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    彗星實驗技術及其應用

    2018-03-16 06:43:18李崗吳聲敢蔡磊明
    生態(tài)毒理學報 2018年6期
    關鍵詞:彗星細胞實驗

    李崗,吳聲敢,2,3,4,蔡磊明,2,3,4,*

    1. 浙江省農業(yè)科學院 農產品質量標準研究所,杭州 310021 2. 浙江省農業(yè)科學院 農業(yè)部農藥檢測重點實驗室,杭州 310021 3. 浙江省農業(yè)科學院 浙江省農藥殘留檢測與控制研究重點實驗室,杭州 310021 4. 浙江省農業(yè)科學院 浙江省植物有害生物防控省部共建國家重點實驗室培育基地,杭州 310021

    1 發(fā)明與發(fā)展(Devised and developing comet assay)

    彗星實驗(comet assay)也叫單細胞凝膠電泳實驗(single cell gel electrophoresis, SCGE),是瑞典科學家O. Ostling和K.J. Johanson于1984年發(fā)明,刊登在期刊《生物化學與生物物理研究通訊》上,當初叫“微電泳技術(microelectrophoresis)”。實驗中,把鼠淋巴細胞L5178Y-S和中國倉鼠的成纖維細胞C1-1懸浮,進行物理輻照后,包埋在瓊脂糖膠中,在中性緩沖液中裂解細胞,接著在5 V·cm-1電場中電泳5 min,再用吖啶橙染色,最后用熒光顯微鏡鏡檢。發(fā)現(xiàn)DNA向陽極遷移,輻照后的細胞更明顯,還發(fā)現(xiàn)受輻照細胞能在1 h內修復超過50%的損傷[1]。

    1988年彗星實驗迎來第一次重大改進。Singh進一步發(fā)明了低水平損傷DNA的定量檢測技術,把人白細胞暴露于X射線和H2O2后,瓊脂糖膠包埋,接著裂解和電泳都改為堿性條件下進行,因為中性細胞裂解液和中性電泳液不能檢測單鏈斷裂類型的DNA損傷。改進后發(fā)現(xiàn),H2O2處理的DNA遷移模式比X射線的要整齊和同質(homogeneous)。不同類型的細胞對DNA損傷的修復能力有很大差異。Singh改進后的彗星實驗技術適用檢測單個細胞DNA損傷和修復,所需細胞少,1 000個就足夠,細胞不需要放射性標記,因此,此法適用于任何有核細胞。還能檢測同一種群的細胞對DNA損傷物的不同反應[2],此后,1990改名為彗星實驗[3]。

    1993年彗星實驗又一次改進。1993年以前,彗星實驗只能檢測DNA是否有斷裂損傷,不能分辨非斷裂損傷,不能確定DNA損傷類型。改進后的彗星實驗,可以確定氧化型非斷裂損傷。即解旋后用核酸內切酶Ⅲ(thymine glycol DNA glycosylase-Endo III, endonuclease III)處理DNA,可識別氧化損傷的嘧啶[4-6]。同樣,用甲酰氨嘧啶DNA糖基化酶fpg (formamidopyrimidine DNA glycosylase, fpg)處理后,可識別氧化損傷的嘌呤[7],如8-氧鳥嘌呤,這些酶可造成氧化損傷部位的DNA斷裂,增加慧尾的含量。因此,可用酶切慧星實驗檢測非斷裂型DNA氧化損傷,如用Ro19-8022和可見光(主要產生8-氧鳥嘌呤)暴露肺癌細胞系A549,在細胞裂解后,用fpg處理類核體30 min或45 min,可顯著增加慧尾的濃度[8-9]。fpg修飾的彗星實驗檢測大鼠的不同組織細胞暴露于甲基磺酸甲酯(methyl methanesulfonate, MMS)后,產生高水平的氧化的或烷基化的堿基或fpg傷口[10]??寡趸瘎ρ趸瘬p傷DNA的影響實驗表明,非吸煙健康人連續(xù)12周暴露在不同的類胡蘿卜素單體下,其淋巴細胞的內源性氧化損傷并沒有受到顯著影響,未見高水平的DNA斷裂損傷[11],混合維生素C、維生素E和?胡蘿卜素干預非吸煙人和吸煙人,可顯著降低二者淋巴細胞的內源性DNA氧化損傷[12],而吸煙人的高水平的氧化堿基在20 d后消失了,發(fā)現(xiàn)抗氧化劑的種類和劑型對氧化損傷的DNA修復有潛在的影響,如維生素C的緩釋劑型和快釋劑型對DNA損傷修復的效果不同,男性吸煙者只攝入緩釋型維生素C可以顯著減少fpg或核酸內切酶Ⅲ識別的損傷位點[13]。改進后的酶切彗星實驗還能提供基因的遺傳多態(tài)性相關的遺傳背景與環(huán)境因子信息,如著色性干皮病(xeroderma pigmentosum group D, XPD)基因的編碼區(qū)312-751,純合野生型基因型的彗尾密度比癌癥病人低2倍,暗示維持正常的DNA修復活性能抑制癌癥的發(fā)生和發(fā)展[14]。

