KDM2B過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建及其在人卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)

蒙家華，況燕，盧芳芳，易葉葉，徐紅

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

表觀遺傳機(jī)制包括DNA甲基化、非編碼RNA調(diào)節(jié)、染色質(zhì)重塑和組蛋白修飾，參與調(diào)節(jié)真核細(xì)胞的多種生理功能。因此，細(xì)胞調(diào)控任何部分的表觀遺傳變化都可能導(dǎo)致細(xì)胞功能異常，引起多種疾病。其中賴氨酸特異性脫甲基酶2B(KDM2B)是組蛋白H3第36位賴氨酸殘基和第4位賴氨酸殘基的特異性去甲基化酶，通過影響組蛋白的甲基化狀態(tài)對其靶基因的表達(dá)發(fā)揮表觀調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白甲基化異常參與調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。組蛋白甲基化是由組蛋白去甲基化酶和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的動態(tài)調(diào)節(jié)過程。KDM2B是含有JmjC、CXXC-ZF結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶[1]，能通過催化H3K36me3和H3K4me3去甲基化影響多種基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。有研究表明，KDM2B為抑制rRNA轉(zhuǎn)錄的核仁蛋白，參與細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞永生化，抑制細(xì)胞衰老，并在細(xì)胞形態(tài)學(xué)、趨化因子表達(dá)和成纖維細(xì)胞的代謝控制中起調(diào)節(jié)作用[2]。2016年7～11月，本研究通過構(gòu)建KDM2B過表達(dá)慢病毒載體并穩(wěn)定感染卵巢癌細(xì)胞株A2780及SKOV3，為進(jìn)一步研究KDM2B對卵巢癌生物學(xué)行為的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌A2780、SKOV3細(xì)胞獲贈于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院協(xié)和醫(yī)院婦瘤實(shí)驗(yàn)室。GV358載體、AgeI/AgeI酶購自上海吉凱基因有限公司。引物設(shè)計(jì)和合成、對GV慢病毒載體的改造和病毒包裝由上海吉凱基因有限公司完成。嘌呤霉素購自北京Solarbio科技有限公司，RPMI Medium 1640購于GIBCO公司，胎牛血清購于杭州四季青公司，總RNA提取試劑盒購于Axygen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TAKARA公司，SYBR Gree Real Time PCR Mix 購于Roche 公司。PCR引物由TAKARA公司合成。細(xì)胞蛋白提取試劑盒購于北京Solarbio科技有限公司，兔抗人KDM2B多克隆抗體購于Abcan公司，兔抗人Actin抗體購于Abcan公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購于CST公司。

1.2 KDM2B目的片段獲取 根據(jù)GeneBank提供的KDM2B信息數(shù)據(jù)(序列號NM_032590)，用限制性內(nèi)切酶消化獲得線性化載體。PCR擴(kuò)增制備目的基因片段。設(shè)計(jì)、合成含交換配對堿基、酶切位點(diǎn)及目的基因5′端部分序列的同源重組序列，用PCR釣取目的基因序列，KDM2B(21416-11) P1：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCGGGTCC-

GCAAATGGGGGGATCTGCAG,KDM2B(21416-11)

P2：TCCTTGTAGTCCATACCACTCAGTTTTTGCAGG-

AGTTTTTCTTCTAC。配制反應(yīng)體系50 μL，反應(yīng)條件：98 ℃ 5 min、98 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 8 min。

1.3 KDM2B過表達(dá)慢病毒重組質(zhì)粒構(gòu)建 獲取的PCR產(chǎn)物與線性化表達(dá)載體進(jìn)行交換重組，重組產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定，并進(jìn)行測序及結(jié)果分析。PCR鑒定引物，KDM2B(21416-11) P3：CAGATGGAGCGCCATGTGATC；FLAG-R-2：CCTTATAGTCCTTATCATCGTC。將正確克隆菌液擴(kuò)大培養(yǎng)、抽提，獲得高純度質(zhì)粒。對產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶。將鑒定陽性的克隆轉(zhuǎn)化子接種于適量含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)12～16 h，取適量菌液進(jìn)行測序。

