老年心肌梗死患者長(zhǎng)期服用氯吡格雷后腸道轉(zhuǎn)運(yùn)體P糖蛋白和多耐藥基因C4546T的表達(dá)

趙 瑩 馮思建 劉雪晶 張丹丹 劉明明 盧婷婷 宋 靜

(牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院心內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157011)

氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林是預(yù)防心肌梗死復(fù)發(fā)的主要治療方案，但用藥后仍時(shí)有復(fù)發(fā)，可能與氯吡格雷耐藥有關(guān)〔1〕。氯吡格雷為腸道轉(zhuǎn)運(yùn)體P糖蛋白的底物，而P糖蛋白是由多耐藥基因(MDR)表達(dá)的一種能量依賴性跨膜蛋白，可將作用底物由細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞外，降低藥物的吸收和生物利用度〔2〕。目前已知的MDR 60多個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)(SNPs)中，外顯子32號(hào)的C4546T基因多態(tài)性可發(fā)揮多種功能〔3〕。研究顯示，MDR1 C4546T基因可調(diào)控氯吡格雷在腸道中的代謝〔4〕。本研究擬分析連續(xù)服用氯吡格雷1年以上的老年心肌梗死患者和健康老年體檢者淋巴細(xì)胞上P糖蛋白的表達(dá)情況和C4546T基因多態(tài)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年6月至2016年10月在牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院心內(nèi)科住院的連續(xù)服用氯吡格雷1年以上的老年心肌梗死患者106例為實(shí)驗(yàn)組。排除標(biāo)準(zhǔn)：①同時(shí)服用血小板糖蛋白受體抑制劑者；②合并循環(huán)系統(tǒng)疾病，出血高危者；③嚴(yán)重肝腎功能障礙、惡性腫瘤者。其中男42例，女64例，年齡60～91〔平均(70.65±13.42)〕歲。選取同期在本院行健康體檢的老年志愿者62例對(duì)照組，男27例，女35例，年齡60～88〔平均(69.41±10.85)〕歲。兩組性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2標(biāo)本與試劑 抽取兩組受試者空腹外周靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝處理后冷藏待測(cè)；Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)于北京百泰克生物技術(shù)有限公司，Taq酶、隨機(jī)引物購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司，反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司。

1.3方法

1.3.1P糖蛋白測(cè)定 流式細(xì)胞上樣管中加入抗凝全血13 μl、抗-P糖蛋白抗體6 μl，振蕩均勻；每個(gè)樣本均設(shè)置未加抗體的空白對(duì)照。室溫下避光靜置20 min，滴加2 ml紅細(xì)胞裂解液，振蕩均勻，避光靜置10 min，2 000 r/min離心10 min；除去上清液、滴加3 ml血球稀釋液，振蕩均勻，2 000 r/min離心10 min，重復(fù)操作2次；加入500 μl稀釋液，振蕩均勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.2外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 人淋巴細(xì)胞分離液處理EDTA抗凝血得到單個(gè)核細(xì)胞，Trizol提取總RNA，紫外分光光度法檢測(cè)濃度，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。反應(yīng)體系：總RNA 2 μl、隨機(jī)引物1 μl、雙蒸水12 μl，70℃反應(yīng)10 min，冰上冷卻，2 000 r/min離心5 min，加入dNTP 10 μl、MMLV-RT 5 μl，混合均勻，37℃反應(yīng)40 min，-20℃保存。

1.3.3PCR擴(kuò)增及測(cè)序 依據(jù)MDR C4546T序列設(shè)計(jì)引物，上游：5′-CGACGAACTACCGTTTCTTT-3′，下游：5′-TAATCCGTCACTGAGCTACT-3′，由北京源宜基因科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20 μl：cDNA 1 μl、dNTP 3 μl、Taq酶0.5 μl、上游和下游引物分別1 μl、雙蒸水13.5 μl。反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)呈陽(yáng)性的結(jié)果送北京源宜基因科技有限公司測(cè)序。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P糖蛋白情況 實(shí)驗(yàn)組P糖蛋白在淋巴細(xì)胞膜上表達(dá)水平(22.14±7.61)明顯高于對(duì)照組(10.89±4.46，P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組中T/C型表達(dá)水平明顯高于C/C型、T/T型及對(duì)照組各基因型(均P<0.05)；對(duì)照組C/C型、T/C 型、T/T型P糖蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

2.2總RNA提取及C4546T目的片段擴(kuò)增情況 分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞、提取總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示存在7、15、20 S 3條清晰條帶，A270/A290比值為2.15，加樣孔及周圍未檢出DNA。反轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增生成與目的產(chǎn)物一致的210 bp片段，見圖1。

表1 兩組各基因型P糖蛋白表達(dá)比較

與實(shí)驗(yàn)組T/C比較：1)P<0.05

圖1 總RNA提取及C4546T目的片段

2.3兩組C4546T突變基因電泳和測(cè)序情況 見表2。實(shí)驗(yàn)組C4546T突變基因陽(yáng)性率〔50.94%(54/106)〕明顯高于對(duì)照組〔40.32%(25/62)〕(χ2=5.925,P<0.05)。雙向測(cè)序后用DNAstar軟件處理后比較，兩組均以C/C型比例最高，與T/C、T/T型組內(nèi)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組T/C型比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。C4546T突變基因陽(yáng)性在服用氯吡格雷1年以上的老年心肌梗死患者中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是健康老年人群的1.64倍，T/C基因型出現(xiàn)頻率是健康老年人群的2.69倍。

表2 兩組 C4546T突變基因陽(yáng)性患者測(cè)序情況〔n(%)〕

與本組C/C比較：1)P<0.05

3 討 論

氯吡格雷與阿司匹林聯(lián)用是目前預(yù)防心肌梗死復(fù)發(fā)的主要方案，但相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，P糖蛋白在不同人群中分布具有差異性，可導(dǎo)致氯吡格雷療效不同〔5〕。體內(nèi)正常組織中P糖蛋白可發(fā)揮保護(hù)作用，腸道組織中其可作為屏障，阻止藥物代謝產(chǎn)物的吸收，造血干細(xì)胞高表達(dá)P糖蛋白可減輕藥物和毒性物質(zhì)的損傷〔6〕。目前，該領(lǐng)域的研究多集中在MDR表達(dá)多態(tài)性對(duì)血液藥物濃度分布或腫瘤細(xì)胞中藥物濃度的影響〔7〕。但關(guān)于氯吡格雷抵抗與P糖蛋白表達(dá)方面的研究仍鮮有報(bào)道。

氯吡格雷是P糖蛋白作用底物，長(zhǎng)時(shí)間服用氯吡格雷會(huì)誘導(dǎo)體內(nèi)組織細(xì)胞，特別是淋巴細(xì)胞的P糖蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響氯吡格雷在細(xì)胞中的分布，影響其藥效作用，甚至出現(xiàn)耐藥性。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，P糖蛋白是由MDR基因編碼，目前已發(fā)現(xiàn)C4546T位點(diǎn)上的基因突變，之前的C被T取代，改變了P糖蛋白的表達(dá)水平〔8〕。本研究結(jié)果提示，C4546T基因突變率與老年心肌梗死患者長(zhǎng)期服用氯吡格雷存在相關(guān)性，其中T/C基因型P糖蛋白表達(dá)與患者氯吡格雷耐藥相關(guān)，可能參與了耐藥機(jī)制的形成。

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