    彗星實驗常和微核實驗同時進行,從不同角度探索毒物的損傷效應。彗星實驗主要測定原始的DNA斷裂損傷,而微核實驗測定的是DNA不可修復的損傷,這些損傷是非修復的或不正確修復的損傷。2種實驗的結果常呈正相關。例如,非洲爪蟾幼蛙暴露在甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate, EMS)后造成其紅細胞DNA損傷和微核率增加[15]。彗星實驗還和其他指標如活性氧(ROS)結合,探索毒性機制,如乙草胺通過誘導ROS造成花背蟾蜍(Strauchbuforaddei)的DNA損傷,同時發(fā)現(xiàn)N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine, NAC)和褪黑素(melatonin, MEL)可減輕乙草胺造成的DNA損傷[16]。

    自從Singh提出堿性彗星實驗后,在遺傳毒性檢測中得到快速發(fā)展。1999年,歐洲國家成立了一個彗星實驗專家組,一致推薦Singh的堿性彗星實驗作為檢測化學品遺傳毒性的標準方法,該法經優(yōu)化后,可用于檢測單鏈斷裂的DNA損傷、堿性不穩(wěn)定位點、DNA-DNA或DNA-蛋白質交聯(lián)損傷和單鏈斷裂的不完全切除修復位點。其特點是:可檢測低水平的DNA損傷,只需少量細胞,靈活經濟,簡便快速,例如檢測DNA損傷的修復能力。DNA損傷的修復類型有(1)切除修復。包括切除堿基缺失位點、8氧鳥嘌呤、單鏈斷裂缺口、大體積的加合物和環(huán)丁烷嘧啶二聚體等,切除修復路徑主要受翻譯后修飾調控[17]。(2)重組修復。修復的是雙鏈斷裂的缺口和鏈間交聯(lián)。(3)錯配修復。修復的是堿基的錯配、插入或缺失[18-19]。細胞應對DNA損傷,通過激活復雜的信號通路來決定細胞的命運,或者促進細胞死亡,或修復損傷而存活[20]。盡管細胞存在這些修復機制,但是DNA的損傷依然保持在較高的水平,至少在健康的人體中是這種情況。DNA的修復能力可看作是突變或癌癥的有價值的標志物,因為差的修復能力與高風險的癌癥相關,例如,頭頸鱗狀癌細胞的DNA修復能力就很差[21]。DNA的修復潛能經常用DNA芯片或RT-PCR方法,測定修復通路基因的轉錄水平,但是它的酶活性不僅依賴轉錄或翻譯水平,還要依賴表型分析的結果[22]。檢測修復過程動態(tài)的最簡單的方法是進行彗星實驗,暴露于DNA損傷物后,在不同的時間點取樣測定,進行挑戰(zhàn)實驗(challenge assay)。例如,用水溶性的?胡蘿卜素或番茄紅素培養(yǎng)的淋巴細胞,暴露在博來霉素(bleomycin)或H2O2下,結果表明?胡蘿卜素能保護DNA鏈,防止其斷裂,但是不能阻止其堿基的氧化損傷[23]。而?隱黃素(β-cryptoxanthin)能保護HeLa細胞和Caco-2細胞免受H2O2誘導的DNA損傷,呈現(xiàn)明顯的DNA修復效應。因此,標準的彗星實驗可用來測定細胞對DNA損傷的修復能力。

