不同肥密條件對甘藍型油菜葉綠素含量及脂肪酸合成相關(guān)基因表達量影響的研究

王曉丹，胡慶一，張振乾，王 悅，官春云

(湖南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院,南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128)

葉綠素是綠色植物進行光合作用的必需物質(zhì)，其含量高低是反映綠色植物葉片光合作用能力的重要指標[1]，且葉綠素含量與作物的氮含量、種植密度等也密切相關(guān)，已有許多相關(guān)報道[2-4]。

油菜是世界第二大油料作物，也是我國最大的自產(chǎn)油料作物[5]，通過降低飽和脂肪酸含量，增加不飽和脂肪酸含量進而改變菜油脂肪酸組成是油菜育種的重要目標之一，如“雙低油菜”和高油酸油菜等[6-7]，受到眾多育種家的關(guān)注。不飽和脂肪酸是構(gòu)成葉綠體膜骨架的主要成分，是光合作用所必需的[8]，其中亞油酸與亞麻酸是人體必需脂肪酸，有較好的營養(yǎng)保健作用[9-10]。fad2編碼ω-6型不飽和脂肪酸去飽和酶，是控制油酸向亞油酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因，直接決定了種子中儲存多不飽和脂肪酸的含量與比例[11]；fad3編碼ω-3型不飽和脂肪酸去飽和酶，是亞麻酸合成的關(guān)鍵基因[12]。對這2個基因進行分析，有助于從分子方面促進油菜脂肪酸組成改良研究的發(fā)展。

本研究分析了不同肥密條件下，甘藍型油菜不同生育期的葉綠素含量及fad2、fad3基因表達情況，并探討了葉綠素含量與fad2、fad3基因表達量之間的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)不同栽培方式對葉綠素含量及基因表達的影響，為通過栽培方式改良油菜品質(zhì)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

甘藍型油菜420，國家油料改良中心湖南分中心提供。

1.2 試驗處理

試驗于2016年10月-2017年4月在湖南農(nóng)業(yè)大學瀏陽基地進行。分別設(shè)氮(N)、硼(B)及種植密度各3個梯度，具體表示方法如表1，以正常肥密條件(A2B2C2)為對照，隨機區(qū)組排列，共27個小區(qū)，每個小區(qū)面積10 m2，3個重復。所有小區(qū)施有效磷肥90 kg/hm2，有效鉀肥165 kg/hm2做基肥，一次施入。其他農(nóng)事操作均按當?shù)毓芾泶胧┎僮鳌?/p>

表1 不同字符表示的肥密條件Tab.1 Fat and density conditions represented by different characters

1.3 樣品制備

每個小區(qū)分別取幼苗期(2016年11月12日)、五-六葉期(2016年12月11日) 和蕾薹期( 2017年1月10 日) 嫩葉5片(每株1片)，盛花期(2017年2月18日) 各材料取5株自交套袋的花，授粉后 20～35 d種子及角果皮(2017年3月25日) 用以提取RNA。另取各時期倒數(shù)第3片葉5片(每株1片)，角果期取角果皮，用以葉綠素含量測定。以上材料各自混合，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 葉綠素含量測定 取上述葉綠素含量測定所需材料，通過研磨法提取葉綠素，并用721型分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)測定吸光度。

1.3.2 RNA 提取取 上述RNA 提取材料，按照TransGene Biotech 公司的TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒說明書提取總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA無明顯降解，Nanodrop 2000 微量紫外分光光度計(Thermo) 檢測 RNA濃度與純度良好，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 定量PCR Premier 6.0設(shè)計fad2和fad3引物(表2),并用Oligo 7.0進行檢測，由上海生工技術(shù)公司合成。用上述檢測合格的RNA按照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄。以劉芳等[13]所設(shè)PCR 反應程序?qū)σ镞M行檢測，使用CFX96TM Real-Time System(BIORAD，USA)，按照TransScript Tip Green qPCR SuperMix試劑盒說明書，采用兩步法進行qPCR反應。內(nèi)參基因選用UBC9，基因表達情況采用Pfaffl[14]的方法進行評價。試驗重復3次，取平均值。

