低內(nèi)毒素蔗糖細菌內(nèi)毒素檢查方法的建立

羅莉婭，茍立平，鄧星，陳英杰，萬麗

蔗糖是一種從甘蔗、甜菜和其他來源中獲得的糖，為無色結(jié)晶或白色結(jié)晶性的松散粉末，無臭，味甜。蔗糖是一種廣泛使用的藥用輔料，可在口服制劑中作黏合劑、矯味劑，在凍干蛋白產(chǎn)品中作稀釋劑，在凍干注射劑中作凍干賦形劑等[1]。基于低內(nèi)毒素蔗糖可用于注射劑的制備，本文根據(jù)2015年版《中國藥典》（四部）通則1143“細菌內(nèi)毒素檢查法”項下凝膠法的要求[2]，建立了低內(nèi)毒素蔗糖細菌內(nèi)毒素的檢查方法。

1 材料

1.1 儀器

BET-32型細菌內(nèi)毒素測定儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；ZH-2自動漩渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；SEG-021H高溫試驗箱（上海愛斯佩克環(huán)境設(shè)備有限公司）。試驗用試管、刻度吸管等玻璃器材按藥典規(guī)定，于250 ℃下，干熱滅菌1 h，去除外源性內(nèi)毒素。

1.2 藥品與試劑

低內(nèi)毒素蔗糖（廠家：德國Merck，批號：K47396392610、K47390298692、K47396398614規(guī)格：50 kg/袋）；鱟試劑[湛江安度斯生物有限公司，批號：1612191，靈敏度（λ）：0.125 EU﹒mL-1，規(guī)格：0.1 mL/支；福州新北生化工業(yè)有限公司，批號：16061212，靈敏度（λ）：0.125 EU﹒mL-1，規(guī)格：0.1 mL/支]；細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-201681，規(guī)格：80 EU/支）；細菌內(nèi)毒素檢查用水（湛江安度斯生物有限公司，批號：1609200，規(guī)格：50 mL/瓶）

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品細菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

在歐洲藥典中，按規(guī)定的公式L=K/M計算，當(dāng)蔗糖用于大容量注射用藥物的制備時，其內(nèi)毒素需≤0.25 EU﹒mg-1[3]。式中K為人每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，M為人用每千克體重每小時的最大樣品劑量。與此同時，參照廠家提供的低內(nèi)毒素蔗糖的要求，故將低內(nèi)毒素蔗糖細菌內(nèi)毒素限值定為1 EU﹒g-1。

2.2 供試品最小有效稀釋質(zhì)量濃度（c）的確定

按2015年版《中國藥典》細菌內(nèi)毒素檢查規(guī)定，MVD=cL/λ，L為細菌內(nèi)毒素限值，λ為TAL的標(biāo)示靈敏度。最小有效稀釋濃度為c=λ/L=(0.125 EU﹒mL-1)/ (0.001 EU﹒mg-1) =125 mg﹒mL-1。

2.3 TAL靈敏度復(fù)核

按照2015年版《中國藥典》（四部）通則1143“細菌內(nèi)毒素檢查法”規(guī)定，進行TAL的靈敏度復(fù)核。根據(jù)TAL的λ=0.125 EU﹒mL-1，用BET水溶解細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，在旋渦混合器上混勻15分鐘，配制成2.0 λ、1.0 λ、0.5 λ、0.25 λ四種濃度的細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均在旋渦混合器上混勻30秒鐘，每個濃度平行4管；另外2管加入BET水作為陰性對照管。取2批不同廠家的TAL分別進行試驗，結(jié)果TAL靈敏度測試值（λ）均在0.5 λ～2.0 λ之間，符合規(guī)定，可以用于細菌內(nèi)毒素檢查試驗，結(jié)果見表1（注：“+”表示試劑形成凝膠且倒轉(zhuǎn)不變形或滑落，即反應(yīng)呈陽性；“-”表示未形成凝膠不結(jié)實、變形并脫落，即反應(yīng)呈陰性。以下各表同）。