    2000年,歐洲食品安全局主張采用系列實驗來評估化學品的遺傳毒性,即首先對化學品進行細菌回復突變實驗(后采用OECD TG471準則[24])和體外微核實驗(后采用OECD 487[25]),只要有一個實驗結果呈陽性,再進行3個體內實驗,包括哺乳動物紅細胞微核實驗(即OECD TG474準則[26])、彗星實驗(即OECD TG489準則[27])和轉基因嚙齒動物細胞基因突變實驗(即OECD TG488準則[28])。

    2014年,經濟合作與發(fā)展組織(OECD)專門發(fā)布哺乳動物體內彗星實驗準則即OECD TG489[27],內容包括實驗原理、局限性、對照信息、方法的詳細描述和彗星圖象定量打分(推薦采用的自動和半自動軟件)。其中重要的是對細胞彗星圖象進行定義,分成3類,可打分的(scorable),非打分的(non-scorable)和刺猬形(hedgehog)??纱蚍值腻缧羌毎x為慧核和慧尾清晰且不與其他細胞重疊的細胞。彗星評價采用慧尾DNA的百分數(shù)或慧尾強度(tail intensity, TI),表示DNA的斷裂量,再結合校正曲線和已知條件即每個Gy可誘導每109Dalton DNA中0.3個斷裂,可計算實際DNA的斷裂頻率,校正曲線是gamma射線或X-ray的劑量(0~10 Gy)為自變量與慧尾DNA的百分數(shù)為因變量之間建立的線性關系[29-30]。刺猬形細胞DNA也叫鬼魂細胞(ghost cell)或云狀細胞,認為它是一種嚴重損傷的細胞(慧核小或不存在,大的彌散狀尾巴)。通過圖像分析得到的TI不可靠,對刺猬細胞應該單獨評價,它的形成機制還不清楚。大鼠肝細胞彗星實驗表明,它可能是破碎細胞時的機械損傷或試劑誘導的細胞毒性[31]。刺猬形彗星也不能認為是凋亡細胞或細胞毒性。這樣的慧星常表示連續(xù)的DNA損傷,應該對其進行全面評估[32]。

    2 技術要點(Methodical critical steps)

    彗星實驗經過不斷改進,其共同基本步驟包括制備懸浮細胞、凝膠包埋、細胞裂解、解旋、電泳、中和、染色和圖象分析。體外彗星實驗,先獲得懸浮細胞后暴露處理。體內彗星實驗,制備懸浮細胞前實驗個體進行暴露處理。其中實驗成敗的關鍵步驟應包括:

    2.1 制備懸浮細胞

    獲得懸浮細胞因物種而異。人、鼠、魚等常從其循環(huán)系統(tǒng)中獲取細胞,如血細胞或淋巴細胞。

    蚯蚓的小細胞常用于彗星實驗,小細胞來自蚯蚓的體腔液,是體腔液中含量最豐富的細胞,類似于脊椎動物的白細胞。蚯蚓體腔細胞的收集方法,包括提取液法、穿刺法、電擊法和超聲波法等[27,33]。其中提取液法最常用,其包含:5 mmol·L-1Na2-EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)、50.4 mmol·L-1或10 mg·mL-1愈創(chuàng)木酚甘油醚、95%生理鹽水(即0.85 g NaCl溶于每100 mL H2O)或磷酸鹽緩沖液(PBS)和5%乙醇或甲醇,pH 7.3~7.5。其中EDTA或EGTA和生理鹽水或PBS的作用是維持活細胞正?;钚?。愈創(chuàng)木酚甘油醚的作用在于溶解細胞粘液,釋放細胞。乙醇或甲醇的作用刺激蚯蚓釋放體腔液。

    植物彗星實驗最大困難是獲得懸浮細胞或類核,常用根和葉進行[34-35],實驗方案因組織或物種而異[36],通常的堿性溶液提取方法不能從植物細胞中釋放完整的DNA,用機械破碎或化學處理的方法可對DNA造成新的損傷,葉片中的高濃度色素如葉綠素和代謝物對分離DNA可能造成新的損傷,所以,棄用葉片細胞而選用根尖細胞,但是高頻率分裂的細胞對實驗又產生影響。盡管植物細胞彗星實驗比較困難,但是也有成功的例子,例如Cr(VI)對豌豆(Pisumsativum)DNA損傷實驗[37],Cd-Zn對煙草的影響[38]。

