急性髓系白血病患兒骨髓中miR-34表達變化及其與預(yù)后的關(guān)系

李暉，陳開瀾 ，蔡瑋

(武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心，武漢430016)

兒童急性髓系白血病(AML)是一種異質(zhì)性很高的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，約占兒童白血病的20%[1]。近年來，得益于危險分級治療、異基因造血干細胞移植等研究的進展，兒童AML的治療轉(zhuǎn)歸得到了很大的提高，3年總體生存率達60%～75%[2～4]。然而，依然有部分患者初始療效不佳，并且治療初次緩解患者約1/3可能復(fù)發(fā)[5]。因此，探尋新穎、有效的診斷和預(yù)后標志物，為AML患兒早期選擇最佳治療方案提供依據(jù)。microRNA(miRNA)是近年來在多種真核細胞及病毒中發(fā)現(xiàn)的一類參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，不具有蛋白質(zhì)編碼功能的小分子單鏈RNA，是由18～22個核苷酸組成的短序列[6]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在AML的發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療及預(yù)后中都起重要作用[7，8]。miRNA-34(miR-34)在人體中由miR-34a、miR-34b、miR-34c組成。研究證明，miR-34在體外可抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡，并可抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，可作為腫瘤治療和預(yù)后的標志物[9～11]。然而，目前miR-34在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中尤其在兒童AML中的作用尚不明確，本研究對此進行探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年8月～2013年7月本中心治療的初發(fā)AML患兒81例(AML組)，參考中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會血液學(xué)組《兒童急性髓細胞白血病診療建議》進行診斷和治療[12]。其中男51例、女30例，年齡4.5～11.1、中位年齡8.5歲；FAB分類為M1型5例、M2型27例、M3型13例、M4型16例、M5型17例、M6型1例、M7型1例；均隨訪至2016年8月1日，隨訪38～59個月、中位隨訪時間48個月。同時納入年齡、性別相匹配的行骨髓穿刺檢查的非血液系統(tǒng)腫瘤疾病兒童28例為對照組，男16例、女12例，年齡5.9～12.5歲、中位年齡10.1歲。其中血小板減少性紫癜18例，診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會血液學(xué)組制定的《特發(fā)性血小板減少性紫癜診療建議》[13]；感染性疾病8例，診斷依據(jù)為美國感染病學(xué)會診斷標準[14]；健康志愿者2例，均為骨髓捐贈者。本研究通過本中心倫理委員會批準，受試者家屬均簽署知情同意書。

1.2 骨髓中miR-34表達檢測 采用RT-PCR技術(shù)。兩組行骨髓穿刺，采集骨髓2～4 mL置于EDTA管中，提取單核細胞。按照RNA提取試劑盒TRIzol Reagent(Invitrogen)的操作說明提取總RNA。利用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，用1%變性瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA提取的質(zhì)量。按照One Step PrimerScript miRNA cDNA Synthesis Kit(Takara)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進行RNA反轉(zhuǎn)錄，采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ (Takara)試劑盒進行定量PCR，并以U6小核RNA作為內(nèi)參。用2-ΔΔt法計算miR-34a、miR-34b、miR34c的相對表達量，每個樣本重復(fù)3次實驗。用Primer Premier 5.0軟件進行miR-34a、miR-34b、miR34c及U6引物設(shè)計。miRNA-34a反轉(zhuǎn)錄引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG ACAACCAG、上游引物：ACACTCCAGCTGGG TGGCAGTGTCTTAGCTGG、下游引物：TGTCGTGGAGTCGGCAATTC；miRNA-34b反轉(zhuǎn)錄引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG ATGGCAGT、上游引物：ACACTCCAGCTGGG CAATCACTAACTCCACTG、下游引物：TGTCGTGGAGTCGGCAATTC；miRNA-34c反轉(zhuǎn)錄引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG GCAATCAG、上游引物：ACACTCCAGCTGGGAGGCAGTGTAGTTAGCTG、下游引物：TGTCGTGGAGTCGGCAATTC；U6上游引物：TCGCTTCGGCAGCACATATAC、下游引物：ATGGAACGCTTCACGAATTTGC。根據(jù)miR-34a、miR-34b、miR34c相對表達量的中位數(shù)分為miR-34a、miR-34b、miR34c低表達、高表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料用中位數(shù)(25%～75%)表示，比較采用Wilcoxon秩和檢驗；用受試者工作特征曲線(ROC)評估m(xù)iR-34對兒童AML患病風(fēng)險的預(yù)測效能；采用Kaplan-Meier、Log-Rank分析miRNAs與兒童AML總生存期(OS)的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組骨髓中miR-34a、miR-34b、miR-34c表達比較 AML組miR-34a、miR-34b、miR-34c相對表達量分別為0.121(0.039～0.384)、0.170(0.095～0.217)、0.081(0.029～0.241)；對照組分別為0.475 (0.227～0.788)、0.308(0.177～0.407)、0.389(0.171～0.800)。與對照組比較，AML組骨髓中miR-34a、miR-34b、miR-34c相對表達量低(P均<0.05)。