表1 TAL的靈敏度復(fù)核試驗結(jié)果

2.4 干擾預(yù)試驗

稱取供試品（批號: K47396392610）約20 g，用BET水稀釋制成濃度分別為375、250、150、125 mg﹒mL-1的系列溶液，標(biāo)記為供試品陰性對照管（NPC系列，各2管）；用上述系列溶液作為溶劑，分別溶解并稀釋CSE，制得細菌內(nèi)毒素含量均為2.0 λ的供試品陽性對照管（PPC系列，各2管）；同時做細菌內(nèi)毒素陽性對照管（PC）和BET水陰性對照溶液（NC），各2管，然后按“細菌內(nèi)毒素檢查法”操作，進行干擾預(yù)試驗，結(jié)果見表2。由表2結(jié)果可知，供試品稀釋至150 mg﹒mL-1時，2批λ為0.125 EU﹒mL-1的TAL對細菌內(nèi)毒素檢查試驗均無干擾作用。

表2 樣品干擾預(yù)試驗結(jié)果

2.5 干擾試驗

根據(jù)預(yù)干擾試驗結(jié)果，取3個批號的低內(nèi)毒素蔗糖，用BET水稀釋成150 mg﹒mL-1的樣品溶液。用BET水和此濃度的稀釋液分別將同一支細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成含細菌內(nèi)毒素2.0、1.0、0.5、0.25 λ四種系列溶液，每個濃度平行4管。另取細菌內(nèi)毒素檢查用水和此濃度的稀釋液各做2支，作為陰性對照管。用2批TAL，按2015年版《中國藥典》（四部）通則1143“細菌內(nèi)毒素檢查法”的規(guī)定進行干擾試驗，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，用BET水制成的細菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Es）均在0.5 λ ～2.0 λ之間，此濃度稀釋液制成的細菌內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Et）均在0.5 Es ～2.0 Es之間，此時供試品對TAL與細菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)無干擾作用。

表3 樣品干擾試驗結(jié)果

2.6 樣品細菌內(nèi)毒素檢查

取3批供試品各適量，用BET水制成含維生素E質(zhì)量濃度為150 mg﹒mL-1的供試品溶液，分別用2批λ為0.125 EU﹒mL-1的TAL，按2015年版《中國藥典》（四部）通則1143“細菌內(nèi)毒素檢查法”進行試驗，按要求做陽性（PPC、PC）、陰性（NPC、NC）對照，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示3批供試品每1 g中含細菌內(nèi)毒素的量均小于1 EU。

表4 樣品干擾預(yù)試驗結(jié)果

3 討論

本實驗利用鱟試劑來檢測由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素，以判斷低內(nèi)毒素蔗糖中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定，而本法則是通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理進行試驗?，F(xiàn)行世界各國藥典以及國際藥典對此方法均有收載，其具有操作簡單、檢測周期短、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點[4-6]。建立內(nèi)毒素檢查法時進行干擾試驗，目的是評價樣品質(zhì)量濃度對鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的干擾程度，初步篩選出對細菌內(nèi)毒素檢查無干擾的樣品質(zhì)量濃度范圍[7]。不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑由于生產(chǎn)工藝、質(zhì)量參數(shù)等方面存在一定的不同，其抗干擾能力存在差異，故本試驗采用2個不同廠家的鱟試劑（λ= 0.125 EU﹒mL-1）對3個批號的樣品進行試驗，可對實驗結(jié)果進行對比[8]。結(jié)果表明，低內(nèi)毒素蔗糖稀釋至質(zhì)量濃度≤150 mg﹒mL-1時，不干擾細菌內(nèi)毒素的檢查。因此，低內(nèi)毒素蔗糖用凝膠法進行細菌內(nèi)毒素檢查是可行的。