長鏈非編碼RNA HOTAIR在急性髓系白血病患者外周血中的表達變化及意義

鄭轉(zhuǎn)珍，貢榮，李國霞，任方剛，徐麗娟

(1山西醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，太原030001；2山西大醫(yī)院)

急性髓系白血病(AML)是一類高度異質(zhì)性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，以骨髓和外周血中未成熟骨髓干細胞的快速積聚和惡性增殖為特征[1]。近年來，在AML的風險評估、緩解后化療和造血干細胞移植等方面，取得了巨大進步[2]。盡管大多數(shù)接受化療的AML患者能夠獲得完全緩解，其中僅約20%的完全緩解患者能夠獲得長期無復發(fā)生存[3]。因此，為提高AML的診斷、治療效率，仍需對AML的發(fā)生發(fā)展機制進行深入探討。研究表明，長鏈非編碼RNA(lncRNA)在造血干細胞分化和AML等血液惡性腫瘤中均發(fā)揮作用[4]。HOX基因的反義基因間RNA(HOTAIR)，由HOXC基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄生成，長度約2.2 kb。研究證實，lncRNA HOTAIR在多種腫瘤的惡性進展過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[5]。而關(guān)于lncRNA HOTAIR在AML患者外周血中的表達變化，以及l(fā)ncRNA HOTAIR在AML診斷、治療中的應(yīng)用價值，尚未有報道。本研究采用qRT-PCR法檢測lncRNA HOTAIR在AML中的表達變化，并分析lncRNA HOTAIR表達與AML患者臨床病理參數(shù)、預后的關(guān)系，探討lncRNA HOTAIR在AML發(fā)生發(fā)展過程中的作用，以期作為AML診斷、治療的新靶點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年6月～2015年1月于山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院初診AML的患者96例，均符合法美英合作組AML的診斷標準[6]。其中男52例、女44例，年齡19～70(46.21±12.87)歲；WHO分型[7]M1型5例、M2型30例、M4型13例、M5型34例、M6型14例。其中接受DA方案(柔紅霉素、阿糖胞苷)誘導化療86例，化療2個周期完全緩解56例。根據(jù)患者的身體狀況，完全緩解的患者，在鞏固強化階段均接受高劑量或中等劑量的以阿糖胞苷為基礎(chǔ)的化療。其余10例未接受治療，且均未獲得完全緩解。同期選擇性別與年齡相符的健康志愿者30例。入選者均簽署知情同意書；本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 樣本收集 采集AML患者與健康志愿者的晨起空腹靜脈血3～5 mL，置于EDTA抗凝管，4 ℃靜置1 h，采用Ficoll密度梯度離心法(人外周血單核細胞分離液試劑盒，北京索萊寶科技有限公司)，4 ℃、400 g 離心30 min，收集外周血中的單核細胞，洗滌后沉淀。采用磁珠分離法(免疫磁珠分選試劑盒，德國美天旎生物技術(shù)有限公司)分離外周血中的CD34陽性單核細胞。

1.3 外周血中l(wèi)ncRNA HOTAIR 表達檢測 采用qRT-PCR技術(shù)。用TRIzol法提取單核細胞的總RNA，按照RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)的說明書進行操作。用紫外分光光度計(美國Thermo公司)檢測總RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)進行逆轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR引物序列(南京金斯瑞生物科技公司)如下：lncRNA HOTAIR正向引物：5′-GGTAGAAAAAGCAACCACGAAG-3′，反向引物：5′-ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGC-3′；18S rRNA正向引物：5′-AGGACATGCATGGACACAGA-3′，反向引物：5′-GGACGGAATCAACTCTGACA-3′。用定量PCR擴增儀(ABI 7500，美國ABI公司)檢測lncRNA HOTAIR表達。qRT-PCR擴增體系10 μL；反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，35個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA HOTAIR的相對表達量。以大于等于相對表達量平均值為lncRNA HOTAIR高表達，小于其相對表達量平均值為低表達。

1.4 隨訪 對完全緩解56例患者采用電話或門診就診的方式進行隨訪。隨訪時間為進入完全緩解期后1～60個月至患者復發(fā)、死亡或2017年6月。

2 結(jié)果

2.1 AML患者外周血中LncRNA HOTAIR表達變化 初診AML患者、完全緩解患者化療前后、健康志愿者外周血中LncRNA HOTAIR相對表達量分別為3.92±0.47、4.82±0.36、2.91±0.13、1.15±0.18。初診AML患者外周血lncRNA HOTAIR相對表達量高于健康志愿者(P<0.05)；完全緩解患者化療后外周血lncRNA HOTAIR相對表達量低于化療前(P<0.05)。