2.2 miR-34a、miR-34b、miR-34c對兒童AML患病風(fēng)險的預(yù)測效能 根據(jù)ROC曲線，miR-34a預(yù)測兒童AML患病風(fēng)險的AUC為0.815，95%CI: 0.733～0.897；miR-34b AUC為0.781，95%CI:0.675～0.887；miR-34c AUC為0.819，95%CI:0.723～0.915；三者聯(lián)合檢測預(yù)測兒童AML患病風(fēng)險的AUC為0.839，95%CI:0.741～0.937；取三者聯(lián)合檢測后回歸概率中位值作為切割點，敏感度為63.0%，特異度為85.7%。

2.3 miR-34c與AML患兒OS的關(guān)系 miR-34a高表達患兒OS為46.2(36.6～59.4)個月、低表達患兒OS為41.2(29.9～52.7)個月，比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.156)；miR-34b高表達患兒OS為44.9(36.5～62.1)個月、低表達患兒OS為41.2(28.4～52.6)個月，比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.117)；miR-34c高表達患兒OS為46.2(39.5～60.9)個月、低表達患兒OS為38.4(28.4～51.8)個月，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)。

3 討論

miR-34家族成員中miR-34a由位于染色體1p36的轉(zhuǎn)錄本編碼，而miR-34b、miR-34c共享1個位于染色體11q23的原始轉(zhuǎn)錄簇[13]。體外實驗中，miR-34a可通過直接靶向程序性死亡配體1(PD-L1)非編碼區(qū)，調(diào)控PD-L1的表達，進而抑制AML[14]。在慢性淋巴細胞白血病(CLL)中，miR-34a表達下調(diào)，通過抑制BAX和P21基因表達促進細胞凋亡、抵抗DNA損傷應(yīng)答減弱和化療抵抗[15]，表明miR-34a有抑癌作用。此外，miR-34a在多個實體腫瘤(結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌等)組織中低表達[16]。本研究結(jié)果顯示，miR-34a在AML患兒骨髓中低表達，與成人AML類似[14]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)miR-34a表達與患兒OS不相關(guān)，可能因其對化療敏感度影響較小。

在AML 3細胞系中，miR-34b通過直接靶向熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控Wnt-β-catenin通路和熱休克蛋白27的表達，進而抑制腫瘤細胞[17]。miR-34b在AML患者骨髓細胞中低表達，且體外實驗發(fā)現(xiàn)miR-34b表達上調(diào)會引起細胞周期異常，抑制基質(zhì)非依賴性生長，調(diào)控環(huán)腺苷酸響應(yīng)因子結(jié)合蛋白表達，進而起到抑癌作用[18]。因此，miR-34b在許多腫瘤(結(jié)腸癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌、成人AML等)組織中低表達[16,18]。本研究發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，AML患兒骨髓中miR-34b表達下調(diào)。本研究同時發(fā)現(xiàn)miR-34b骨髓表達與患兒OS不相關(guān)，可能因其對化療敏感度影響較少。

miR-34c在多種腫瘤(喉部鱗癌、結(jié)腸癌、乳腺癌)組織中發(fā)揮抑癌作用[19～21]。在鼻咽癌組織中miR-34c直接靶向MET基因，從而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[22]；在子宮內(nèi)膜癌組織中miR-34c直接通過靶向E2F3蛋白基因，抑制細胞分化、遷徙，并誘導(dǎo)細胞周期異常，從而實現(xiàn)抑癌作用[23]。此外，miR-34c在CLL發(fā)生發(fā)展中起重要作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-34c在AML患兒骨髓中呈低表達，與研究結(jié)果一致[25]。miR-34a、miR-34b、miR-34c聯(lián)合檢測進行兒童AML患病風(fēng)險預(yù)測，敏感度和特異度較高，提示miR-34家族在診斷兒童AML中的潛在作用。除此以外，本研究還發(fā)現(xiàn)，骨髓miR-34c表達與AML患兒的長期預(yù)后相關(guān)，miR-34c高表達的患兒OS更長，與相關(guān)研究[25]結(jié)果相符。這可能與miR-34c的抑癌作用、提高化療藥物敏感度有關(guān)[9,16]。

綜上所述，AML患兒骨髓中miR-34a、miR-34b、miR-34c低表達，三者聯(lián)合檢測可作為兒童AML潛在的診斷標志物；且miR-34c表達與患者OS相關(guān)。本研究尚存在不足之處，樣本量較小、單中心研究。因此進一步研究方向為進行多中心、前瞻性大樣本的隊列研究，以更加深入全面評估m(xù)iR-34在AML患兒診斷和預(yù)后中的作用。

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