基于PLC和HMI控制的旋擺沖擊磨操作系統(tǒng)的改進設(shè)計 程行知，申小剛，潘小康，田文海，韓玉香2(84)

表2 定量PCR引物及內(nèi)參基因序列Tab.2 Sequences of primer and reference gene used for quantitative real-time PCR validation of gene expression

1.4 統(tǒng)計分析

測得的數(shù)據(jù)以SPSS 20.0處理，并用 Excel 2010作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時期葉綠素含量變化

按1.3.1方法對油菜各個時期的葉綠素含量進行測定，結(jié)果如圖1。在A2B1C2、A3B1C2 與A2B1C3處理葉綠素含量整個生育期均高于對照；反之，在A1B3C1與A1B3C3的處理則遠低于對照。總體而言，整個生育期葉綠素的變化規(guī)律是相同的，即在相同N及B用量條件下，隨著種植密度的增加，葉綠素含量逐漸降低，在相同種植密度及B用量條件下，隨著N素的增加，葉綠素含量先升高后降低；相同種植密度及N肥條件下，隨著B用量的增加，葉綠素含量亦先升高后降低；隨著生育期的推進，葉綠素含量不斷增加，這與胡戎朔[6]的研究是一致的。此外，不同處理間差異隨著生育期推進越來越大，可能是油菜生長前期植株幼小，光合作用較弱，隨著植株生長，總?cè)~片數(shù)、綠葉數(shù)增多，光合指數(shù)升高而導致[15]。

圖1 不同時期不同處理下葉綠素含量差異Fig.1 Difference of chlorophyll content under different treatments in different periods

2.2 營養(yǎng)生長期fad2、fad3表達差異

2.2.1 幼苗期基因表達差異 對幼苗期葉片中fad2、fad3的表達量進行分析，結(jié)果如圖2。fad2的表達量僅在A2B1C2處理遠高于對照，是對照的1.51倍，fad3的表達量則在A2B1C2、A2B1C3及A3B1C2處理，均高于對照，分別是對照的1.65，1.54，1.36倍。

fad2的表達量在A1B3C1處理下表達量最低，僅是對照的0.13倍，其次是A1B2C1與A1B3C3，分別是對照的0.18，0.23倍。fad3的表達量同fad2類似，在3個處理下，分別是對照的 0.12，0.21，0.18倍。另外，在A1B1C1處理，fad2、fad3的表達量也僅有對照的0.31，0.35倍?？傮w而言，在幼苗期，大部分肥密條件下都抑制兩者的表達。

圖2 fad2、fad3基因在幼苗期表達差異

2.2.2 五-六葉期基因表達差異 對五-六葉期葉片中fad2、fad3的表達量進行分析，結(jié)果如圖3。fad2在A2B1C2(1.86倍)、A3B1C2(1.57倍)與A2B1C3(1.51倍)處理時高于對照；fad3則在A2B1C2、A3B1C2與A2B1C3處理高于對照，分別是對照的1.51，1.50,1.31倍。

反之，fad2在A1B3C1(0.38倍)、A1B2C1(0.39倍)、A1B1C1(0.40倍)與A1B3C3(0.40倍)處理時遠低于對照；fad3同之，分別是對照的0.15，0.19，0.23倍。此時期基因整體表達量大于幼苗期，可能是隨著生育期的推進，油菜各生命活動加強所致[16]。

