子宮肌瘤組織中miR-23、孕激素受體蛋白表達變化及意義

劉烜，歐陽江華，林慧，郝娟

(1青島市婦女兒童醫(yī)院，山東青島266034；2青島市海慈醫(yī)療集團)

子宮肌瘤亦稱子宮平滑肌瘤，是由子宮平滑肌細胞增生而成，是一種常見的良性腫瘤。目前治療以手術為主，藥物治療則局限于控制癥狀與術前準備[1]。目前認為子宮肌瘤是一種激素依賴型腫瘤，受雌激素、催乳素、孕激素等激素調控[2]。微小RNA(microRNA)是一類小分子的非編碼的RNA，通常長約21～23個核苷酸，其主要生理作用是調節(jié)基因的表達[3]。microRNA對相應基因的調控通常不是“開-關”樣作用，而是通過調整細胞對各種生長因子、形態(tài)因子的應答反應，達到調控細胞生長、凋亡的目的[4]。因此microRNA對不同組織不同細胞的調節(jié)作用也不盡相同。microRNA-23(miR-23)隸屬于microRNA-23-27-24基因簇，已被證實在前列腺癌、肝癌等腫瘤細胞中異常表達，且與細胞增殖、分化、侵襲、遷移等密切相關[5]。但miR-23在子宮平滑肌細胞中的作用，尤其是對子宮肌瘤組織中孕激素受體的作用尚不明確。本研究測定子宮肌瘤組織、肌瘤胞膜外肌層組織和正常子宮平滑肌層組織中miR-23的表達，同時檢測孕激素受體(PR)的兩種亞型蛋白(PRA、PRB)的表達，以期探明miR-23在子宮肌瘤中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2010年9月～2015年5月本院婦科收治的子宮肌瘤患者83例，年齡39～56(40.12±8.21)歲；術后均經(jīng)病理檢查確診為單純子宮平滑肌瘤(增生期)；月經(jīng)規(guī)律，無其他嚴重并發(fā)癥；剔除非單發(fā)子宮肌瘤，內分泌異常，近3個月內應用激素類藥物，月經(jīng)不調，合并其他嚴重代謝性疾?。唤?jīng)全子宮切除術、次全子宮切除術取得子宮肌瘤組織、肌瘤胞膜內外各1 cm處組織，于-80 ℃冰箱中儲存。選擇同期確診為單純子宮脫垂患者27例，年齡41～53(41.35±5.17)歲，均處于子宮內膜增生期；行子宮切除術取得子宮肌層組織作為對照，于-80 ℃冰箱中儲存。子宮肌瘤患者、子宮脫垂患者年齡具有可比性。本研究經(jīng)患者及其家屬知情同意，經(jīng)本院倫理協(xié)會批準。

1.2 組織中miR-23表達檢測 采用RT-PCR法。將保存的組織標本取出，PBS沖洗2次，按照TRIzol總RNA試劑盒(上海名勁生物科技有限公司)說明提取總RNA。紫外分光光度計檢測其純度，取OD260/OD280值控制在1.8～2.0的樣本，按PrimeScriptTm反轉錄試劑盒(上海名勁生物科技有限公司)使用說明，將提取的總RNA逆轉錄為cDNA。反應結束后將合成的cDNA樣品稀釋后置于冰上保存。RT-PCR反應以U6 snRNA為內參。引物購自上海名勁生物科技有限公司。U6 snRNA的上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-23上游引物為5′-TCACACTATATCACATTGCCAGG-3′，下游引物為5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3′。反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性12 s，經(jīng)60 ℃退火及延伸45 s，以上循環(huán)40次。以2-ΔΔCt法計算miR-23的相對表達量。

1.3 孕激素受體蛋白表達檢測 采用Western blotting法。將保存的組織標本取出，PBS沖洗2次，加入RIPA裂解液(上海遠慕生物科技有限公司)充分裂解，于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液，-80 ℃沉淀24 h以純化蛋白。將待測蛋白液轉移至PVDF膜(上海遠慕生物科技有限公司)，5%脫脂奶室封閉2 h，與兔抗人PRA、PRB單克隆抗體(一抗，美國Santa Cruz公司)雜交，4 ℃水平搖床過夜，TBST漂洗3次，與鼠抗兔多克隆抗體(二抗，美國Santa Cruz公司)雜交，室溫，水平搖床輕搖2 h孵育。漂洗3次，壓片、曝光，顯影、定影。用Image Master 2D platinum 7.0進行圖像處理，蛋白的相對表達量以待測蛋白與內參GAPDH的灰度值比值表示。

