LncRNA在宣威肺癌中的研究進(jìn)展

趙瑜綜述，段勇審校

(1、昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，云南 昆明650032；2、云南省實驗診斷研究所，云南 昆明650032；3、云南省檢驗醫(yī)學(xué)重點實驗室，云南 昆明650032)

肺癌是目前世界上公認(rèn)的死亡率和發(fā)病率較高的一類癌癥，也是癌癥相關(guān)所致死亡的首要原因。根據(jù)2017中國癌癥最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計，肺癌成為中國發(fā)病率、死亡率雙率第一位的癌癥。而肺癌中又以非小細(xì)胞肺癌 （non-small cell lung cancer，NSCLC）占比最高，非小細(xì)胞肺癌的類型主要有鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌等。盡管目前對NSCLC進(jìn)行了多方面的研究，在診斷和治療中取得了一定程度的進(jìn)展，如表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和間變性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphoma kinase，ALK）基因檢測和靶向治療，但由于NSCLC缺乏早期臨床表現(xiàn)且易發(fā)生轉(zhuǎn)移等特點，NSCLC年生存率約為11%[1]。肺癌的潛在分子機制相當(dāng)復(fù)雜，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多與肺癌相關(guān)的基因突變，但是仍然無法闡釋所有臨床病例的發(fā)病機制，因此，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)更精確的診斷及預(yù)后分子生物標(biāo)志物和治療靶點對于肺癌的研究仍然至關(guān)重要[2]。

1 宣威肺癌概述

位于中國云南省東北部的宣威地區(qū)的肺癌發(fā)病率和死亡率在中國乃至全世界都位居前列[3]。宣威地區(qū)的肺癌高發(fā)形成了區(qū)域特異性，該地具有農(nóng)村發(fā)病率高于城市，女性發(fā)病率與男性差別不明顯，女性肺癌死亡率居于全國首位[4]，患病和死亡人口年齡提前，肺癌種類多為惡性程度較高的腺癌，患者預(yù)后極差等特點。這當(dāng)中最值得關(guān)注的是該地男、女性肺癌死亡率分別是全國平均水平的4倍和8倍[5，6]。一般而言，因為男性吸煙的關(guān)系，男性肺癌死亡率通常高于女性，而在宣威地區(qū)，當(dāng)?shù)嘏跃用窕静晃鼰?，但肺癌死亡率卻與男性相差不大。由于以上種種特殊情況使得該地區(qū)成為了肺癌研究的一個特殊區(qū)域。

目前大量研究及流行病學(xué)分析認(rèn)為當(dāng)?shù)厥覂?nèi)煙煤燃燒產(chǎn)生的空氣污染可能是導(dǎo)致當(dāng)?shù)胤伟└甙l(fā)的主要原因[7，8]。云南省宣威地區(qū)目前是云南省最主要的產(chǎn)煤基地之一，當(dāng)?shù)赜袛?shù)量眾多的小煤窯。宣威煤炭以龍?zhí)舵?zhèn)和來賓鎮(zhèn)產(chǎn)煤為主，而研究發(fā)現(xiàn)宣威地區(qū)煤炭中烴、硫、微量元素和礦物組成方面與云南省富源縣等地所產(chǎn)的煤存在顯著差異，其中揮發(fā)性的有機物質(zhì)是富源煤炭的5-10倍，石英的含量超過富源煤炭2倍以上[9]。最新的環(huán)境研究表明，二氧化硅和多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）的交互作用是導(dǎo)致宣威地區(qū)肺癌高發(fā)的直接原因[10]。在80年代以前，宣威當(dāng)?shù)剞r(nóng)村多采用“火塘”燒火做飯，燃燒煤炭所產(chǎn)生的煙塵無法及時完整地排出室內(nèi)，造成較為嚴(yán)重的室內(nèi)空氣污染。宣威某些地區(qū)農(nóng)村女性肺癌發(fā)病率和死亡率高達(dá)400/10萬，她們雖未從事煤礦開采、煉焦，但每天在以燃煤為主要能源的室內(nèi)活動超過10h以上[11]，這提示長期暴露于多環(huán)芳烴類等室內(nèi)污染的居民患肺癌的風(fēng)險增加[12，13]。同時，研究還發(fā)現(xiàn)雖然居民生活同樣使用煙煤，但由于使用煤源的不同，不同地區(qū)肺癌死亡率相差數(shù)倍至數(shù)十倍之多；即使是同一地區(qū)不同家族、同家族中有血緣關(guān)系的一級親屬與配偶家系間肺癌的發(fā)病風(fēng)險差別也很大，肺癌流行具有明顯的家族聚集性，在肺癌的發(fā)生過程中基因變異可能起到了重要作用。在八十年代末期，宣威地區(qū)進(jìn)行了改爐換灶等治理措施，使得室內(nèi)多環(huán)芳烴化合物的含量明顯降低，一段時間內(nèi)宣威地區(qū)的肺癌發(fā)病率有一定的下降，但仍未徹底改變宣威肺癌的高發(fā)病率和死亡率的現(xiàn)狀[14，15]。

