乳酸菌作為DNA疫苗載體的研究進(jìn)展

易德瑋，羅 玲，楊坤明，韓奇鵬

（湖南正虹科技發(fā)展股份有限公司，湖南 岳陽 414418）

隨著對疫苗傳遞系統(tǒng)的深入研究，科學(xué)工作者們期望找到一種能在機(jī)體體內(nèi)較長時間存在、且對機(jī)體本身安全又能產(chǎn)生持續(xù)免疫力的傳遞載體，而乳酸菌是一類食品級、非侵襲及非致病性的微生物，是動物胃腸道常在菌群，將其作為載體系統(tǒng)來表達(dá)外源蛋白有著不可替代的優(yōu)點[1-2]?？茖W(xué)工作者們試圖利用其定植腸道發(fā)揮表達(dá)抗原的黏膜免疫效果的特點而應(yīng)用在疫苗的研發(fā)中[3-4]。近年來，乳酸菌質(zhì)粒載體系統(tǒng)、食品級載體及電穿孔轉(zhuǎn)化技術(shù)發(fā)展迅速，以乳酸菌作為研制載體疫苗成為可能[5]。本文就乳酸菌作為DNA疫苗載體進(jìn)行綜述。

1 DNA疫苗

DNA疫苗是編碼免疫原或與免疫原相關(guān)因子的真核表達(dá)質(zhì)粒DNA或RNA，是20世紀(jì)90年代初出現(xiàn)的繼減毒疫苗、基因工程疫苗后的第三代新型疫苗，具有免疫效果好、容易制備、生產(chǎn)成本低、臨床應(yīng)用方便等優(yōu)點[6]。DNA疫苗經(jīng)多種接種途徑進(jìn)入動物體內(nèi)，被動物宿主細(xì)胞攝取后能轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)出的抗原蛋白通過刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性和特異性兩種免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而起到免疫保護(hù)作用。據(jù)報道埃博拉病毒、瘧疾、艾滋病和腫瘤等DNA疫苗已相繼通過美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗[7-8]。

DNA疫苗的優(yōu)點：比傳統(tǒng)疫苗安全、穩(wěn)定性好、用量少且效果好[6,9]。盡管DNA疫苗與弱毒疫苗免疫原性相當(dāng)，但是DNA序列編碼的僅是單一的一段病毒基因，基本沒有毒性逆轉(zhuǎn)的可能，故不存在減毒疫苗毒力回升的致病危險[10]。DNA疫苗生產(chǎn)成本低廉，貯存方便，且適于大批量生產(chǎn)[11]。DNA接種載體（如質(zhì)粒）的結(jié)構(gòu)簡單，提純質(zhì)粒DNA的工藝簡便，并且DNA分子克隆較容易，故DNA疫苗可根據(jù)需要隨時進(jìn)行更新，此外，質(zhì)粒本身可作為佐劑，故不需額外再加佐劑[12]。相較于原核表達(dá)，DNA疫苗可以在遞送病毒或寄生蟲抗原的過程中，對抗原表位進(jìn)行翻譯后的糖基化加工，這對某些抗原表位的構(gòu)象非常重要，而原核表達(dá)系統(tǒng)中沒有糖基化過程，因此更適用于原核病原菌。

DNA疫苗的不足之處：DNA疫苗作為基因調(diào)控的方式，附帶的外源基因也被導(dǎo)入機(jī)體后，該外源基因可能會激活宿主內(nèi)源性原癌基因或使宿主抑癌基因失活，會使疫苗具有較低的免疫原性，還能引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗DNA抗體，目前研究人員們暫時沒檢測出DNA疫苗相關(guān)基因組整合到宿主細(xì)胞中[13-14]。

2 乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)的特點

Pouwels等試驗發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可將外源蛋白表達(dá)于菌體細(xì)胞內(nèi)，外源蛋白分泌效率高有利于促進(jìn)局部或全身黏膜免疫反應(yīng)，表明乳酸桿菌作為活菌的疫苗抗原載體能夠表現(xiàn)出較高的安全性[15]。乳酸菌作為一種原核表達(dá)系統(tǒng)，在保證機(jī)體安全的前提下，能夠發(fā)揮持續(xù)且高效的免疫力，該菌之所以能作為極具開發(fā)前景的理想抗原呈遞載體，有以下特點：易培養(yǎng)，且某些菌種自帶染色體外因子可構(gòu)建出新的表達(dá)載體系統(tǒng)；遺傳操作方法簡便、且重復(fù)性好、效率高；乳酸菌安全性較高，表達(dá)的外源蛋白無需進(jìn)行純化，便可直接連同菌體一起服用；具有高度且可調(diào)控的啟動子系統(tǒng)，能表達(dá)毒素基因；能保障基因工程產(chǎn)品的相對安全性，構(gòu)建出可供直接口服的食品級表達(dá)系統(tǒng)，如糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，乳鏈球菌素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)，噬菌體Φ31爆發(fā)式誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)，pH調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)等；能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)和免疫耐受，且持續(xù)時間較長；外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)外均可獲得良好的表達(dá)效果[16-17]。