    目前認為懸浮細胞中的活細胞應不少于70%~75%,才能得到可靠的結果[39],通常用苔盼藍染色法檢測活細胞百分數(shù)。

    2.2 凝膠包埋

    常用低熔點瓊脂糖凝膠包埋細胞,在三層膠法中,還用正常熔點凝膠固定低熔點膠,防止在后繼的浸泡步驟中膠從載膠板上脫落。所以,低熔點膠的濃度至關重要。不同人外周淋巴細胞和淋巴母細胞系TK-6的結果表明,膠濃度在0.6%~0.8%比較合適,太低,膠不穩(wěn)定,太高,損害慧尾。膠濃度與慧尾長度呈明顯的線性關系。損傷細胞對膠濃度更敏感。膠不能反復熔化,應該分裝保存[40]。OECD建議低熔點瓊脂糖凝膠為0.5%~1%,不建議低于0.45%(OECD 489)[27]。

    2.3 細胞裂解

    對包埋在低熔點膠中的完整細胞進行裂解,常用細胞裂解液的通用配方是:10 mmol·L-1Tris-HCl,100 mmol·L-1Na2EDTA,2.5 mol·L-1NaCl,10% 二甲基亞砜(DMSO),1% Triton X-100,pH 10,裂解條件是4 ℃、至少60 min。其中Tris-HCl是緩沖體系,維持穩(wěn)定的pH值。Na2EDTA是變性劑和穩(wěn)定劑。DMSO是DNA保護劑,防止自由基對DNA的損傷。Triton X-100是表面活性劑,破壞細胞,類似的有SDS(十二烷基硫酸鈉,一種強變性劑和蛋白溶解劑)和肌氨酸鈉(sodium carcosinate),也有在裂解液中加入蛋白酶K和氯化鈣,如提高對口哨蛙(Eleutherodactylusjohnstonei)細胞的裂解能力[41-42]。

    表1 OECD 489推薦的彗星實驗陽性對照及其靶組織Table 1 Positive control substances and its target tissues in comet assay recommended by OECD 489

    注: OECD 489為經濟合作與發(fā)展組織在2014年9月26日發(fā)布的化學品試驗導則:哺乳動物體內堿性彗星試驗。

    Note: OECD 489 has been published by OECD on 26th September 2014. It is a guideline for the testing of chemicals:invivomammalian alkaline comet assay.

    2.4 堿性解旋

    解旋液和電泳液是同一種溶液,OECD 489建議配方和條件是:1 mmol·L-1Na2EDTA,300 mmol·L-1NaOH,pH≥13,4 ℃至少解旋20 min,電泳條件是4 ℃,0.7 V·cm-1,20~40 min。DNA遷移與電泳時間呈線性相關。對人外周淋巴細胞和淋巴母細胞系TK-6,以電壓1.15 V·cm-1,電泳20 min為佳,低于0.49 V·cm-1,慧尾不能展開,大于1.48 V·cm-1,慧尾從慧核上斷離,人為增加損傷程度[40],需要記住的常識是,同樣的電泳遷移距離時,單位電壓與時間的乘積是個常數(shù)。

    2.5 細胞密度

    彗星的數(shù)量或密度影響圖像分析與評價,因此細胞或彗星不能重疊,以免影響彗星計分。為便于統(tǒng)計分析,需要對至少50個細胞進行圖象分析。而有效實驗能給出定性判斷的最少細胞數(shù)為30個。

    2.6 陽性對照

    彗星實驗必須設置陰性對照和陽性對照,保證實驗設計的合理性,實驗結果的可靠性和有效性。OECD 489推薦的哺乳動物常用陽性對照,包括甲基磺酸乙酯(EMS)等,見表1。

    這些陽性對照,可能也適用于非哺乳動物,如海鱒(Salmotrutta)和北極嘉魚(Salvelinusalpinus)的精細胞暴露在甲基磺酸甲酯(MMS)中,可造成DNA損傷,并且后代的骨胳發(fā)育異常,表明這種損傷具有遺傳性[43]。三刺魚(Gasterosteusaculeatus)精子在體外受精前,體外暴露在MMS中,可造成后代的胚胎發(fā)育異常[44]。另外,4-硝基喹啉N-氧化物(4-Nitroquinoline N-oxide)是模式遺傳效應毒物,會造成斑馬魚DNA損傷和產卵量下降[45-46]。

    成功的彗星實驗要考慮3個方面因素,一是細胞的類型如淋巴細胞、生殖細胞或細菌細胞、二是誘導物類型如X射線、伽馬射線、乙醇、乙醛、疾病、生活類型因素。三是方法學因素如電泳槽、載膠板、分析參數(shù)等。

