Bmi-1基因沉默對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE2生物學(xué)行為的影響

王巧，羅清，李亞軍，3，鄒彥

(1貴州省人民醫(yī)院，貴陽550002；2遵義醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院；3遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院)

鼻咽癌(NPC)是我國常見的惡性腫瘤，好發(fā)于鼻咽部咽隱窩和頂前壁，在我國南部及東南亞具有較高的發(fā)病率[1,2]。放療和化療是NPC主要的治療手段，然而，仍有約20%的患者在治療后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致Ⅲ～Ⅳ期NPC患者的5年生存率僅為10%～40%[3]。因此，尋求更高效、安全的治療方法是臨床關(guān)注的重點(diǎn)。Bmi-1是多梳基因家族(PcG)的重要成員，在乳腺癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌等多種實(shí)體瘤組織中高表達(dá)[4～6]，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)生物學(xué)行為，如細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡、腫瘤發(fā)生及干細(xì)胞的自我更新和分化[7]。研究發(fā)現(xiàn)，Bmi-1在癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤形成、疾病進(jìn)展、侵襲與轉(zhuǎn)移及疾病不良預(yù)后密切相關(guān)[8,9]。2014年10月～2016年3月，本研究用shRNA慢病毒特異性沉默NPC的CNE2細(xì)胞內(nèi)Bmi-1基因表達(dá)，探討其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的影響，為NPC的分子靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 人胚腎上皮細(xì)胞(293T)購買于昆明細(xì)胞庫，人NPC細(xì)胞株(CNE2)由廣州中山醫(yī)科大學(xué)培養(yǎng)，慢病毒載體PLVx-shRNA2、PLP1、PLP2、PLP/VSVG購于長沙贏潤生物技術(shù)公司，LipofectamineTM2000購于上海英濰捷基貿(mào)易有限公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購于TaKaRa，兔抗人Bmi-1多克隆抗體購于英國Abcam公司，二抗-山羊抗兔、內(nèi)參β-actin購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 PLVx-shRNA2-Bmi-1重組載體的構(gòu)建 查找Bmi-1(NM=005180)在GeneBank中的mRNA核苷酸鏈，根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)3條不同的shRNA干擾片段，分別設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)：EcoRI、BamHI，引物合成由上海生工生物公司完成。shRNA1的F序列：ATCCGGAATGGTCCACTTCCATTGATCAAGAGT-

CAATGGAAGTGGACCATTCCTTTTTTG；shRNA2的F序列：GATCCGGGTCATCAGCAACTTCTTCTTCAAG-

AGAGAAGAAGTTGCTGATGGACCCTTT；shRNA3的F序列：GATCCGCCAATGGCTCTAATGAAGATTTCA-AGAGAATTTCATTAGAGCCATTGGCTTTTTTG。

1.3 慢病毒包裝、濃縮及滴定 將PLVx-shRNA2、PLP1、PLP2、PLP/VSVG按照TIANGEN(DP106)進(jìn)行質(zhì)粒提取，輕柔加入LipofectamineTM2000與各質(zhì)粒DNA混合液，共轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長期293T細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)過夜，上述培養(yǎng)條件孵育48 h收集細(xì)胞上清液，于4 ℃、3 000 g、離心20 min，加入Lenti-XTM concentrator獲得病毒濃縮液。采用孔稀釋法測定病毒滴度，將病毒原液按10倍梯度稀釋。取10個(gè)無菌的EP管，每個(gè)管中加入無血清培養(yǎng)基90 μL，取待測的病毒原液10 μL 加入第1個(gè)管，混勻，取 10 μL加入第2個(gè)管，繼續(xù)相同操作至最后一管。各管分別取10 μL 加入各孔293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)情況，計(jì)算病毒滴度，病毒滴度(TU/mL)=表達(dá)熒光細(xì)胞數(shù)/病毒原液量。

