山楂葉總黃酮對(duì)慢性腦缺血大鼠p38MAPK信號(hào)通路的影響

吳曉光 白江濤 苗光新 李蒙蒙 苗 惠

(承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點(diǎn)研究室，河北 承德 067000)

研究表明缺血性腦卒中損傷機(jī)制的關(guān)鍵與腦缺血缺氧后細(xì)胞正常的穩(wěn)態(tài)環(huán)境受到破壞，某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)生紊亂，神經(jīng)細(xì)胞死亡密切相關(guān)〔1〕。p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中成員的一個(gè)亞型，其激活后通過(guò)鏈?zhǔn)郊?jí)聯(lián)反應(yīng)，激活轉(zhuǎn)錄因子如活化轉(zhuǎn)錄因子(ArF)-2等，促進(jìn)炎癥因子，凋亡基因的表達(dá)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用〔2〕。山楂葉總黃酮(TFHL)具有抗氧化〔3〕，減輕炎癥反應(yīng)〔4〕，調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路〔5〕等腦保護(hù)作用，但對(duì)p38MAPK信號(hào)通路的影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究以慢性腦缺血模型大鼠為研究對(duì)象，以TFHL為干預(yù)手段，觀察其對(duì)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及腦組織p38MAPK蛋白表達(dá)的影響，探討TFHL對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與分組 清潔級(jí)SD大鼠，48只，體質(zhì)量230～250 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔動(dòng)物合格證：scxk(京)2014-0004〕。適應(yīng)飼養(yǎng)1 w后大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、慢性腦缺血模型組、TFHL組，銀杏葉片組，每組12只。

1.2藥物與試劑 TFHL由承德復(fù)康藥業(yè)有限公司，純度58%，用0.5%碳酸氫鈉溶液稀釋成濃度為140 mg/ml；銀杏葉片(揚(yáng)子江藥業(yè)有限公司提供)；p38單克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司提供)。

1.3動(dòng)物模型制備及給藥 模型組、TFHL組、銀杏葉片組的大鼠，采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法〔5〕建立慢性腦缺血模型：3.5%水合氯醛麻醉，頸部正中切口，無(wú)創(chuàng)傷鑷子鈍性分離皮下組織及下頜下腺，玻璃分針小心分離雙側(cè)的頸總動(dòng)脈，雙線結(jié)扎并用電刀切斷頸總動(dòng)脈防止復(fù)流，碘伏消毒后，縫合切口，每只腹腔注射10萬(wàn)U青霉素，預(yù)防感染。術(shù)后24 h內(nèi)未蘇醒者剔除，并及時(shí)補(bǔ)遺。假手術(shù)組僅用玻璃分針游離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不做結(jié)扎處理。術(shù)后第30天開(kāi)始，TFHL組給予TFHL 140 mg·kg-1·d-1灌胃，銀杏葉片組給予銀杏葉提取物6.5 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)30 d。假手術(shù)組給予等量生理鹽水灌胃。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 定位航行實(shí)驗(yàn):在TFHL給藥第30天，將大鼠依次放入Morris水迷宮進(jìn)行適應(yīng)性游泳訓(xùn)練1次，共計(jì)60 s，不放平臺(tái)，不記錄成績(jī)行。給藥第31天，將平臺(tái)放入任一象限中，進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，用于檢測(cè)大鼠對(duì)空間記憶的獲得能力：將大鼠從A、B、C、D 4個(gè)入水點(diǎn)面向池壁依次放入水中，觀察在60 s內(nèi)大鼠找到并爬上平臺(tái)所用的時(shí)間(逃避潛伏期)。若60 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)到平臺(tái)并在平臺(tái)上停留15 s，潛伏期記為60 s，每天1次，共6 d。空間探索實(shí)驗(yàn)：用于檢測(cè)大鼠對(duì)平臺(tái)區(qū)域的準(zhǔn)確記憶能力：第6天，定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，撤去平臺(tái)，由第2象限入水點(diǎn)面向池壁放入大鼠，觀察大鼠在60 s穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)及平臺(tái)象限游泳路程百分比。

1.4.2Western印跡法檢測(cè)p38MAPK蛋白的表達(dá) 末次給藥后1 h，斷頭取海馬組織，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗凈血液，加入裂解液和10 μl PMSF(10 mg/ml)，4℃勻漿，10 000 r/min，離心30 min，取上清液，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。再經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、10% 脫脂奶粉封閉，加p38一抗(1∶150)4℃過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶1 000)室溫孵育2.5 h，超敏電化學(xué)發(fā)光液發(fā)光，X線片暗盒內(nèi)曝光，D72顯影液顯影，利用Quantity One軟件分析X線膠片的灰度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1TFHL對(duì)各組定位航行能力的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期和尋找平臺(tái)游泳路程明顯延長(zhǎng)；TFHL和銀杏葉片藥物干預(yù)后，大鼠逃避潛伏期和尋找平臺(tái)游泳路程明顯縮短(P<0.05，P<0.01)，銀杏葉片組優(yōu)于TFHL組，但兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2TFHL對(duì)大鼠空間探索能力的影響 與假手術(shù)組比較，模型組在60 s內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)次數(shù)明顯減少，平臺(tái)象限游泳路程百分比明顯降低(均P<0.01)；TFHL和銀杏葉片藥物干預(yù)后，大鼠穿越平臺(tái)區(qū)次數(shù)分別增多，平臺(tái)象限游泳路程百分比明顯增加(P<0.05，P<0.01)，銀杏葉片組優(yōu)于TFHL組，但兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.3TFHL對(duì)大鼠p38MAPK蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組(0.007 9±0.002 1)比較，模型組p38MAPK蛋白表達(dá)顯著升高(0.025 4±0.001 83，P<0.01)；與模型組比較，TFHL組和銀杏葉片組p38MAPK蛋白表達(dá)明顯降低(0.016 1±0.003 2，0.015 7±0.000 24，P<0.01)；銀杏葉片組優(yōu)于TFHL組，但兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