1.4 A2780、SKOV3細(xì)胞感染 感染前1 d將對數(shù)生長期的A2780及SKOV3細(xì)胞用胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度，以8×104/孔接種于6孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長至50%～60%時(shí)，更換ENi.s培養(yǎng)基800 μL。根據(jù)Polybrene感染試劑說明書進(jìn)行操作。以30的感染指數(shù)用LV-KDM2B過表達(dá)慢病毒感染A2780、SKOV3細(xì)胞(LV-KDM2B感染組)，同時(shí)感染LV-CON作為陰性對照(LV-CON感染組)，以未感染的A2780、SKOV3細(xì)胞作為空白對照組。感染72 h后電子顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，并拍照。待細(xì)胞長滿后，置于培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。感染72 h后，熒光顯微鏡下可觀察到明顯的綠色熒光，GFP熒光發(fā)光率達(dá)95%以上，表明成功構(gòu)建KDM2B過表達(dá)慢病毒細(xì)胞株。并于感染72 h后加入含終濃度為3 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5 d，獲穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

1.5 A2780A及SKOV3細(xì)胞內(nèi)KDM2B mRNA表達(dá)檢測 采用RT-qPCR技術(shù)。感染96 h，收集嘌呤霉素篩選后的A2780、SKOV3細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，Thermo NANODROP 2000f分光光度計(jì)檢測RNA濃度與純度。用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，擴(kuò)增KDM2B及內(nèi)參基因。KDM2B上游引物：5′-CTCACTGCTGTTGGCACCAC-3′、下游引物：5′-TGCTTGCAGTACCTCAGGTCAATA-3′。β-actin為內(nèi)參，上游引物：5′-GCCAACACAGTGCTGTCTGG-3′、下游引物：5′-GCTCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′。反應(yīng)體系在Agilent Mx3000p實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上完成。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火、延伸 60 s，共40個(gè)循環(huán)，4 ℃終止。2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 A2780A及SKOV3細(xì)胞內(nèi)KDM2B蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。感染96 h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。SDS-PAGE分離膠濃度為8%，濃縮膠濃度為5%，上樣孔加入變性后的蛋白樣品40 μg和預(yù)染分子量Marker，電壓120 V，溴酚藍(lán)前沿到達(dá)分離膠底端處停止電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5% BSA封閉液封閉1 h，將膜置于一抗(Anti-KDM2B兔多克隆抗體1∶1 000，兔抗人ACTIN抗體1∶2 000)中，4 ℃孵育過夜，TBST每次5 min，漂洗膜3次，加入二抗(羊抗兔IgG 1∶1 000)中室溫?fù)u床避光孵育1 h，TBST漂洗膜3次，采用Odyssey紅外熒光掃描系統(tǒng)掃膜并拍照。以目的蛋白灰度值比內(nèi)參蛋白灰度值作為目的蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 KDM2B過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建結(jié)果 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物大小為4 052 bp，與預(yù)期大小一致。線性化載體和目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)環(huán)化后，挑取單克隆行PCR鑒定顯示陽性轉(zhuǎn)化子產(chǎn)物大小為964 bp，與預(yù)期相符。挑取出的陽性克隆子測序結(jié)果顯示，與目標(biāo)序列完全一致，表明KDM2B過表達(dá)重組質(zhì)粒已成功構(gòu)建。

2.2 各組A2780、SKOV3細(xì)胞中KDM2B mRNA表達(dá)比較 以LV-CON感染組細(xì)胞KDM2B mRNA表達(dá)量為1，LV-KDM2B感染組A2780細(xì)胞中KDM2B mRNA表達(dá)升高(77.59±13.67)倍，SKOV3細(xì)胞中升高(57.96±8.76)倍，較空白對照組亦有上調(diào)，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；而LV-CON組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.3 各組A2780、SKOV3細(xì)胞中KDM2B蛋白表達(dá)比較 以 LV-CON組細(xì)胞KDM2B蛋白表達(dá)量為1，感染組A2780細(xì)胞中KDM2B蛋白表達(dá)升高(4.34±1.16)倍，SKOV3細(xì)胞中升高(3.93±1.6)倍，較空白對照組亦有上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；空白對照組與LV-CON組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

