血清IL-35水平變化與再生障礙性貧血免疫抑制治療效果的關(guān)系

劉佳，謝曉寶，顧偉英，李海乾，凌云

(常州市第一人民醫(yī)院·蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院，江蘇常州21300)

再生障礙性貧血(AA)是一種免疫介導(dǎo)的血液系統(tǒng)疾病，其特征在于骨髓造血衰竭和外周血細(xì)胞減少[1]。研究表明，免疫耐受缺失和骨髓干細(xì)胞過度凋亡可能在AA發(fā)病中起重要作用[2]。目前包含抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG)和環(huán)孢菌素A(CsA)的免疫抑制治療(IST)廣泛應(yīng)用于AA。AA患者IST的反應(yīng)率為42%～74%，長期總生存率為90%[3]?；颊邔ST的反應(yīng)差異明顯，因此對IST反應(yīng)的早期評估有重要意義。目前已經(jīng)提出了幾種預(yù)測因素和指標(biāo)，如年齡、性別、診斷和治療的時間間隔、白細(xì)胞計數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對值、中性粒細(xì)胞絕對值和淋巴細(xì)胞絕對值，但仍不能滿足臨床需要[4]。白細(xì)胞介素35(IL-35)是2007年首次發(fā)現(xiàn)的一種異二聚體細(xì)胞因子，在抗炎和免疫耐受過程中起關(guān)鍵作用[5]。目前，AA患者血清IL-35水平與對IST反應(yīng)之間的關(guān)系尚未闡明。本研究對此進行了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年6月～2016年10月本院收治的AA患者34例(AA組)，男19例、女15例，年齡(25.0±3.6)歲，病因為特發(fā)性31例、肝炎相關(guān)性3例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合國際研究組AA診斷標(biāo)準(zhǔn)；符合嚴(yán)重再生障礙性貧血(SAA)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；缺乏合適的造血干細(xì)胞移植供者；既往未接受過IST。排除標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)生陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿或Fanconi貧血；患有其他血液系統(tǒng)疾病或自身免疫性疾?。换加袊?yán)重膿毒癥或惡性腫瘤；最后1次采血前接受輸血。同期選擇體檢健康者34例作為對照組，男18例、女16例，年齡(28.0±3.9)歲。兩組性別、年齡有可比性。本研究經(jīng)常州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，參與者均簽署知情同意書。

1.2 IST AA組均給予輸血、抗感染、保肝及對癥支持治療。給予抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG)和環(huán)孢素A(CsA)進行IST。用藥前行過敏試驗，給予糖皮質(zhì)激素和抗組胺類藥物防止過敏。ATG(復(fù)寧)5 mg/(kg·d)經(jīng)0.9%氯化鈉注射液500 mL稀釋后靜脈滴注12～18 h，持續(xù)治療5 d；口服CsA 6 mg/(kg·d)，持續(xù)調(diào)整劑量，維持血清藥物濃度為150～250 ng/mL。持續(xù)24周。

1.3 療效評價標(biāo)準(zhǔn) 治療24周評估患者對IST的反應(yīng)[7]，分為無反應(yīng)(NR)、部分反應(yīng)(PR)和完全反應(yīng)(CR)。PR及CR為治療有效，NR為治療無效。

1.4 血清IL-35檢測 AA組于入院時及治療第28天[8]、對照組于體檢時采集肘正中淺靜脈血5 mL，離心(3 000 r/min、20 min)，取血清于-80 ℃儲存待檢。用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA試劑盒，Biolegend)測定血清IL-35；用ELISA試劑盒(博士德生物工程有限公司)測定血清干擾素γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。

2 結(jié)果

2.1 AA組與對照組血清IL-35水平比較 對照組血清IL-35水平為(47.2±9.1)pg/mL；AA組治療前、治療第28天血清IL-35水平分別為(11.9±5.6)、(40.6±7.3)pg/mL。與對照組比較，治療前AA組血清IL-35水平低(P<0.05)；治療后AA組血清IL-35水平較治療前升高(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 AA組血清IL-35水平與療效的關(guān)系 治療24周，有效20例(PR 15例、CR 5例)，無效14例。根據(jù)治療第28天血清IL-35水平[8]將患者分為IL-35水平升高(IL-35≥28.7 pg/mL)16例、未升高(<28.7 pg/mL)18例。IL-35水平升高者治療有效7例(43.75%)，未升高者治療有效13例(81.25%)，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 AA組血清IL-35水平與IFN-γ、TNF-α水平的關(guān)系 治療前IL-35水平升高與未升高患者的血清IFN-γ、TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；與治療前比較，治療第28天AA組血清IFN-γ、TNF-α水平均降低(P均<0.05)。治療第28天IL-35水平升高者血清TNF-α較未升高者低，IFN-γ水平與未升高者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 AA組血清IL-35水平與IFN-γ、TNF-α水平的關(guān)系