    3 典型應用(Main application field)

    用“comet assay”作關鍵詞在2016年的PubMed和Web of Science中搜索,可得近萬篇期刊文章。涉及的主要應用領域包括:毒理學30%,遺傳學15%,環(huán)境生態(tài)科學11%和應用微生物技術9%。彗星實驗還有專門的交流網(wǎng)站http://www.cometassay.com/。

    3.1 兩棲動物彗星實驗

    綠蛙(Lithobatesclamitans)和非洲爪蟾(Xenopuslaevis)等的成體或幼體的紅細胞常用于體內彗星實驗,見表2。

    測定的毒物效應包括,除草劑[42]、殺蟲劑[47]、MMS[15]、EMS[15]、苯并芘[15]、硫化染料[48]、金屬[49]、石油化工產物[50]、持久性有機污染物(persistent organic pollutants, POPs)[51]、抗生素[41]、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)[41]、污染的湖水[52]、煤礦[53]、垃圾場[54]、污泥[55]、污水[56-57]、城市固體廢物的焚燒物[58]和電磁場的影響[59]等。

    兩棲動物彗星實驗方案,差別較大。1997年之后的實驗,細胞裂解液中才開始含有洗滌劑(表面活性劑)如Triton X-100、DMSO、SDS、肌氨酸鈉、蛋白酶K和氯化鈣等,來提高對細胞的裂解能力。細胞裂解時間25 min至7 d。細胞裂解溫度是4 ℃,而2005年之前是室溫。低熔點瓊脂糖濃度通常為0.5%,范圍通常是0.4%~1.0%,濃度越高,慧尾越少[60]。解旋變性通常是pH>13條件下5~40 min,時間越長,慧尾越多[60]。電泳電壓是18~27 V,電流是300 mA,也有用V·cm-1表示的。這些實驗方案的差異,限制了實驗結果的可比性。

    3.2 魚類彗星實驗

    最早的魚類彗星實驗是用加拿大五大湖的棕鲴魚(brown bullhead,Ameiurusnebulosus)和普通鯉魚(common carp,Cyprinuscarpio)對湖中沉積物的暴露實驗,提取它們的紅細胞進行singh于1988年提出的堿性彗星實驗[61]。魚的血細胞是最常用的彗星實驗材料,因為易得,易分離,而且所有魚的血液細胞都是有核細胞。而其他組織細胞如肝、腎、腮[62-64]、精細胞[65]也經常用于彗星實驗[65]。魚的酶切彗星實驗首次運用是在2003年[66],涉及的細胞有:血細胞、肝細胞、腮細胞[67]和細胞系[68]等。

    截止2017年,已經有90多種魚用于彗星實驗,實驗類型有體內實驗(invivo)[69]、體外實驗(invitro)[68]、離體實驗(exvivo)[44]和原位實驗(insite)[70]。涉及的毒物包括POPs[71]、金屬[64]、農藥[72]、藥物[73]、內分泌干擾物如四溴雙酚-A[74]、納米顆粒[75]、生物毒素[76]、核輻射[77]和紫外線[78]等。

    魚類像兩棲類一樣,也沒有標準的彗星實驗方案,見表3。但是,魚的室內實驗和野生魚的生物監(jiān)測實驗中,要求使用標準的采樣方案[79]。

    表3 常見魚類彗星實驗條件Table 3 Summary of comet assay parameters on fish

    注:nm表示原文未提到。

    Note: nm stands for not mentioned.

    注:CeO2-NP表示CeO2納米顆粒。

    Note: CeO2-NP stands for CeO2Nano particles; DNAse stands for deoxyribonuclease; BCPAP stands for a papillary thyroid cancer-derived cell line.

