Vav1蛋白在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義*

張明明，賈曉梅，高偉

（河北省人民醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科，2.門診辦公室，河北 石家莊 050051）

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，易于復(fù)發(fā)，預(yù)后較差[1-2]。研究表明，Vav1蛋白與惡性腫瘤關(guān)系密切，具有促進(jìn)腫瘤生長、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的作用[3-4]。但Vav1蛋白在胃癌組織及外周血中表達(dá)及意義的報(bào)道少見。本研究選取胃癌患者、胃癌復(fù)發(fā)患者及健康體檢者，檢測腫瘤組織及外周血中Vav1水平，分析兩者的相關(guān)性，探討其臨床意義，為胃癌和復(fù)發(fā)患者的病情分析、復(fù)發(fā)預(yù)測提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年10月-2015年12月在河北省人民醫(yī)院行胃癌根治術(shù)的患者200例作為手術(shù)組。其中，男性114例，女性86例；年齡29～72歲，平均（58.7±12.3）歲，均由術(shù)前活檢和術(shù)后病理確診。手術(shù)組患者中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性38例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性162例。同期就診的術(shù)后復(fù)發(fā)患者62例作為復(fù)發(fā)組。復(fù)發(fā)組患者經(jīng)病理證實(shí)，胃鏡結(jié)合CT檢查確診為復(fù)發(fā)。選取年齡、性別相匹配的健康體檢者100例作為對照組。所有患者自愿簽署知情同意書，并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器

人Vav1癌基因酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）定量分析試劑盒（美國RD公司，批號：015828），Vav1一抗（美國Sigma公司），酶免之星全自動(dòng)酶標(biāo)儀（瑞士Hamilton公司），免疫組織化學(xué)法試劑盒（武漢博士德生物公司）。

1.3 標(biāo)本采集

所有患者晨起空腹抽取靜脈血5 ml，室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心15 min，分離血清。手術(shù)組患者在術(shù)前1 d、術(shù)后2周各采血1次。復(fù)發(fā)組和對照組均采血1次。腫瘤組織石蠟標(biāo)本來源于術(shù)中切除標(biāo)本，腫瘤離體后置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋。連續(xù)切片后行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色、免疫組織化學(xué)SP法檢測；于本院病理科取正常胃黏膜石蠟標(biāo)本30例作為組織檢測的對照，其標(biāo)本來自胃鏡活檢組織，無癌及不典型增生組織。

1.4 ELISA

采用雙抗夾心法，嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測血清Vav1的表達(dá)水平。板內(nèi)變異系數(shù)＜5%，板間變異系數(shù)＜7%，在450 nm處測量Vav1的表達(dá)。

1.5 免疫組織化學(xué)法

嚴(yán)格按免疫組織化學(xué)法試劑盒說明書進(jìn)行操作，逐步進(jìn)行顯色、復(fù)染及封片，染色后進(jìn)行結(jié)果判斷。染色結(jié)果由2位病理醫(yī)師進(jìn)行閱片。在400倍視野下，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，參考文獻(xiàn)[5]采用二次計(jì)分法計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。細(xì)胞膜或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃或棕黃色顆粒為染色陽性。細(xì)胞表達(dá)陽性的計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞＜10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度的計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，黃褐色為3分。兩者相乘≤2分為陰性，＞2分為陽性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析或t檢驗(yàn)，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，用χ2檢驗(yàn)，兩兩比較用校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)法（檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.0125）；相關(guān)分析用Spearman法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者外周血中Vav1水平比較

手術(shù)組患者手術(shù)前后外周血Vav1水平分別為（196.57±16.82）和（10.21±1.17）ng/ml，對照組為（10.42±1.09）ng/ml，復(fù)發(fā)組為（227.45±20.67）ng/ml。手術(shù)組術(shù)前、復(fù)發(fā)組、對照組外周血Vav1水平比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6754.831，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，復(fù)發(fā)組外周血Vav1水平高于手術(shù)組患者術(shù)前（t=11.936，P=0.000），手術(shù)組患者術(shù)前外周血Vav1水平高于對照組（t=110.464，P=0.000）。手術(shù)組患者手術(shù)前后外周血Vav1水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.4745，P=0.000），手術(shù)組術(shù)前高于術(shù)后。手術(shù)組患者術(shù)后外周血Vav1水平與對照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.499，P=0.135）。對手術(shù)組患者術(shù)前外周血Vav1水平進(jìn)行分析，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者的外周血Vav1水平為（195.09±15.07）ng/ml，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者為（199.38±15.97）ng/ml，經(jīng) t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.140，P=0.256）。

2.2 胃癌腫瘤組織與正常黏膜組織Vav1的表達(dá)