圖3 fad2、fad3基因在五-六葉期表達差異

反之，fad2表達量在A1B1C1(0.46倍)、A1B2C1(0.38倍)、A1B3C1(0.35倍)、A3B3C1(0.27倍)及A1B3C3(0.23倍)處理下遠低于對照。fad3在這幾種處理下表達量也較低，分別是對照的0.57，0.45，0.42，0.42，0.47倍。此時期是由營養(yǎng)生長期進入生殖生長期的關(guān)鍵期，是油菜吸收氮等元素最多的時期(http：//www.chinabaike.com/z/nong/sc/968921.html)，而fad2、fad3基因的表達量比五-六葉期有所增加但增幅不大，此外，在整個營養(yǎng)生長期，在氮、硼含量均最低(A1C1)條件下，無論密度(B)怎么變化，基因表達量均小于對照，可推測在氮、硼含量低時，密度對基因表達量的影響并不明顯。

圖4 fad2、fad3基因在蕾薹期表達差異

2.3 生殖生長期fad2、fad3表達差異

2.3.1 花期基因表達差異 對花瓣中fad2、fad3的表達量進行分析，結(jié)果如圖5。fad2在A2B1C2處理表達量最高，是對照的1.60倍，其次是A3B1C2，是對照的1.53倍；fad3同之，分別是對照的1.63，1.57倍。

fad2表達量在A1B3C1處理下表達量最低，是對照的0.36倍，其次是在A1B2C1(0.39倍)、A3B1C1(0.45倍)與A1B3C3(0.48倍)處理下亦遠低于對照。fad3同樣在A1B3C1處理表達量最低，是對照的0.43倍，其次在A3B3C1(0.46)、A3B3C3(0.48倍)處理表達量也較低。此時期比之營養(yǎng)生長期，fad2、fad3的表達量有明顯提高，但除了上述幾個處理與對照有較大差異之外，其他處理與對照間均無明顯差異。

圖5 fad2、fad3基因在花瓣中的表達差異Fig.5 Differentially expressed of fad2 and fad3 in the petals

2.3.2 授粉后20-35 d種子基因表達差異 對授粉后20～35 d種子中fad2、fad3的表達量進行分析，結(jié)果如圖6。fad2在A2B1C2條件下有最大表達量，是對照的1.94倍，其次是在A2B1C3、 A3B1C3、A3B1C2條件下，分別是對照的1.60，1.54，1.50倍；fad3則僅在A2B1C2、A2B1C3處理遠高于對照，分別是對照的1.55，1.52倍。

反之，fad2在A1B3C1(0.35倍)、A1B2C2(0.43倍)、A1B3C3(0.44倍)條件下均低于對照，fad3在A1B3C3條件下表達量最低，是對照的0.16倍，其次是A1B3C2、A1B2C1、A1B2C3處理，表達量分別是對照的0.19，0.27，0.29倍。此時期兩基因的表達量均達整個生育期的最大值，推測與角果期是脂肪酸積累的關(guān)鍵期有關(guān)[17]。

圖6 fad2、fad3基因在授粉后20～35 d種子中的表達差異Fig.6 Differentially expressed of fad2 and fad3 in 20-35 d seeds after pollination

2.3.3 角果皮中基因表達差異 對角果皮中fad2、fad3的表達量進行分析，結(jié)果如圖7。fad2在A2B1C2處理表達量最高，是對照的1.80倍，其次是在A2B1C3處理，表達量是對照的1.50倍，fad3亦在A2B1C2處理表達量最高，是對照的1.85倍，其次在A3B1C2(1.56倍)、A2B1C3(1.51倍)處理表達量也較高。

反之，fad2表達量在A1B3C1(0.32倍)條件下表達量最低，其次是A1B3C3(0.35倍)、A1B2C3(0.42倍)、A3B3C1(0.47倍)處理均低于對照。fad3則在這幾種處理下也遠低于對照，分別是對照的0.17，0.24，0.39，0.32倍，除此之外，fad3在A1B2C1處理下表達量也較低，僅為對照的0.21倍。與20～35 d的種子相比，角果皮中fad2、fad3的表達量明顯較低，推測此時角果皮作為油分積累的“源”向種子“庫”中轉(zhuǎn)移，角果皮的油分積累與種子呈相反趨勢，從基因?qū)用骝炞C了傅壽仲等[18]的研究。

