我國(guó)蟲(chóng)生真菌的研究現(xiàn)狀

余垚穎，郭應(yīng)菊，楊 雪，王明富

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，四川 成都 610066)

蟲(chóng)生真菌是寄生在昆蟲(chóng)、蜘蛛等幼蟲(chóng)或成蟲(chóng)上的真菌。我國(guó)已報(bào)道昆蟲(chóng)病原真菌有400多種，其中寄生昆蟲(chóng)的真菌215種[1]，作為殺蟲(chóng)劑的種類(lèi)主要有白僵菌(Beauveria)、綠僵菌(Metarhizium)、玫色擬青霉(P.fumosoroseus)、蠟蚧輪枝菌(Verticilliumlecantii)、湯氏被毛孢(H.thompsonii)、座殼孢(Aschersonia)、鐮刀菌(Fusarium)、蟲(chóng)霉目(E.muscae)等[2]；作為藥用真菌的冬蟲(chóng)夏草(Ophiocordycepssinensis)、蛹蟲(chóng)草(Cordycepsmilitaris)、蟬花(C.cicadae)等[3]。目前，我國(guó)擁有世界上最大的蟲(chóng)生真菌研究隊(duì)伍，其次為美國(guó)、巴西和英國(guó)等不同國(guó)家的研究團(tuán)隊(duì)，研究主要集中在分子生物學(xué)、致病機(jī)理、害蟲(chóng)生物防治、育種工程等方面。

1 蟲(chóng)生真菌研究動(dòng)態(tài)

1.1 分子生物學(xué)研究

蟲(chóng)生真菌在分子生物學(xué)方面的研究是為了解決蟲(chóng)生真菌殺蟲(chóng)速率緩慢的弱點(diǎn)，以期從分子生物學(xué)水平上提高菌株的殺蟲(chóng)毒力，在最大程度及范圍上發(fā)揮蟲(chóng)生真菌在害蟲(chóng)控制上的優(yōu)勢(shì)及潛力[4]。主要分為以下幾個(gè)步驟：①蛋白酶純化：目前所分離、純化的酶類(lèi)主要是蟲(chóng)生真菌入侵昆蟲(chóng)體壁過(guò)程中所產(chǎn)生的蛋白酶類(lèi)，因而在不同程度上表現(xiàn)與菌株毒力相關(guān)。如St Leger由巨大蜚蠊(Blaverus gigantesu)體壁離體誘導(dǎo)試驗(yàn)表明：金龜子綠僵菌孢子萌發(fā)過(guò)程至少有42種蛋白產(chǎn)生，其中主要為酸性蛋白酶(pl4.2-5.6)，這些酶類(lèi)一般均由結(jié)構(gòu)不同的同工酶組成為一個(gè)酶系[5]。②基因克?。豪貌粩喔倪M(jìn)的克隆技術(shù)，各類(lèi)生物模式種的遺傳密碼正逐步得到詮釋?zhuān)x(chóng)生真菌中約有20余種基因被克隆測(cè)序，研究表明：蟲(chóng)生真菌的毒力基因多以基因簇(gene cluster)的形式存在[6-7]。③表達(dá)調(diào)控：蟲(chóng)生真菌不同蛋白酶的結(jié)構(gòu)基因被克隆、測(cè)序后，人們最感興趣的還是其精確表達(dá)調(diào)控的機(jī)理，從而爭(zhēng)取得到人為設(shè)計(jì)和調(diào)控的目的。④基因工程，主要體現(xiàn)在3個(gè)方面：一是將蟲(chóng)生真菌作為宿主細(xì)胞接受外源基因的試驗(yàn)；二是將蟲(chóng)生真菌的毒力因子(如pr1基因)導(dǎo)入殺蟲(chóng)真菌受體菌，構(gòu)建永久型表達(dá)的菌株，以提高真菌的殺蟲(chóng)效率；三是使用帶有外源基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子進(jìn)行釋放試驗(yàn)，以驗(yàn)證工程菌株的環(huán)境穩(wěn)定性及與當(dāng)?shù)鼐甑幕蚪涣髑闆r。