2.2 LncRNA HOTAIR表達與AML患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 LncRNA HOTAIR高表達與AML患者的年齡、性別、FAB亞型、是否完全緩解及AML危險度分層無關(guān)(P均>0.05)，與白細胞計數(shù)(WBC)、血小板(PLT)、血紅蛋白(Hb)水平有關(guān)(P均<0.05)。見表1。

2.3 LncRNA HOTAIR表達與AML患者預后的關(guān)系 行誘導化療的AML患者86例，其中l(wèi)ncRNA HOTAIR高表達54例、低表達32例。 lncRNA HOTAIR高表達患者化療完全緩解率為50.00%(27/54)，低表達患者化療完全緩解率為90.62%(29/32)，比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。lncRNA HOTAIR高表達完全緩解患者的總生存時間為(15.30±1.94)個月，lncRNA HOTAIR低表達完全緩解患者總生存時間為(30.52±2.34)個月，比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。

表1 LncRNA HOTAIR高表達與AML患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

3 討論

AML是成人最常見的急性白血病類型，起病急，病程進展迅速，發(fā)病率和病死率均呈逐年增高趨勢[8]。為提高AML患者的治療效率、改善AML患者的預后，近年來，越來越多的研究傾向于揭示AML的發(fā)病機制，尋找新的治療靶標[9]。

LncRNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且多種lncRNA被證實與血液系統(tǒng)惡性腫瘤相關(guān)[10]。LncRNA HOTAIR是首個被發(fā)現(xiàn)的LncRNA，在胃癌[11]、宮頸癌[12]等多種惡性腫瘤組織中異常高表達，發(fā)揮促癌基因的功能。lncRNA HOTAIR可與多梳蛋白抑制復合物2(PRC2)相互作用，促進PRC2到達靶基因染色質(zhì)區(qū)，調(diào)節(jié)下游靶基因表達，促進肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。此外，lncRNA HOTAIR參與獲得性耐藥的產(chǎn)生。如在肺癌A549/DDP耐藥細胞中，敲除lncRNA HOTAIR后，能夠逆轉(zhuǎn)細胞的化療耐藥[13]。lncRNA HOTAIR可作為多種腫瘤患者預后預測的分子標記物[14]，然而lncRNA HOTAIR的表達及與AML患者預后的關(guān)系尚不清楚。

本研究采用qRT-PCR法檢測健康志愿者和初診AML患者外周血中l(wèi)ncRNA HOTAIR表達，結(jié)果顯示，lncRNA HOTAIR在初診AML患者外周血中高表達，此結(jié)果與lncRNA HOTAIR在膀胱癌[15]、乳腺癌[16]等實體腫瘤組織中的表達一致。提示lncRNA HOTAIR高表達可能參與并且促進了AML的發(fā)生。本研究接受標準DA方案化療的86例患者中，有56例患者完全緩解，化療后完全緩解AML患者外周血lncRNA HOTAIR表達較化療前降低，提示lncRNA HOTAIR表達與AML的化療療效相關(guān)；化療過程中檢測lncRNA HOTAIR表達變化可監(jiān)控AML患者的病情。

AML患者常伴有嚴重的并發(fā)癥，如外周血WBC異常增高，致使血液黏度增加，小血管內(nèi)易形成微血栓，損傷肺、腦等重要器官，進而導致呼吸窘迫綜合征、腦出血等危及生命的并發(fā)癥[17]；AML患者常伴有PLT減少癥，對于PLT計數(shù)<50×109/L的患者，需要預防性或治療性輸注PLT，而PLT輸注無效引起的嚴重出血是導致AML患者高病死率的重要原因之一[18]；此外，低Hb與AML患者的總生存時間密切相關(guān)，且可作為AML患者長期無復發(fā)生存的預測指標[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR高表達預示患者具有較高的WBC水平，較低的PLT、Hb水平。提示lncRNA HOTAIR高表達的AML患者常合并多種并發(fā)癥。

lncRNA HOTAIR高表達的AML患者，接受化療后的完全緩解率更低，且總生存時間更短，提示lncRNA HOTAIR高表達具有作為AML患者不良預后靶分子的潛能。

綜上所述，本研究證實lncRNA HOTAIR在初發(fā)AML患者外周血中高表達，且經(jīng)化療獲得完全緩解后，lncRNA HOTAIR表達水平有所下降；lncRNA HOTAIR高表達的AML患者完全緩解率低、總生存時間短，預后更差。lncRNA HOTAIR可作為AML治療和預后預測的潛在靶點。

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