由于宣威肺癌的獨特性，近年來關(guān)于宣威肺癌研究更多地集中在宣威肺癌的分子機制方面。但是肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與、多階段發(fā)展的極其復(fù)雜的病理過程，并伴有大量基因的異常表達(dá)，不同的基因相互作用形成復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)過程，導(dǎo)致腫瘤的浸潤、侵襲、轉(zhuǎn)移等[16]，因此任何單一水平的研究都難以揭示肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，只有綜合、系統(tǒng)的研究才有可能闡明。宣威肺癌獨有的地域性特點，更是環(huán)境與基因互相作用結(jié)果的典型。由于宣威肺癌特殊的高發(fā)病率及高死亡率嚴(yán)重威脅宣威地區(qū)乃至其他相似地區(qū)人口的生命健康，所以研究宣威肺癌發(fā)生發(fā)展的機制以及診斷和治療至關(guān)重要。隨著近年來分子生物學(xué)研究的飛速發(fā)展，目前對宣威肺癌分子機制的研究主要集中在基因多態(tài)性、 微小 RNA（microRNA，miRNA）、DNA的甲基化與損傷修復(fù)、基因拷貝數(shù)變異（CNVs）、長鏈非編碼 RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）以及信號通路等方面。

2 腫瘤相關(guān)lncRNA的研究進(jìn)展

長鏈非編碼 RNA （Long non-coding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核苷酸的非編碼RNA[17]，在哺乳動物基因組普遍被轉(zhuǎn)錄，它是由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄而成的，因為缺乏開放讀碼框，所以lncRNA不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，lncRNA在結(jié)構(gòu)特點和序列組成方面和編碼蛋白質(zhì)RNA的3’UTRs相似，其表達(dá)具有時空特異性。lncRNA的表達(dá)受到發(fā)育調(diào)控，具有組織和細(xì)胞特異性。研究表明lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、干擾、核內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程[18]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA的表達(dá)或功能異常與人類疾病的發(fā)生密切相關(guān)，這當(dāng)中就包含了癌癥、退行性神經(jīng)疾病在內(nèi)的多種嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病，具體表現(xiàn)為lncRNA在序列和空間結(jié)構(gòu)上的異常、表達(dá)水平的異常、與結(jié)合蛋白相互作用的異常等[19]。目前發(fā)現(xiàn)近43%的疾病相關(guān)單核苷酸多態(tài)性出現(xiàn)在編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域之外，這揭示了lncRNA與疾病的密切相關(guān)性[20]。目前研究較明確與腫瘤相關(guān)的lncRNA有：MALAT-1、H19、HOTAIR、MEG3 與 ANRIL。

HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA （Hox transcript antisense RNA，HOTAIR）全長2158個堿基，首次被發(fā)現(xiàn)反式轉(zhuǎn)錄作用調(diào)控基因的表達(dá)，研究表明HOTAIR的表達(dá)水平與多種腫瘤（如乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌、喉癌等）的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)的HOTAIR能抑制抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，而下調(diào)的HOTAIR表達(dá)則降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力，近期研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR可能通過競爭性結(jié)合miR23b并間接調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞中的MAPK1的表達(dá)從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[21]。

肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1) 屬lncRNA家族重要成員，2003年在非小細(xì)胞肺癌研究中被發(fā)現(xiàn)，近年來已逐步引起學(xué)者關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)MALAT-1在肺癌中明顯上調(diào)并且能夠促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌中的細(xì)胞增殖和遷移[22]。

人母系表達(dá)基因（maternally expressed gene3，MEG3）位于人染色體14q32.3[23]，在人的腦、腎上腺、胎盤、睪丸、肝臟等組織中均有MEG3的表達(dá)，而在多種人類癌癥組織及細(xì)胞株中檢測出MEG3呈低表達(dá)，研究還報道，MEG3基因的缺失能導(dǎo)致腦膜瘤[24]、胃癌[25]、宮頸癌[26-28]的發(fā)生，因此 MEG3被認(rèn)為是腫瘤抑制因子。研究發(fā)現(xiàn)MEG3可能影響 TP53，MDM2，GDF15，RB1 等關(guān)鍵細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的活性，參與癌癥的進(jìn)展和化療敏感性[29]。