1.4 CNE2細(xì)胞感染及最佳沉默效率篩選 采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)CNE2細(xì)胞，常規(guī)換液傳代。取出病毒液，濃度進(jìn)行梯度稀釋，使其感染復(fù)數(shù)(MOI)分別為100、10、1。加入Polybrene儲(chǔ)液1 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min。感染48 h后觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況，當(dāng)GFP大于80%用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，此時(shí)MOI為最佳。選取MOI=100用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)感染CNE2細(xì)胞。將CNE2細(xì)胞隨機(jī)分為5組，對(duì)照組不進(jìn)行感染，shRNA1、2、3組分別感染表達(dá)shRNA1、2、3的慢病毒，空載體組感染空載的慢病毒。感染48 h后用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，讀取Ct值，應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算Bmi-1基因的相對(duì)表達(dá)量。提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，根據(jù)說明書用TBST液稀釋一抗(Bmi-1 1∶1 000，β-actin 1∶3 000)，4 ℃孵育過夜，次日TBST液洗膜3次，每次5 min；同樣方法稀釋二抗(1∶4 000)，室溫孵育2 h后進(jìn)行ECL顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)成像，Image J軟件測出目的條帶的灰度值，計(jì)算Bmi-1蛋白相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)RT-PCR及Western blotting法檢測結(jié)果，篩選沉默Bmi-1的最佳干擾序列。

1.5 Bmi-1基因沉默后CNE2細(xì)胞增殖能力檢測 采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)。感染48 h后收集各組細(xì)胞，接種于6孔板，400個(gè)/孔，37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長情況換液，培養(yǎng)2周或肉眼可見克隆斑時(shí)，4%甲醛固定細(xì)胞15 min；PBS清洗3次，結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗凈后晾干，拍照，計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.6 Bmi-1基因沉默后CNE2細(xì)胞凋亡和周期檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。感染48 h后收集各組細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，胰酶消化，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。加入1×BindingBuffer 400 L輕柔重懸細(xì)胞沉淀。移取AV-FITC(暗室操作)5 μL，混勻后室溫暗室孵育15 min。移取PI 10 μL，混勻后暗室中放在冰上5 min，30 min內(nèi)上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡比例。細(xì)胞周期樣品制備(同細(xì)胞凋亡)，用冷卻的70%乙醇1 000 μL混勻細(xì)胞，沉淀，置于4 ℃冰箱2 h以上，1 000 g離心5 min，換PBS重復(fù)上述步驟。加入PI 500 μL，輕柔吹打細(xì)胞，置37 ℃暗室，檢測各期細(xì)胞比例。

2 結(jié)果

2.1 PLVx-shRNA2-Bmi-1重組質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果 將構(gòu)建的PLVx-shRNA2-Bmi-1進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示：插入的序列與設(shè)計(jì)的3條shRNA序列堿基排列一致，說明目的片段均已正確插入，PLVx-shRNA2-Bmi-1慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 Bmi-1-shRNA的沉默效率 對(duì)照組、空載體組及Bmi-1-shRNA1、2、3組中Bmi-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、0.98±0.01、0.45±0.03、0.17±0.01、0.14±0.01。與其他兩組比較，Bmi-1-shRNA1、2、3組Bmi-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低(P均<0.05)，Bmi-1-shRNA3組最低(P均<0.05)，Bmi-1-shRNA3的抑制效率=(1-0.14)/1×100%=86.00%。對(duì)照組、空載體組及Bmi-1-shRNA1、2、3組中Bmi-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.89±0.02、0.86±0.04、0.67±0.01、0.54±0.05、0.36±0.04，與其他兩組比較，Bmi-1-shRNA1、2、3組Bmi-1蛋白相對(duì)表達(dá)量低(P均<0.05)，Bmi-1-shRNA3組最低(P均<0.05)。

2.3 沉默Bmi-1基因?qū)NE2細(xì)胞增殖的影響 空載體組、Bmi-1-shRNA3組中細(xì)胞克隆形成數(shù)目，分別為(271.67±18.77)、(203.3±20.21)個(gè)/視野，與空載體組比較，Bmi-1-shRNA3組增殖能力弱(P均<0.05)。

2.4 沉默Bmi-1基因?qū)NE2細(xì)胞凋亡的影響 空載體組、Bmi-1-shRNA3組中細(xì)胞凋亡率分別為10.00%±0.40%、 12.97%±0.72%，與空載體組比較，Bmi-1-shRNA3組細(xì)胞凋亡率高(P均<0.05)。

2.5 沉默Bmi-1基因?qū)NE2細(xì)胞周期的影響 空載體組、Bmi-1-shRNA3組中G1期細(xì)胞比例分別為45.57%±10.34%、67.98%±7.85%，S期細(xì)胞比例分別為38.62%±6.12%、24.74%±5.58%，與空載體組比較，Bmi-1-shRNA3組G1期細(xì)胞比例高，S期細(xì)胞比例低(P均<0.05)。