圖7 fad2、fad3基因在角果皮中的表達差異Fig.7 Differentially expressed of fad2 and fad3 in the pods

總體而言，生殖生長期的基因表達量高于營養(yǎng)生長期，特別是角果期。生殖生長期是油菜進行脂肪酸積累的關(guān)鍵期，有效的肥料、種植密度條件可以促進脂肪酸的積累，本研究在A2B1C2與 A2B1C3處理fad2、fad3基因均有較高表達量，可能有助于亞油酸與亞麻酸的合成。而在A1B3C1、A3B3C1及A1B3C3處理下fad2、fad3均有較低表達量，可能有助于其他類脂肪酸(如油酸等)的積累，推動油菜籽品質(zhì)的提高。

2.4 不同時期葉綠素含量與基因表達量之間的關(guān)系

不同時期葉綠素含量與fad2、fad3表達量之間的關(guān)系如表3。在整個生育期，葉綠素含量與fad2、fad3之間表現(xiàn)出相同的變化規(guī)律，即隨著N、B肥的增加而先增加后減少，隨著密度的增加而減少。Broun等[8]證實不飽和脂肪酸參與構(gòu)成葉綠體膜骨架葉綠素含量變化，本試驗中，通過線性擬合分析兩者間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)基因表達量與葉綠素含量擬合度較高，呈正相關(guān)關(guān)系。

表3 葉綠素含量與基因表達量之間的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between chlorophyll content and gene expression in different periods

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

通過對營養(yǎng)生長期與生殖生長期fad2、fad3基因表達量的測定，發(fā)現(xiàn)fad2、fad3在A2B1C2與 A2B1C3處理下均有較高表達量，而在A1B3C1、A3B3C1及A1B3C3處理下均有較低表達量?？傮w而言，增加氮、硼肥在一定程度上可促進葉綠素含量以及fad2、fad3表達量的增加，過多則抑制，而增加種植密度則會抑制葉綠素含量以及fad2、fad3表達量。另一方面，fad2、fad3表達量變化規(guī)律同葉綠素含量變化規(guī)律相同，呈正相關(guān)關(guān)系。

3.2 討論

施肥量及種植密度對農(nóng)作物各個方面均有較大的影響，本研究發(fā)現(xiàn)在不同肥密條件處理下，fad2、fad3的表達量有較大差異，尤其是在生殖生長期。李志玉等[19]對雙低油菜新品種中油雜8號施用氮磷硼肥表明，施用氮磷硼肥的作用主要是促進油菜后期的生長發(fā)育；楊美等[20]以甘藍型雙低油菜華雙4號為材料，通過盆栽試驗證明硼肥過高或過低對油菜品質(zhì)都有影響；曾宇等[21]證明肥密相互協(xié)調(diào)作用是獲得產(chǎn)量品質(zhì)俱佳的關(guān)鍵，且種植密度對油酸、亞油酸等的含量影響不大，本試驗則從基因?qū)用骝炞C了這一研究。

亞油酸、亞麻酸無論對作物本身還是對人體而言，都有不可或缺的作用，但含量過高會引發(fā)機體脂質(zhì)代謝紊亂，從而引起一系列病癥，如脂肪肝等[22-23]。且亞油酸極易被氧化，作為食用油時不耐高溫，易腐壞[24]，故而對油脂品質(zhì)有一定影響。本研究中，在A1B3C1、A3B3C1及A1B3C3處理下fad2、fad3均有較低表達量，可能有助于其他類脂肪酸(如油酸等)的積累，從而提高油菜籽品質(zhì)，有待進一步研究。

[1] Ptushenko V V, Ptushenko O S, Tikhonov A N. Chlorophyll fluorescence induction, chlorophyll content, and chromaticity characteristics of leaves as indicators of photosynthetic apparatus senescence in arboreous plants[J]. Biochemistry-Moscow, 2014, 79(3)： 260-272.

[2] 劉桃菊，胡雯君，張笑東.水稻冠層高光譜特征變量與葉片葉綠素含量的相關(guān)性研究[J].激光生物學報, 2015，24(5)： 428-435.