1.2 致病機(jī)理研究

蟲(chóng)生真菌侵染寄主的復(fù)雜過(guò)程主要可分為3個(gè)階段：①體表附著階段；②體壁穿透階段；③體內(nèi)定殖及致死階段[8]。整個(gè)過(guò)程涉及寄主識(shí)別、機(jī)械破壞、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、代謝干擾、毒素分泌及寄主組織結(jié)構(gòu)破壞等，這些多因子作用最終導(dǎo)致寄主死亡[9]。

1.2.1 體表附著階段 蟲(chóng)生真菌附著體表階段又可分為2個(gè)不同階段[10]：①非特異性附著階段，主要是疏水孢子與疏水昆蟲(chóng)體壁進(jìn)行被動(dòng)附著，附著力較弱。如Wang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)金龜子綠僵菌孢子表面的粘著蛋白(adhesin)MAD1基因，伴隨孢子萌發(fā)，該基因表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)。該基因被缺失后，綠僵菌孢子對(duì)寄主體表的附著能力顯著下降。②特異性的主動(dòng)附著階段，通過(guò)誘導(dǎo)分泌的孢外蛋白酶類(lèi)作用分生孢子牢固地附著在昆蟲(chóng)體壁上。

1.2.2 體壁穿透階段 蟲(chóng)生真菌的體壁穿透階段分為2個(gè)不同的階段：①附著胞的形成：昆蟲(chóng)體壁由外向內(nèi)可分為上表皮、前表皮、后表皮和皮脂層4層結(jié)構(gòu)，主要由蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)組成，是防止大多數(shù)病原微生物入侵的有效物理屏障。研究表明，至少有Ca2+和cAMP 2種第二信使參與信號(hào)傳導(dǎo)途徑與附著胞的形成有關(guān)[12]。②分解寄主外殼的水解酶：蟲(chóng)生真菌在入侵昆蟲(chóng)體壁的過(guò)程中，會(huì)分泌蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂酶等多種胞外水解酶類(lèi)[13]。蛋白酶的降解作用不僅利于菌絲穿透侵入，同時(shí)也為菌絲的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

1.2.3 體內(nèi)定殖階段 體內(nèi)定殖階段分為3個(gè)階段：①免疫抵抗反應(yīng)：蟲(chóng)生真菌侵染至昆蟲(chóng)血腔后，面臨著宿主的細(xì)胞免疫及體液免疫作用，蟲(chóng)生真菌要實(shí)現(xiàn)成功的侵染定殖必須戰(zhàn)勝宿主的一系列免疫保護(hù)反應(yīng)。②分泌毒素：蟲(chóng)生真菌之所以能夠克服寄主的免疫殺菌作用，不但與其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)重新包裝改造有關(guān)，而且還同真菌分泌的毒性次生代謝產(chǎn)物有關(guān)。③體內(nèi)生長(zhǎng)：在感染寄主的過(guò)程中，蟲(chóng)生真菌抵抗宿主免疫作用的最終目的是為了進(jìn)行有效的生長(zhǎng)繁殖。

1.3 毒力基因工程研究

蟲(chóng)生真菌基因工程改良首先取決于高效轉(zhuǎn)化體系的建立，目前廣泛采用的轉(zhuǎn)化方法除了經(jīng)典的PEG/原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、限制性?xún)?nèi)切酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、醋酸鋰轉(zhuǎn)化法、電擊法和基因槍法。借助于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(ATMT)在真菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化中得到了成功應(yīng)用，包括在蟲(chóng)生真菌轉(zhuǎn)化中的成功應(yīng)用[14-15]。ATMT以操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化效率高和易于得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子等優(yōu)點(diǎn)而得到了廣泛的應(yīng)用。