    3.3 蚯蚓彗星實驗

    蚯蚓的小細胞常用于彗星實驗,小細胞來自蚯蚓的體腔液,是體腔液中含量最豐富的細胞,類似于脊椎動物的白細胞。蚯蚓體腔細胞的收集方法,包括提取液法、穿刺法、電擊法和超聲波法等[33]。

    有多種蚯蚓用于彗星實驗,如Eiseniafetida[80]、Amynthasdiffringens[81]、Aporrectodeacaliginosa[82]、Dendrodrilusrubidus[81]、Lumbricusterrestris[83]和Microchaetusbenhami[81]等,其中E.fetida是最常用的品種,為OECD和美國環(huán)境保護局(EPA)推薦,E.fetida和A.caliginosa對污染物有相同的敏感性[82],而D.rubidus對重金屬Cd最敏感,其次是E.fetida[81],例見表4。

    3.4 哺乳動物精細胞彗星實驗

    哺乳動物的彗星實驗,人和鼠最常見,涉及的細胞主要是血細胞和淋巴細胞,其他還有心、肝、肺、腎、腦、骨髓等細胞,例見表5和表6。

    常用改進的彗星實驗檢測精子的DNA損傷與不孕的關系[84],叫做二維垂直慧尾彗星實驗TT-comet (two-dimensional perpendicular tail comet assay, TT-comet),適合區(qū)分單鏈斷裂和雙鏈斷裂的精細胞[85]。精細胞和體細胞對相同毒物的反應差別很大,因為體細胞的異染色質是組蛋白而精細胞的則是精蛋白[86]。因此,去除對照的DNA結合蛋白的裂解條件具有物種的特異性,不同物種的精細胞DNA的結構不同,因而,不同物種的TT-comet條件各不相同,需要摸索。一般,去除蛋白的精細胞DNA先進行中性電泳,產生雙鏈斷裂的慧尾,然后轉膠90度,進行堿性電泳,產生單鏈斷裂的或堿不穩(wěn)定的慧尾。

    4 存在的問題與注意點(Questions and defects)

    (1)大部分已經發(fā)表的文獻,彗星實驗設計缺少陽性對照,降低了實驗的正確性和合理性。可參考OECD 489推薦的彗星實驗陽性對照(見表1)。另外,文獻中提供的彗星實驗圖片較少,只有統(tǒng)計圖表,這樣說服力不強,降低了文章的可靠性,在引用時需要注意。還需要了解的是,2016年以前的彗星實驗,以低通量為主,一次實驗的處理數(shù)和重復數(shù)設置都不是太多。

    (2)彗星實驗方案不統(tǒng)一,每種生物基本沒有標準的實驗方案,限制了結果的可比性。不同物種,不同細胞類型使用同一種實驗,可能導致實驗失敗,例如,在蚯蚓體腔細胞的彗星實驗中,細胞裂解液中的Triton-100濃度采用通常值1%,就不合適(未發(fā)表),很難得到完美的實驗圖象。

    (3)DNA鏈的斷裂損傷類型因組織和細胞類型而異[87]。因此,不能用血細胞DNA損傷類型和程度來推斷其他細胞DNA的損傷。如,用彗星實驗比較細鱗鯻(Theraponjarbua)的腮細胞、腎細胞和血細胞對氯化汞損傷的敏感性,結果表明腮細胞最敏感、腎細胞次之、血細胞最不敏感[88]。同樣,不能用不同類型的細胞進行修復能力的相互推斷[60],如劍尾魚(Xiphophorusspecies)腦部細胞對核苷酸切除修復能力大于腮部和肝部細胞[89]。

    (4)注意細胞周期對彗星實驗結果的影響。細胞處于不同周期如S期或M期,進行彗星實驗,都能進行損傷測定[90-91],在堿性條件下S期的DNA遷移速度比中性條件下快,因為在堿性條件下S期的DNA呈復制叉狀,類似單鏈斷裂DNA,而在中性條件下呈復制泡狀[92]。

    (5)運用彗星實驗結果評價毒物的DNA毒性時,還必須考慮非毒物相關因子,包括生物的和非生物因子對彗星實驗的影響。例如,水中缺氧或氧過飽和時,都能增加鯉魚(Cyprinuscarpio)的DNA損傷,幅度約為正常氧濃度的20%[93]。激流中生活的白鮭(Leuciscuscephalus)DNA損傷會增加,暗示生活在污染激流中的魚面臨更為嚴重的DNA損傷風險[67]。實驗生物的年齡、性別等對彗星實驗結果也有影響,如成年法國比目魚(Limandalimanda)面對同樣的毒物,雄性DNA損傷比雌性高,幼魚則相反,成年魚比幼魚高[94]。此外,需要評估組織取樣時使用的麻醉劑對DNA可能造成損傷。但是,苯唑卡因(benzocaine)對羅非魚(Niletilapia)的彗星實驗結果無影響[95]。

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