雖然肺癌診斷技術(shù)在不斷提高，但有學(xué)者指出仍有40%的NSCLC患者被診斷為局部進(jìn)展期或晚期的肺癌，這些患者通常不能進(jìn)行手術(shù)切除，預(yù)后較差[30]，因此對肺癌的快速、準(zhǔn)確的診斷顯得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在肺癌中的異常表達(dá)與肺癌的發(fā)生發(fā)展以及肺癌相關(guān)的mRNA、miRNA等有明確關(guān)系。且lncRNA具有較好穩(wěn)定性、高特異性和易獲得等優(yōu)點，這些優(yōu)點表明lncRNA有可能成為肺癌的潛在生物診斷標(biāo)記物。研究這些lncRNA在NSCLC組織、血液中的表達(dá)，有助于研發(fā)特異性診斷標(biāo)志物，提高NSCLC患者的檢出率。近年來研究對與肺癌相關(guān)的lncRNA日趨增加，目前主要集中于 HOTAIR[31，32]、HOXD-AS1[33]、XIST[34]、PVT-5[35]、PANDAR[36]等 lncRNAs 在 肺 癌 的 發(fā) 生發(fā)展中的功能與機制的研究。而目前針對宣威肺癌相關(guān)的lncRNA研究較少，但由于宣威肺癌的獨特性以及l(fā)ncRNA與肺癌發(fā)生的密切相關(guān)性，與宣威肺癌相關(guān)的lncRNA逐步成為研究熱點。

3 宣威肺癌相關(guān)lncRNA的研究

研究宣威肺癌相關(guān)的lncRNAs首先從發(fā)現(xiàn)宣威肺癌組織中與其相配對的癌旁組織中具有差異表達(dá)的lncRNAs入手。由于宣威肺癌患者組織的獲取有一定難度，因此對宣威肺癌的研究需要更深入廣泛的發(fā)掘。Li，Q[37]等通過LncRNAs芯片對5對云南宣威肺癌及癌旁組織中具有表達(dá)差異性的lncRNAs進(jìn)行了篩選和分析，發(fā)現(xiàn)了6個在宣威肺癌組織及癌旁組織中差異表達(dá)且可能具有研究意義的 lncRNAs，SGOL1-AS1、SNHG4、PVT1、FENDRR、H19以及PWRN1。其中通過實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-PCR）技術(shù)驗證了這6個lncRNAs在33對宣威肺癌及癌旁組織中的表達(dá)水平。實驗發(fā)現(xiàn)在宣威地區(qū)肺癌組織SGOL1-AS1、SNHG4、PVT1 表 達(dá) 呈 上 調(diào) ， 而FENDRR、H19以及PWRN1表達(dá)呈下調(diào)，RT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果相符。研究證明目前應(yīng)用lncRNA芯片來對宣威肺癌進(jìn)行初步分析是相對可靠的。這6個lncRNAs中 H19、FENDRR、PVT1已經(jīng)在其他癌癥中被研究發(fā)現(xiàn)，但更多的像SGOL1-AS1、SNHG4、PWRN1等lncRNAs可能屬于宣威地區(qū)肺癌所特有的致病基因，目前并未有進(jìn)一步研究，而宣威肺癌芯片檢測結(jié)果中包含了大量此類lncR鄄NAs，這提示lncRNA在宣威肺癌的研究具有較高的潛在研究價值。

