右歸丸對腎陽虛大鼠精子的作用

謝怡敏，姚歡

右歸丸最早載于張景岳先生的《景岳全書》[1]：大懷熟八兩;山藥炒四兩;山茱萸微炒三兩;鹿角膠炒珠四兩;菟絲子炙四兩;杜仲姜汁炒四兩;當(dāng)歸三兩;肉桂二兩;制附子二兩。每嚼服二、三丸。以滾白湯送下,其效尤速。方中附子、肉桂、鹿角膠培補(bǔ)腎中之元陽,溫里祛寒,為君藥。熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥滋陰益腎,養(yǎng)肝補(bǔ)脾,填精補(bǔ)髓,取“陰中求陽”之義,為臣藥。正如張介賓所言:“善補(bǔ)陽者,必于陰中求陽,則陽得陰助,而生化無窮?！弊粢暂私z子、杜仲補(bǔ)肝腎,健腰膝;當(dāng)歸養(yǎng)血和血,與補(bǔ)腎之品相配,以補(bǔ)養(yǎng)精血。諸藥合用,肝脾腎陰陽兼顧,仍以溫腎陽為主,妙在陰中求陽,使元陽得以歸原,故名“右歸丸”。本方從腎氣丸中減去“三瀉”,而加入大隊補(bǔ)藥,這就使藥效專于溫補(bǔ)。同時,將腎氣丸中干地黃改為熟地黃,也使此方溫性大增,而不同于腎氣丸的平補(bǔ)。

本實驗擬以右歸丸治療腎陽虛大鼠，觀察其精子活動率改變及睪丸和附睪的重量、血液中睪酮的檢測，考察右歸丸對腎陽虛大鼠精子的作用。

1 材料與試劑

1.1 藥材

右歸丸基本藥物組成:熟地黃24 g、山藥12 g、山茱萸9 g,枸杞子9 g、菟絲子12 g、鹿角膠12 g、杜仲12 g、肉桂6 g、當(dāng)歸 9 g、制附子6 g、淫羊藿12 g、補(bǔ)骨脂12 g。藥材購于成都杏林藥房，打磨成粉劑，用雙蒸水溶解，根據(jù)中華人民共和國藥典，每公斤體重10.26 g灌胃給予實驗動物。

1.2 試劑

氫化可的松，天津金耀氨基酸有限公司，批號：1106021。

1.3 實驗動物

成年雄性SD大鼠，SPF級，體重約200 g，由四川成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）2013-24。

2 方法

2.1 造模及分組

實驗動物的制備：隨機(jī)將動物分為正常對照組，腎陽虛組，腎陽虛右歸丸治療組三組，腎陽虛組（5只），大腿內(nèi)側(cè)肌肉豐富處注射氫化可的松25 mg﹒(kg﹒d)-1,連續(xù)21天。正常對照組按2 mL﹒d-1，皮下注射生理鹽水，連續(xù)21天。腎陽虛右歸丸組模型組造模方法同腎陽虛組，第8天開始右歸丸組每天灌胃右歸丸，共14 d[2]。正常組和模型組以生理鹽水灌胃。

2.2 睪丸、附睪稱重及精子的獲取

斷脊髓法處死大鼠，迅速取睪丸和附睪，先用生理鹽水洗去粘附的毛發(fā)和血液等，濾紙吸干，雙側(cè)睪丸、附睪稱重。將一側(cè)附睪尾置于裝有培養(yǎng)液的EP管中，用小剪刀將附睪尾煎碎，放入37℃孵箱30 min后，制備精子懸液。

2.3 精子活動度檢測

將精液用Ham’s F-10培養(yǎng)液（Hyclone公司）稀釋后，調(diào)節(jié)密度至1×107個/mL，每份精子標(biāo)本分為兩個標(biāo)本，用計數(shù)器計算每類精子的數(shù)目，向血細(xì)胞計數(shù)板的每個計數(shù)槽加入10 μL的精子標(biāo)本。按WHO方法檢測A級精子比率，B級精子比率[3]。