3 乳酸菌在DNA疫苗中的作用機(jī)理

乳酸菌一直被應(yīng)用于食品發(fā)酵和保存中,屬于食品級的細(xì)菌，其本身可作為DNA疫苗載體，因無侵入能力，故其遞送DNA的能力不強(qiáng)，而減毒沙門菌這類弱致病菌由于可侵入到細(xì)胞中，因此可以能更好的遞送DNA，因此通過模擬病原菌的侵入過程，應(yīng)用基因克隆、遺傳修飾等方法構(gòu)建侵入型重組乳酸菌，可以使其具有更好的遞送能力。根據(jù)乳酸菌質(zhì)粒載體上啟動子類型的不同，可將其分為組成型表達(dá)載體和誘導(dǎo)型表達(dá)載體，乳鏈菌肽誘導(dǎo)表達(dá)載體是目前最具應(yīng)用前景的乳酸菌誘導(dǎo)型表達(dá)載體，已成功地表達(dá)了同源或異源的菌體蛋白、酶類、膜蛋白、細(xì)菌素及某些抗原類等[18-19]。另外，疫苗載體菌株的不同會影響重組乳酸菌疫苗的免疫效果[20-21]。主要是因為不同乳酸菌在胃腸道存活率、體內(nèi)定植狀況、免疫調(diào)節(jié)功效及其與GALT的作用方式等方面均存在差異，而乳酸乳球菌作為表達(dá)外源蛋白的理想菌株有其獨特優(yōu)勢，經(jīng)實踐證明是較安全的，其自身分泌蛋白較少[22]。此外，由于乳酸乳球菌不屬于人和動物的共生菌群，基本不在胃腸道內(nèi)定植，可避免定植而導(dǎo)致的免疫耐受[4,23]。

4 乳酸菌在DNA疫苗中的作用研究進(jìn)展

乳酸乳球菌可以大量產(chǎn)生并遞送抗原及細(xì)胞因子，時下已成為口服DNA疫苗的運載工具。為了增加DNA的遞送能力，研究人員試圖通過改造乳酸菌使其成為具有侵入能力的乳酸菌。金黃色葡萄球菌是一種具有侵入宿主細(xì)胞能力的病原菌，經(jīng)研究表明其細(xì)菌表面表達(dá)的纖連蛋白結(jié)合蛋白A（Fn?BPA）對其侵入能力起著絕對重要的作用[24]。由此可知在乳酸乳球菌中表達(dá)外源FnBPA后會使乳球菌本身獲得侵入細(xì)胞的能力，另外，新型質(zhì)粒pV?alac也可在乳酸菌中進(jìn)行表達(dá)，從而作為構(gòu)建真核DNA疫苗的一種載體，該新型質(zhì)粒由來自牛生長激素（BGH）中的聚腺苷酸化序列（polyA）和巨細(xì)胞病毒啟動子（pCMV）兩部分組成。Guimar?es等將帶有綠色熒光蛋白（GFP）的pValac質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至PK15及Caco-2細(xì)胞中并得到相應(yīng)的表達(dá)[25]。鑒于乳酸乳球菌沒有定植能力，因此只能在黏膜水平上對蛋白質(zhì)進(jìn)行加工和傳遞[26]。同時使乳酸乳球菌在體內(nèi)和體外均能將功能完整的質(zhì)粒遞送到真核細(xì)胞中[27]。懷著進(jìn)一步提高乳酸菌的細(xì)胞侵入能力的目標(biāo)，科學(xué)工作者們已在乳酸乳球菌中表達(dá)了外源蛋白Fn?BPA和InIA（產(chǎn)單核細(xì)胞內(nèi)化蛋白），并通過體內(nèi)試驗和體外試驗檢測到FnBPA及InIA的表達(dá)情況，該研究結(jié)果表明外源侵入型蛋白的表達(dá)可有效增強(qiáng)乳酸菌的侵入能力，與表達(dá)FnBPA的乳酸菌菌株FnBPA+是體內(nèi)傳遞質(zhì)粒的最佳選擇載體的研究結(jié)果吻合[28]。另外，研究表明，F(xiàn)nBPA或InIA的乳酸乳球菌不僅在體內(nèi)的胃腸道中還在體外細(xì)胞中，都能提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移效率[29]。乳桿菌屬植物乳桿菌為乳酸菌中另一典型的菌種，定植于胃腸道，相較于乳酸乳球菌，其耐受胃酸和膽鹽的能力更強(qiáng)，能更好地在消化道存活,且菌體自身具有較強(qiáng)的免疫刺激功效,該菌具有免疫調(diào)節(jié)和佐劑的特性[4,30]。研究表明，該植物乳桿菌能對醫(yī)學(xué)上重要的蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，并能以多種方式對其進(jìn)行表面錨定，基于乳酸菌能將cDNA遞送到宿主細(xì)胞。Michon等為了提高植物乳桿菌遞送DNA的能力，構(gòu)建了表面錨定表達(dá)針對樹突狀細(xì)胞（DCs）表面的受體DEC-205的重組單鏈抗體（aDec）的植物乳桿菌，其特異性抗體在乳桿菌表面表達(dá)能增強(qiáng)乳桿菌對DC的靶向作用及結(jié)合能力，因而提高cDNA向DC的傳遞能力[31]。且在體外的細(xì)胞中或在體內(nèi)的胃腸道中，重組單鏈抗體在菌種表面上的表達(dá)都能提高質(zhì)粒由乳酸菌進(jìn)入到樹突狀細(xì)胞的傳遞效率。

5 小結(jié)

乳酸菌作為DNA疫苗載體具有很好發(fā)展前景和研究價值，關(guān)于乳酸菌作為疫苗載體已有20多年發(fā)展歷史，主要是使用乳酸菌作為外源蛋白載體對機(jī)體進(jìn)行免疫，從而抵抗通過消化道和呼吸道黏膜進(jìn)入體內(nèi)的病原體，在乳酸菌中還有許多隱蔽性質(zhì)粒存在，需要深入研究[32-33]。目前可用于構(gòu)建疫苗的載體菌株僅限于乳酸球菌和乳酸桿菌屬中的幾個菌株,表達(dá)的抗原蛋白僅限于幾種,構(gòu)建成功的疫苗也不多，因此開發(fā)更多、更有效的疫苗載體株，構(gòu)建更多、更有效的疫苗是今后的研究方向。