對宣威肺癌相關(guān)lncRNA的進(jìn)一步研究則集中在了FENDRR上。早期研究發(fā)現(xiàn)lncRNA FENDRR在胃癌中呈低表達(dá)并且與預(yù)后不良相關(guān)，lncRNA FENDRR在胃癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用[38]。最近有研究證明lncRNA FENDRR在前列腺癌中同樣也呈低表達(dá)水平，并且可以通過結(jié)合miR-18a-5p來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，從而影響癌細(xì)胞的增殖和遷移等功能[39]。徐然[40]等通過研究證明，lncRNA FENDRR在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞中的過表達(dá)能夠顯著抑制A549細(xì)胞的增殖，并且通過流式細(xì)胞技術(shù)能夠檢測到FENDRR的過表達(dá)還能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。而陳冉[41]等通過RT-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)FENDRR在宣威肺癌細(xì)胞株XWLC-05細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于A549細(xì)胞株中表達(dá)水平，這一實驗證明了lncRNA FENDRR在宣威肺癌可能存在更低的表達(dá)，甚至可能與宣威肺癌的高度惡性和預(yù)后不良具有相關(guān)性。進(jìn)而通過在構(gòu)建慢病毒載體在XWLC-05細(xì)胞中過表達(dá)FENDRR，構(gòu)建了lncR鄄NA FENDRR的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，運用MTS法、Tran鄄swell結(jié)合Matrigel膠法進(jìn)行體外細(xì)胞功能研究，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA FENDRR在宣威肺癌中具有明顯抑癌活性，并且可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)的基因表達(dá)從而抑制細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移等細(xì)胞功能。研究還發(fā)現(xiàn)lncRNA FENDRR參與了多條信號通路的調(diào)節(jié)，經(jīng)過生物信息學(xué)分析與檢索的到了更多l(xiāng)ncRNA FENDRR相關(guān)的分子機制，而這些富集基因的信號通路和分子機制很有可能圍繞lncRNA FENDRR為宣威肺癌的診療提供更新更深入的研究。

經(jīng)過對宣威肺癌與非宣威肺癌患者的血清進(jìn)行對比檢測，發(fā)現(xiàn)在宣威肺癌患者的血清中l(wèi)ncR鄄NA FENDRR和lncRNA H19的表達(dá)水平呈下調(diào)趨勢，且H19的表達(dá)水平與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)。并且當(dāng)聯(lián)合檢測FENDRR與H19時，AUC（Area Under Curve）值明顯高于癌胚抗原（car鄄cinoembryonic antigen，CEA）的 AUC 值，這項研究更進(jìn)一步證明FENDRR與H19的診斷價值高于傳統(tǒng)標(biāo)志物，并且有可能作為宣威肺癌的潛在診斷標(biāo)志物[42]。

空氣污染一直是我國嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，據(jù)報道近年來與空氣污染密切相關(guān)的肺腺癌比例迅速增至60%以上，超過已被證實的主要和煙草中有毒物質(zhì)相關(guān)的肺鱗癌。研究證實PM2.5可以承載十幾種致癌物質(zhì)，其中苯并芘（Benzopyrene，BaP）等多環(huán)芳烴與肺癌的患病率呈明顯相關(guān)性。而早期關(guān)于宣威肺癌的研究證明[43-45]，宣威地區(qū)燃燒煙煤所導(dǎo)致的室內(nèi)和室外空氣污染可能是宣威肺癌發(fā)病的特殊性的原因之一。Ming-Ming Wei等[46]通過篩選來自宣威肺癌患者腫瘤組織中異常表達(dá)的lncRNAs，發(fā)現(xiàn)宣威地區(qū)患者異常表達(dá)的lncRNAs中l(wèi)ncRNA CAR10的表達(dá)上調(diào)遠(yuǎn)高于對照（非煙煤燃燒地區(qū)的肺癌患者）組，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)lncRNA CAR10的表達(dá)與宣威地區(qū)的空氣污染是相關(guān)的，CAR10通過與YB-1直接結(jié)合并且抑制蛋白酶體對YB-1的降解來上調(diào)YB-1的表達(dá)，從而引起EGFR/pEGFR，pAKT和pERK的上調(diào)來促使肺癌細(xì)胞體內(nèi)外的增殖。研究結(jié)果表明lncRNA在環(huán)境污染相關(guān)肺癌的發(fā)生具有很重要的作用。

4 結(jié)語

隨著現(xiàn)代臨床治療手段的不斷進(jìn)步和發(fā)展，個體化醫(yī)療以及靶向治療成為了針對癌癥更為有效的治療方法，而今分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展更是為癌癥的發(fā)生發(fā)展提供了更多研究方向。宣威肺癌以獨特的流行病學(xué)特征以及嚴(yán)重的空氣污染，為肺癌病因?qū)W和分子機制的研究提供了契機。如今越來越多的lncRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，lncRNA的在疾病中所發(fā)揮的功能也越來越多地被發(fā)掘出來，并且lncRNA具有特異性、穩(wěn)定性以及易獲得性等優(yōu)點，使其可能成為診斷肺癌的分子生物學(xué)標(biāo)記物，針對lncRNA的靶向診治措施也為宣威肺癌的研究提供了新的思路。但是，因為有關(guān)lncR鄄NA的靶向治療研究尚在起始階段，lncRNA的功能與其所涉及的機制都尚未完全清楚，所以需要對lncRNA進(jìn)行更深入的研究和探索以發(fā)現(xiàn)更有效的靶點。