表1 各組定位航行能力比較

與假手術(shù)組比較:1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

表2 各組空間探索能力比較

1～4：假手術(shù)組、模型組、TFHL組和銀杏葉片組圖1 各組腦組織p38MAPK蛋白表達(dá)的變化

3 討 論

慢性腦缺血是神經(jīng)系統(tǒng)一種常見(jiàn)的病理生理狀態(tài)，由長(zhǎng)期腦灌注不足引起，可出現(xiàn)能量代謝障礙氧化應(yīng)激-神經(jīng)遞質(zhì)改變-神經(jīng)元缺失等變化，同時(shí)伴有大量膠質(zhì)細(xì)胞增生，是阿爾茨海默病和血管性癡呆等許多與年齡相關(guān)性疾病的共同的病理生理過(guò)程〔6〕。慢性腦缺血導(dǎo)致的血管性癡呆以持久性或進(jìn)展性認(rèn)知功能障礙為主要特點(diǎn)，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降，對(duì)其發(fā)病機(jī)制及藥物干預(yù)的研究具有重要的臨床意義〔7,8〕。腦缺血激活了級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致缺血半暗帶逐漸消失，壞死的腦組織區(qū)域增大，如何在腦部缺血性損傷后采取積極有效的治療措施搶救缺血半暗帶并減少腦組織的死亡區(qū)域，是提高腦梗死后患者生命質(zhì)量的關(guān)鍵。

慢性持續(xù)性腦血流量降低可導(dǎo)致神經(jīng)元不斷的凋亡，引起進(jìn)行性的認(rèn)知功能障礙，最終導(dǎo)致血管性癡呆的發(fā)病。凋亡是多基因控制的程序性細(xì)胞死亡過(guò)程。MAPK屬于絲氨酸芳氨酸蛋白激酶家族，存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，是真核細(xì)胞細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞反應(yīng)的一類重要信號(hào)通路，在缺血性腦損傷中起著調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和分化的作用〔9〕。p38MAPK是MAPKs家族重要成員之一，其活化后介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境變化的應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、發(fā)育、存活及死亡多種重要的細(xì)胞生理/病理過(guò)程。腦缺血時(shí)，p38MAPK被激活，其表達(dá)水平及上游和下游蛋白磷酸化水平均發(fā)生改變，介導(dǎo)了腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡〔10,11〕。有研究表明，側(cè)腦室或舌下靜脈注射p38MAPK抑制劑SB 203580可減輕腦組織缺血引起的神經(jīng)元凋亡〔12〕，縮小腦損傷的體積，改善神經(jīng)功能的缺陷〔9〕。本研究結(jié)果提示TFHL具有抑制腦缺血誘發(fā)的p38MAPK過(guò)度表達(dá)的作用，同時(shí)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著提高與對(duì)p38MAPK信號(hào)途徑的調(diào)控有關(guān)。

1趙雅寧，劉 樂(lè)，安朝旺，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯通過(guò)抑制p38有絲分裂原激活蛋白激酶通路改善大鼠缺血性腦損傷〔J〕.解剖學(xué)雜志，2011;34(1)：48-51.

2李國(guó)輝，王耀輝.p38信號(hào)通路與缺血性腦卒中〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2014;16(7)：779-80.

3吳曉光，李 玲，苗光新，等.山楂葉總黃酮對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶的干預(yù)作用及機(jī)制〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2015;35(14):3819-22.

4檀榮芳，夏愛(ài)華，吳曉光，等.山楂葉總黃酮抑制慢性腦缺血大鼠腦組織神經(jīng)元凋亡〔J〕.中國(guó)組織工程研究,2014;18(49):7879-83.

5趙 蕾，張曉紅，吳柏成，等.山楂葉總黃酮對(duì)腦缺血大鼠腦組織 PI3K/Akt信號(hào)通路的影響〔J〕.廣東醫(yī)學(xué)，2014;35(7):982-4.

6牟靜靜，孟 星，孟盼盼，等.腦脈泰對(duì)慢性腦缺血大鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用及其機(jī)制研究〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2015;32(1)：21-4.

7余 芬，張軍建.慢性腦缺血大鼠海馬中APE的表達(dá)與神經(jīng)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2006;5(4):363-6.

8王曉天，劉曉梅，尤紅娟，等.p38MAPK介導(dǎo)的Fas/FasL凋亡通路在缺血性腦損傷中的作用研究〔J〕.中國(guó)醫(yī)藥指南，2014;12(31)：1-2.

9祝萍萍,徐 恩.p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腦缺血〔J〕.國(guó)際腦血管病雜志，2011;19(11)：853-6.

10Roychoudhury G，Ryou MG，Poteet E,etal.Involvement of p38MAPK in reactive astroghosis induced by schemlc stroke〔J〕.Brain Res，2014;1551：45-58.

11李 浩，張多斌，吳 嵐，等.丹參酮ⅡA對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠磷酸化p38MAPK和MMP-9表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2013;30(30):229-33.

12Nito C，Kamada H，Endo H，etal.Role of the p38 mitogenactivated profein kinase/cytosolic phospholipase A2 signaling pathwayin blood brain barrierd isruption after focal cerebral ischemia and reperfusion〔J〕.J Cereb Blood How Metab，2008;28(10)：1686-96.