A 快速前向運動（37℃，速度≥25 um/s）；B慢速或呆滯的前向運動

C 非前向運動；D 不動

2.4 ELISA法測血清T的含量

各組大鼠心臟取血，待血液凝固后吸取血清，設(shè)置空白/標(biāo)準(zhǔn)和待測孔，標(biāo)準(zhǔn)孔加樣50uL,待測孔加入待測血清10 μL和樣品稀釋液40 μL，37℃孵育30 min，洗滌液洗滌5次，每孔加入50 μL酶標(biāo)試劑，空白孔除外，37℃，30 min；洗滌5次，每孔先加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B50 μL，輕輕混勻，37℃避光顯色10 min后，加入終止液50 μL，用酶標(biāo)儀測定450 nm各孔的吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照每組樣本的A450，查出各自的濃度。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 利用軟件SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 各組間采用方差分析，P＜0.05認(rèn)為有顯著差異。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠表現(xiàn)

空白組大鼠無異常，明顯較另外兩組大鼠狀態(tài)好，皮毛光澤，活躍好動，精神良好。腎陽虛組大鼠倦怠，運動減少，注射部位出現(xiàn)脫毛，食欲下降，體溫降低。腎陽虛加右歸丸組狀態(tài)居于未見明顯異常，但活動度不如空白組，較腎陽虛組要好。

3.2 各組大鼠睪丸、附睪重量比較

結(jié)果如表1所示，模型組和右歸丸組睪丸較正常組明顯減少，模型組和右歸丸組未見明顯改變。附睪重量正常組和右歸丸組明顯高于模型組。

表1 各組大鼠睪丸、附睪重量比較

3.3 精子活動度檢測

結(jié)果如表2所示，A、B級精子正常組和右歸丸組明顯高于模型組。

表2 各組大鼠A、B級精子比例

3.4 血清T水平檢測

結(jié)果如表3所示，血清T含量正常組和右歸丸組明顯高于模型組。

表3 各組大鼠血清T檢測

4 討論

目前世界上約6～8千萬對不育夫婦,占已婚夫婦的10%～15%左右,其中40%～50%為男性不育,且有逐年增多的趨勢。我國約有10%的夫婦患有不育癥,全國男性不育者約有5000萬人(2010年)。腎陽虛是造成男性不育的最重要原因。

腎為臟腑之本，十二經(jīng)之根，與命門同一氣。腎陽對各臟腑有推動和溫煦作用，能提升臟腑之陽，如果腎陽不足，會引起很多臟器功能不足，如神疲乏力，精神萎靡，手腳冰冷，疲勞嗜睡，腰膝酸軟，神疲乏力，夜尿多，性功能減弱，陽痿早泄，舌淡苔白，脈弱等。腎陽虛證為中醫(yī)的基本證型之一，有研究發(fā)現(xiàn)右歸丸對腎陽虛的作用機(jī)制與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的下丘腦-垂體-性腺功能有關(guān)，還有研究發(fā)現(xiàn)腎氣丸、五子衍宗丸等對腎陽虛大鼠精子功能有明顯改善[4]，我們用右歸丸對腎陽虛大鼠的作用結(jié)果說明右歸丸對腎陽虛所致內(nèi)分泌生殖功能紊亂也有明顯的改善。右歸丸是明代儒醫(yī)張介賓的名方。在張介賓的《景岳全書》卷51用于治療腎陽不足，命門火衰的常用方?，F(xiàn)今多用于治療性功能減退、腎病綜合征及腰肌勞損等腎陽虛癥。方中附子、肉桂辛熱入腎,溫壯元陽；淫羊藿、補(bǔ)骨脂溫補(bǔ)腎陽。

睪酮主要由睪丸的間質(zhì)細(xì)胞分泌，并能與FSH一起促進(jìn)睪丸的曲細(xì)精管的發(fā)育及產(chǎn)生精子并維持附睪中精子的成熟，刺激并保持第二性征的出現(xiàn)。睪酮也是附睪、輸精管、精囊和前列腺等發(fā)育和成熟所必須的，睪酮進(jìn)入前列腺后，經(jīng)5a-還原酶的作用生成活性更強(qiáng)的雙氫睪酮，睪酮的分泌受下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)[5]。

本研究采用右歸丸治療腎陽虛大鼠，可明顯增加腎陽虛大鼠的附睪重量、A級和B級精子比率級睪酮含量，說明右歸丸對腎陽虛大鼠的生殖內(nèi)分泌有明顯治療作用。