃度為0.5%，半致死濃度為0.25%，適宜的處理時間為10～15h。

[1] 柳學(xué)余.農(nóng)作物化學(xué)誘變育種[M].南京：東南大學(xué)出版社，1992

[2] 崔霞，梁燕，李翠，等.化學(xué)誘變及其在蔬菜育種中的應(yīng)用[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2013，41（3）：205-212

[3] 祝麗英，池書敏，劉志增，等.甲基磺酸乙酯（EMS）在創(chuàng)造玉米新種質(zhì)中的應(yīng)用 [J].玉米科學(xué)，2001，9（3）：14-17

[4] Becker R，Pich A，Socholz G，et al.Development of a TILLING resource in durum wheat for reverse-and forward-genetic analyses[J].Crop Pasture Sci，2014，65（1）：112-124

[5] Xavier S，Roger E，Nathalie G，et al.EMS mutagenesis in mature seedderived rice calli as a new method for rapidly obtaining TILLING mutant populations[J].Plant Methods，2014，10：5-18

[6] Bradley J T，Steven H R，Clifford W，et al.Discovery of induced point mutations in maize genes by TILLING[J].BMC Plant Biol，2004，4：12-20

[7] Aakash C，Per S，Marcus B，et al.Development and characterization of an oat TILLING-population and identification of mutations in lignin and β-glucan biosynthesis genes[J].BMC Plant Biol，2010，10：86-99

[8] 張娜，楊希文，任長忠，等.白燕2號EMS突變體的形態(tài)鑒定與遺傳變異分析[J].麥類作物學(xué)報，2011，31（3）：421-426

[9] 朱保葛，路子顯，耿玉軒，等.烷化劑EMS誘發(fā)花生性狀變異的效果及高產(chǎn)突變系的選育[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1997，30（6）：87-89

[10] 呂鑫，張福耀，平俊愛，等.利用EMS化學(xué)誘變高粱無融合生殖系的研究 [J].中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（22）：160-164

[11] 張會，鄒維華，張友兵，等.優(yōu)質(zhì)能源甜高粱突變體的篩選與鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，34（5）：1-6