3 討論

放療和化療是NPC主要的治療手段，然而，由于NPC解剖部位的特殊性及早期臨床癥狀不明顯，導(dǎo)致大部分患者在就診時(shí)已是局部晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，致使NPC 5年生存率低，臨床預(yù)后差[10]。Bmi-1基因最早在鼠淋巴瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[11]，是PcG家庭的重要成員。PcG家族是由多種與細(xì)胞周期和增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄抑制因子組成，是一類重要的與發(fā)育相關(guān)的基因，在干細(xì)胞的維持、胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中有著不可忽視的作用。研究發(fā)現(xiàn)，Bmi-1基因在癌組織中的表達(dá)高低與腫瘤形成、疾病進(jìn)展、侵襲與轉(zhuǎn)移、疾病不良預(yù)后密切相關(guān)[8,9]。

目前，有關(guān)Bmi-1基因在NPC中的研究國內(nèi)外報(bào)道甚少。為了研究沉默Bmi-1基因?qū)PC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為NPC的分子靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本研究采用RNAi感染技術(shù)，構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體特異性沉默Bmi-1基因。該技術(shù)可特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，抑制靶點(diǎn)基因。與腺病毒系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)系統(tǒng)相比，慢病毒載體系統(tǒng)具有持久、穩(wěn)定地表達(dá)外源基因的優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究選取了慢病毒“四質(zhì)粒”系統(tǒng)進(jìn)行病毒包裝，即慢病毒表達(dá)載體(PLVx-shRNA2)、包裝載體(PLP1、PLP2、PLP/VSVG)、脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。鏡下觀察到293T持續(xù)表達(dá)熒光，與Xu等[12]的研究結(jié)果一致，說明PLVx-shRNA2-Bmi-1重組載體已成功感染293T細(xì)胞。

Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，RNAi干擾技術(shù)可抑制Bmi-1基因在乳腺癌MCF-7細(xì)胞的表達(dá)，其抑制率可達(dá)80%。本研究為獲得沉默Bmi-1基因最佳的干擾片段，設(shè)計(jì)并合成了3條針對(duì)Bmi-1基因的shRNA1、2、3片段，檢測結(jié)果顯示，shRNA1、2、3對(duì)Bmi-1均有不同程度的抑制，其中shRNA3的抑制效果最佳，抑制效率約為86%。由于慢病毒載體感染對(duì)宿主細(xì)胞有一定程度的細(xì)胞毒性，在感染前需摸索慢病毒的最佳MOI值，本研究結(jié)果顯示，當(dāng)MOI=100時(shí)，CNE2細(xì)胞的感染效率為80%以上。

研究指出，作為INK4a/ARF基因的轉(zhuǎn)錄抑制位點(diǎn)，Bmi-1主要通過編碼p16INK4a和p14ARF(動(dòng)物為p19ARF)兩個(gè)腫瘤抑制蛋白進(jìn)行調(diào)控。P16INK4a能夠抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的活性，通過CyclinD-CDK4/6-pRb-E2F使細(xì)胞停滯于G0/G1期，無法進(jìn)入S期。P14ARF則通過MDM2-P53通路來調(diào)控細(xì)胞周期，進(jìn)而達(dá)到調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及維持腫瘤干細(xì)胞自我更新能力的目的[14，15]。降低Bmi-1基因在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致G1期細(xì)胞比例增加。本研究結(jié)果證實(shí)，沉默Bmi-1基因后，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率升高，G1期細(xì)胞比例增加。Zhou等[16]研究指出，沉默Bmi-1基因能抑制ECA109細(xì)胞的增殖能力。本研究結(jié)果顯示，沉默Bmi-1基因后，轉(zhuǎn)染組克隆形成數(shù)減少，增殖能力受到抑制。

綜上所述，本研究成功完成了慢病毒重組載體PLVx-shRNA2-Bmi-1的構(gòu)建，篩選并獲得了沉默Bmi-1效果最佳的干擾片段(Bmi-1-shRNA3)，證實(shí)了Bmi-1基因表達(dá)降低可抑制CNE2細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，改變細(xì)胞周期。這可能為NPC的分子靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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