2 結果

2.1 不同組織中miR-23表達比較 子宮肌瘤組織、肌瘤胞膜外子宮肌層組織及正常肌層組織中miR-23相對表達量分別為0.985±0.418、2.198±0.822、2.509±1.220。與肌瘤胞膜外子宮肌層組織及正常肌層組織比較，子宮肌瘤組織中miR-23相對表達量低(t分別為11.984、9.817，P均<0.05)，肌瘤胞膜外子宮肌層組織與正常肌層組織中miR-23相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.504，P=0.136)。

2.2 不同組織中PRA、PRB蛋白表達比較 子宮肌瘤組織、肌瘤胞膜外子宮肌層組織及正常肌層組織中PRA、PRB蛋白相對表達量分別為0.465±0.182、0.196±0.212、0.160±0.127，PRB蛋白相對表達量分別為0.699±0.068、0.302±0.042、0.161±0.037。與肌瘤胞膜外子宮肌層組織及正常肌層組織比較，子宮肌瘤組織中PRA、PRB蛋白相對表達量高(tPRA分別為8.771、8.079，tPRB分別為45.253、39.185，P均<0.05)，肌瘤胞膜外子宮肌層組織與正常肌層組織中PRA蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(t=0.833，P=0.406)，肌瘤胞膜外子宮肌層組織中PRB蛋白相對表達量高于正常肌層組織(t=15.579，P=0.000)。

2.3 子宮肌瘤組織中miR-23與孕激素受體蛋白表達的相關性 Spearman相關分析結果顯示，子宮肌瘤組織中miR-23與PRA蛋白表達呈負相關(rs=-0.225，P=0.041)，miR-23與PRB蛋白表達無相關性(rs=-0.063，P=0.571)，PRA蛋白與PRB蛋白表達無相關性(rs=0.101，P=0.364)。

3 討論

子宮肌瘤是臨床發(fā)病率極高的良性腫瘤。目前子宮肌瘤的具體發(fā)病機制仍不清楚。臨床“孕激素假說”認為，孕激素能夠促進子宮平滑肌細胞有絲分裂，抑制子宮平滑肌細胞凋亡，因此是子宮肌瘤發(fā)病的關鍵[6]。雌激素類藥物臨床應用廣泛，其對子宮肌瘤的治療效果已得到證實，可通過特定信號通路上調孕激素受體蛋白的表達，從而控制子宮肌瘤的發(fā)展[7]。孕激素受體蛋白一般分為PRA、PRB兩種亞型。本研究中，子宮肌瘤組織中PRA、PRB兩種亞型蛋白均在子宮肌瘤組織中高表達，而在肌瘤胞膜外子宮肌層和正常肌層中低表達，這與孕激素假說吻合，提示孕激素受體蛋白的高表達促進子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展。而PRA、PRB兩種受體蛋白在子宮肌瘤組織中的表達并無相關性，提示二者可能通過不同的途徑影響子宮肌瘤，并無拮抗或協(xié)同作用。

microRNAs作為人體的內生非編碼RNA，近年來，因在轉錄后加工這一基因層面參與機體各方面病理生理進程而成為研究的熱點[8]。本研究miR-23即為其中之一。miR-23對機體的調節(jié)體現(xiàn)在多組織、多方面。Lin等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-23對少突膠質細胞的發(fā)育和髓鞘的形成至關重要。Di等[10]則通過檢測冠心病患者血漿miR-23的表達，發(fā)現(xiàn)血液中miR-23的表達升高往往意味著心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生；而敲除血管內皮細胞中的miR-23基因后，不僅血管內皮生長因子的水平得到恢復，病理性的血管新生同時得到了抑制。Yang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-23通過下調X連鎖凋亡抑制蛋白在卵巢粒細胞中的表達，而調控粒細胞的凋亡進程，從而促進卵巢早衰。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-23在子宮肌瘤組織中同樣異常表達，其表達較子宮肌瘤胞膜外肌層組織與正常肌層組織低，提示miR-23可能發(fā)揮抑癌基因功能，參與子宮肌瘤的發(fā)生與發(fā)展進程。另外，miR-23的表達與PRA蛋白的表達呈負相關，提示低表達的miR-23可能促進PRA蛋白的表達，從而促進子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展。因此可以推測miR-23與抑制PRA蛋白表達的信號通路有關。而miR-23的表達與PRB蛋白的表達無明顯相關性，提示兩者可能通過不同的途徑影響子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-23在子宮肌瘤組織中異常表達，并可能通過特定途徑影響PRA蛋白的表達，從而參與子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展。而PRB蛋白與miR-23、PRA蛋白的影響途徑應當不同。具體的作用機制與途徑尚需進一步的研究探索。