[3] 曾 宇.不同施肥量,種植密度對油菜生長及產(chǎn)量的影響[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學, 2011.

[4] 唐金花.不同氮磷鉀施用量對雙季稻田早熟油菜產(chǎn)量和養(yǎng)分吸收的影響[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學, 2013.

[5] 張永霞，趙 鋒，張紅玲.中國油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀、問題及對策分析[J].世界農(nóng)業(yè), 2015(4)： 96-99.

[6] 胡戎朔.播種期及氮磷配比對雙低油菜產(chǎn)質(zhì)量及飼用品質(zhì)的影響[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學, 2016.

[7] 李 斌，肖 楠，張振乾，等.不同栽培方式對高油酸油菜的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)科學, 2017(4)： 32-35.

[8] Broun P, Gettner S, Somerville C. Genetic engineering of Plant lipids[J]. Annu RevNutr, 1999, 19(1)：197-21.

[9] Nagano Y, Matsuno R, Sasaki Y, et al. Sequence and transcriptional analysis of the gene cluster trnQ-zPfA-psal-0RF231-petA in pea chloroplasts[J]. Current Genetics, 1991(20)： 431-436.

[10] Bergé J-P, Barnathan G. Fatty acids from lipids of marine organisms： molecular biodiversity, roles as biomarkers, biologically active compounds, and economical aspects[J]. In Marine Biotechnology I, 2005, 96： 49-125．

[11] Peng Q, Hu Y, Wei R, et al. Simultaneous silencing ofFAD2 andFAE1 genes affects both oleic acid and erucic acid contents inBrassicanapusseeds[J]. Plant Cell Reports, 2010,29(4)：317-325.

[12] 曹福亮，王歡利，郁萬文，等.高等植物脂肪酸去飽和酶及編碼基因研究進展[J].南京林業(yè)大學學報：自然科學版, 2012, 36(2)： 125-132.

[13] 劉 芳，劉睿洋，彭 燁，等.甘藍型油菜BnFAD2-C1基因全長序列的克隆,表達及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析[J].作物學報, 2015, 41(11)： 1663-1670.

[14] Pfaffl M W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J]. Nucleic Acids Research, 2001, 29(9)： e45.

[15] 韓 梅.播期,密度對直播油菜生長發(fā)育品質(zhì)的影響[D].重慶：西南大學, 2016.

[16] 王必慶，王國槐.早熟油菜生理生化特性研究進展[J].作物研究, 2011, 25(3)： 269-271.

[17] 高建芹，浦惠明，戚存扣，等.高含油量油菜種子和果皮油份積累及主要脂肪酸的動態(tài)變化[J].中國油料作物學報, 2009, 31(2)： 173-179.

[18] 傅壽仲，張潔夫，戚存扣，等.甘藍型油菜高含油量種質(zhì)選育研究[J].中國油料作物學報, 2008, 30(3)： 279-283.

[19] 李志玉，胡 瓊，廖 星，等.優(yōu)質(zhì)油菜中油雜8號施用氮磷硼肥的產(chǎn)量和品質(zhì)效應[J].中國油料作物學報, 2005, 27(4)： 59-63.

[20] 楊 美，石 磊，徐芳森，等.不同硼水平對雙低油菜華雙4號產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學報, 2008, 14(6)： 1118-1122.

[21] 曾 宇，雷雅麗，李 京，等.氮,磷,鉀用量與種植密度對油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學報, 2012, 18(1)： 146-153.

[22] 胡 燕，陳忠杰.不飽和脂肪酸與人體健康關(guān)系探討[J].肉類研究, 2011, 25(1)： 17-20.

[23] 廖靈旋，于 昊，黃建忠.多不飽和脂肪酸合成途徑研究進展[J].微生物學雜志, 2014, 34(3)： 80-85.

[24] 胥 莉.亞油酸氧化產(chǎn)物的體外活性和促炎作用[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學, 2013.