手術(shù)組胃癌組織Vav1陽性表達(dá)率為82.5%（165/200），正常胃黏膜組織為13.3%（4/30）；復(fù)發(fā)組胃癌組織Vav1陽性表達(dá)率為95.16%（59/62）。3組患者Vav1陽性表達(dá)率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=86.340，P=0.000）。其中，手術(shù)組胃癌組織Vav1陽性表達(dá)率與對照組比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=60.041，P=0.000），手術(shù)組高于對照組；復(fù)發(fā)組胃癌組織Vav1陽性表達(dá)率與手術(shù)組胃癌組織比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.119，P=0.013），復(fù)發(fā)組高于手術(shù)組；復(fù)發(fā)組胃癌組織Vav1陽性表達(dá)率與對照組比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=62.714，P=0.000），復(fù)發(fā)組高于對照組。見附圖。

2.3 手術(shù)組和復(fù)發(fā)組患者外周血與腫瘤組織中Vav1表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析顯示，手術(shù)組外周血與腫瘤組織中Vav1表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.345，P=0.000）。復(fù)發(fā)組外周血與腫瘤組織中Vav1表達(dá)也呈正相關(guān)（rs=0.443，P=0.000）。

附圖 3組患者Vav1蛋白的表達(dá) （SP×400）

3 討論

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率居惡性腫瘤前列，可發(fā)生于胃的各個(gè)部位，容易向胃壁及周圍組織侵犯，而且癥狀不典型，早期不易發(fā)現(xiàn)，容易誤診、誤治，失去手術(shù)機(jī)會(huì)[6-7]。及時(shí)準(zhǔn)確的判斷腫瘤狀態(tài)，盡早預(yù)測復(fù)發(fā)對指導(dǎo)臨床綜合治療有重要意義。

Vav1又稱鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子，具有鳥苷酸釋放因子活性，有助于小G蛋白上的二磷酸鳥苷和三磷酸鳥苷相互轉(zhuǎn)換，從而活化Ras和Rho等小G蛋白。Vav1主要表達(dá)于造血系統(tǒng)、造血細(xì)胞。Dbl家族中還有2個(gè)與Vav1結(jié)構(gòu)相同的蛋白——Vav2和Vav3，其在人體中的表達(dá)比較廣泛。Vav1蛋白結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，由DH、PH、CH、AC、SH2及SH3結(jié)構(gòu)域組成，各結(jié)構(gòu)域功能相輔相成，DH結(jié)構(gòu)域起催化作用，PH和AC結(jié)構(gòu)域可調(diào)節(jié)蛋白活性，CH結(jié)構(gòu)域使Vav1處于失活狀態(tài)，SH2和SH3結(jié)構(gòu)域主要介導(dǎo)Vav1與其他蛋白的相互作用。有研究顯示，Vav1蛋白在許多惡性腫瘤中表達(dá)升高，具有促進(jìn)腫瘤生長、擴(kuò)散、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的作用，其表達(dá)與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，Vav1在胃癌腫瘤組織中的表達(dá)強(qiáng)于正常胃黏膜組織，說明Vav1蛋白表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)組腫瘤組織Vav1表達(dá)也增強(qiáng)，甚至高于手術(shù)組胃癌組織，說明Vav1表達(dá)在腫瘤復(fù)發(fā)過程中進(jìn)一步增強(qiáng)，提示Vav1可能對胃癌的復(fù)發(fā)有促進(jìn)作用。但本研究也發(fā)現(xiàn)，術(shù)前有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者外周血Vav1水平無差異，提示Vav1水平可能與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，手術(shù)組患者術(shù)前外周血中Vav1水平高于對照組，根治性手術(shù)去除腫瘤后Vav1水平降低，降至與對照組Vav1水平無差異。由此可見，外周血中Vav1水平高低與腫瘤組織的存續(xù)有十分密切的關(guān)系，腫瘤組織的存在與否直接影響Vav1水平的變化。對于復(fù)發(fā)組患者，外周血中Vav1水平升高，且高于手術(shù)組術(shù)前，說明Vav1水平與腫瘤的復(fù)發(fā)關(guān)系密切，筆者認(rèn)為腫瘤的復(fù)發(fā)刺激Vav1水平升高，同時(shí)Vav1水平升高也通過某種機(jī)制刺激腫瘤的生長和復(fù)發(fā)。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，手術(shù)組和復(fù)發(fā)組患者外周血與腫瘤組織中Vav1表達(dá)呈正相關(guān)，說明外周血中Vav1水平可以反映機(jī)體腫瘤組織狀態(tài)。

綜上所述，胃癌患者腫瘤組織Vav1過表達(dá)，外周血中Vav1水平升高，且外周血與腫瘤組織中Vav1表達(dá)呈正相關(guān)。Vav1與胃癌的關(guān)系十分密切，早期動(dòng)態(tài)監(jiān)測外周血中Vav1蛋白水平，可以及時(shí)準(zhǔn)確地掌握腫瘤在患者體內(nèi)的發(fā)展、變化，對預(yù)測術(shù)后生存率和腫瘤復(fù)發(fā)提供重要的參考價(jià)值。

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