1.4 生物防治中應(yīng)用研究

生物防治中應(yīng)用最廣的蟲(chóng)生真菌是白僵菌、綠僵菌、蠟蚧輪枝菌、蟲(chóng)瘟霉等。白僵菌和化學(xué)殺蟲(chóng)劑共同使用，可以提高防治效果，降低化學(xué)殺蟲(chóng)劑對(duì)環(huán)境的影響[16]。我國(guó)利用白僵菌在早春和梅雨季節(jié)防治松毛蟲(chóng)防效可達(dá)90%以上。綠僵菌是蝗蟲(chóng)、蚱蜢的一種很重要的天然寄生菌。以綠僵菌為主的微生物殺蟲(chóng)劑噴灑蝗蟲(chóng)或蚱蜢，14～20d死亡率達(dá)到70%～90%，而對(duì)其它非目標(biāo)害蟲(chóng)無(wú)害[17]。我國(guó)已經(jīng)嘗試?yán)靡T劑和無(wú)紡布菌條結(jié)合防治林區(qū)害蟲(chóng)。在防治中為了提高防治效果，經(jīng)常和一些化學(xué)殺蟲(chóng)劑進(jìn)行混用，邱國(guó)森等以45g/hm2的白僵菌孢粉與225g/hm2的25%滅幼脲3號(hào)粉劑比例混合防治馬尾松毛蟲(chóng)，當(dāng)代蟲(chóng)口減退率達(dá)98%以上，并具有持續(xù)作用[18]。

1.5 育種工作研究

為了保持和獲得高產(chǎn)、高毒菌株，不僅要注意采用合適的培養(yǎng)條件，而且要用各種手段對(duì)菌種進(jìn)行改造，獲得具有優(yōu)良特性的菌株。目前蟲(chóng)生真菌的育種工作主要采用以下幾種方法獲得優(yōu)良菌株：①自然選育：菌種的自然選育方法在蟲(chóng)生真菌的育種工作中仍然經(jīng)常被采用。②誘變育種：誘變育種是采用物理的或化學(xué)的誘變因子處理微生物細(xì)胞，提高基因突變的頻率，再通過(guò)合適的篩選方法獲得所需要的優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法。③準(zhǔn)性生殖：真菌的遺傳體制基本和其他真核生物相同，但真菌也有其特殊的遺傳方式，如異核現(xiàn)象、準(zhǔn)性生殖、布勒現(xiàn)象等。④原生質(zhì)體技術(shù)：20世紀(jì)70年代以來(lái)，原生質(zhì)體技術(shù)發(fā)展很快，特別是在細(xì)胞遺傳學(xué)和雜交育種中受到極大的重視。⑤基因工程技術(shù)：利用基因工程技術(shù)，即有目的地向生產(chǎn)菌株中插入一至多個(gè)基因，是改造蟲(chóng)生真菌有效的方法[19]。

2 展望

蟲(chóng)生真菌在真菌的5個(gè)亞門(mén)中均有分布，而且隨著環(huán)境污染的加重，人類(lèi)環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，生物防治顯得尤為重要。蟲(chóng)生真菌對(duì)人類(lèi)、環(huán)境和非靶標(biāo)生物的安全性是考慮利用蟲(chóng)生真菌的一個(gè)重要原因。未來(lái)的研究還需要通過(guò)基因工程改造提高蟲(chóng)生真菌的環(huán)境穩(wěn)定性，以獲得高效、穩(wěn)定的工程菌株，從而提高真菌殺蟲(chóng)劑的市場(chǎng)份額，為綠色農(nóng)業(yè)服務(wù)。為了可以更好的為我們服務(wù)，可以從以下幾個(gè)方面深入的研究蟲(chóng)生真菌[20]：①對(duì)蟲(chóng)生真菌的資源進(jìn)一步調(diào)查；②選育抗性高毒力菌株，先用適當(dāng)?shù)膭┬?；③產(chǎn)品規(guī)范化；④加強(qiáng)昆蟲(chóng)流行病的系統(tǒng)研究；⑤加強(qiáng)蟲(chóng)生真菌基因工程技術(shù)的方面的研究。