3 討論

卵巢癌是常見的女性生殖器官惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌[3]。因其生長部位隱蔽，早期癥狀及體征不明顯，且缺乏簡便實(shí)用的診斷方法，病死率居高不下。研究卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)是目前亟待解決的問題。隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展及其對腫瘤調(diào)控機(jī)制不斷深入研究，組蛋白修飾在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也引起重視。組蛋白修飾能夠介導(dǎo)抑癌基因的沉默失活，激活癌基因。惡性腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展依賴于連續(xù)的遺傳和表觀遺傳改變，這些變化可能以細(xì)胞自主的方式發(fā)生，或者來自周圍基質(zhì)的環(huán)境信號。多項(xiàng)研究表明，表觀遺傳學(xué)改變可能是多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制。

KDM2B是含有JmjC、CXXC-ZF結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶，具有H3K4me3、H3K36me2去甲基化酶活性，通過影響組蛋白甲基化水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。近年來對KDM2B在癌癥中的作用和機(jī)制已進(jìn)行了較多的研究，但其在機(jī)體中的生物學(xué)行為及作用相當(dāng)復(fù)雜。研究結(jié)果表明，KDM2B在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[4]。近年來的研究顯示，KDM2B在人類睪丸、脾臟和胸腺組織中表達(dá)最高[5]，在乳腺癌、膀胱癌和胰腺癌組織中亦有較高表達(dá)[4，6，7]。Andricovich等[8]研究證明，KDM2B在造血系統(tǒng)惡性腫瘤的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。Zhao等[9]發(fā)現(xiàn)，KDM2B在胃癌細(xì)胞中表達(dá)升高，KDM2B表達(dá)下調(diào)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞增殖。過表達(dá)KDM2B可通過與遷移相關(guān)基因啟動子區(qū)域結(jié)合，在遷移中起關(guān)鍵作用，從而使細(xì)胞更具侵襲性[10]。但KDM2B在早期腦瘤組織中低表達(dá)，且過表達(dá)KDMB可抑制HeLa細(xì)胞生長和增殖[11]。有報(bào)道稱，KDM2B表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致女性X染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄物過度表達(dá)，引起胚胎發(fā)育異常和早期死亡[12]。而最近研究發(fā)現(xiàn)，KDM2B表達(dá)下調(diào)可抑制卵巢癌細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖與遷移[13]，與上述研究結(jié)果相反。KDM2B沉默可提高腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體敏感性、活化Caspase-8、Caspase-7及PARP切割，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。Frescas等[2]還觀察到，KDM2B可通過抑制核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄，干擾腫瘤細(xì)胞的增殖和代謝；并認(rèn)為KDM2B在人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中起抑制腫瘤的作用。綜合以上研究，推測KDM2B的生物學(xué)功能在不同組織學(xué)類型的腫瘤中是有區(qū)別的，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

盡管研究發(fā)現(xiàn)KDM2B與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；但其在卵巢癌細(xì)胞中的作用仍未闡明。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，KDM2B在卵巢癌組織中過表達(dá)；體外敲低實(shí)驗(yàn)顯示，沉默KDM2B的表達(dá)可以抑制卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。鑒于前期研究的成果，尚需通過過表達(dá)KDM2B進(jìn)一步鑒定其在卵巢癌細(xì)胞中的生物學(xué)行為，論證其在卵巢癌中的功能及作用。本研究構(gòu)建了KDM2B過表達(dá)慢病毒載體LV-KDM2B，感染并獲得穩(wěn)定表達(dá)KDM2B的A2780、SKOV3細(xì)胞株。結(jié)果表明，細(xì)胞KDM2B mRNA及蛋白表達(dá)均增加。成功構(gòu)建的KDM2B過表達(dá)慢病毒載體，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

本研究成功構(gòu)建了過表達(dá)KDM2B的A2780/SKOV3穩(wěn)定細(xì)胞株，通過慢病毒介導(dǎo)的方法，提高KDM2B在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)，為探明卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及精準(zhǔn)靶基因治療的研究開發(fā)提供新思路。

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