3 討論

AA是一種免疫介導(dǎo)的骨髓衰竭綜合征，其確切發(fā)病機制尚不清楚，由異常免疫反應(yīng)介導(dǎo)的造血破壞被認(rèn)為是主要原因。近年來，已廣泛研究了其免疫機制的異常，特別是T細(xì)胞免疫和異常細(xì)胞因子譜[9]。除了異常極化的T輔助細(xì)胞(Th1)和分泌過多抑制性造血因子的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，循環(huán)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)數(shù)量減少、免疫抑制功能受損及Th17細(xì)胞數(shù)量增加也在AA的發(fā)病中起至關(guān)重要的作用[10,11]。

IL-35是IL-12家族的新成員，是由IL-12α亞基p35和IL-27β亞基EB病毒誘導(dǎo)的基因3組成的異二聚體細(xì)胞因子，是一種主要由Treg分泌、能阻止免疫應(yīng)答過度反應(yīng)的抑制性細(xì)胞因子。IL-35被認(rèn)為是Tregs介導(dǎo)的免疫耐受的基本效應(yīng)分子，不需要IL-10或轉(zhuǎn)化生長因子β參與轉(zhuǎn)化。更重要的是，IL-35在免疫反應(yīng)中發(fā)揮不同的作用。IL-35可抑制常規(guī)T細(xì)胞的增殖和CD4+T細(xì)胞分化為Th1或Th17效應(yīng)細(xì)胞，但促進Treg的增殖。此外，IL-35還可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞生成具有抑制性的誘導(dǎo)型Treg(iTR35細(xì)胞)。

研究表明，AA患者血清IL-35水平降低導(dǎo)致免疫耐受缺失，同時也表明血清IL-35水平與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)[12]。在炎癥性腸病、原發(fā)性免疫性血小板減少癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡中也發(fā)現(xiàn)了類似關(guān)系。然而，在系統(tǒng)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和惡性腫瘤中，IL-35的血清水平意外升高，并在治療后恢復(fù)正常[13]。因此，IL-35在這些疾病中的作用復(fù)雜。本研究中，AA組血清IL-35水平較健康對照組低，這與上述研究[12]結(jié)論一致。

Huang等[10]研究指出，在初始IST 28天，對IST有效反應(yīng)的患者血清IL-35水平升高，而后升高的趨勢變緩。因此，本研究治療第28天檢測血清IL-35水平。本研究顯示，治療第28天，患者血清IL-35水平恢復(fù)至正常水平，與治療前相比明顯升高；血清IL-35水平升高的AA患者其對IST的有效反應(yīng)率升高。由此推斷，血清IL-35水平變化與AA患者對IST的反應(yīng)密切相關(guān)，可作為判斷有效性的預(yù)測因子。原因可能為IST通過升高AA患者血清IL-35水平，抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞的過度增殖及CD4+T細(xì)胞分化為Th1或Th17效應(yīng)細(xì)胞；促進Tregs增殖，通過其介導(dǎo)的免疫耐受途徑發(fā)揮免疫抑制作用。另外，iTR35細(xì)胞作為IL-35誘導(dǎo)生成的具有抑制性的誘導(dǎo)型Treg，進一步發(fā)揮強大且穩(wěn)定的抑制作用。

AA的病理生理過程中，分泌過多抑制性造血因子，如TNF-α和IFN-γ。IL-35可抑制Th1型細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-2及Th17型細(xì)胞因子的產(chǎn)生。而且TNF-α也是一種參與調(diào)控凋亡過程的細(xì)胞因子，在AA的骨髓干細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。因此，本研究以IFN-γ、TNF-α作為常見的造血負(fù)調(diào)控因子。IST后兩種細(xì)胞因子水平均下降，說明IST對AA的機制之一為通過抑制造血負(fù)調(diào)控因子發(fā)揮作用，預(yù)示著造血功能的改善；而IL-35升高者TNF-α水平下降更明顯，說明抑制凋亡可能也是治療后血清IL-35水平與對IST反應(yīng)的橋梁，具體機制可能與凋亡相關(guān)的膜表面分子Fas及其配體FasL相關(guān)，需進行更深入的研究。

總之，本研究顯示IST后血清IL-35恢復(fù)至正常水平，可作為AA患者對IST有效反應(yīng)的預(yù)測因子。

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