何首烏提取物減輕大鼠腦缺血再灌注損傷和上調(diào)腦內(nèi)UCP4蛋白水平

易傳安，唐根云，劉立亞，汪冶

（湖南醫(yī)藥學(xué)院1醫(yī)學(xué)形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心，2檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，3民族醫(yī)藥研究中心，懷化 418000）

腦血管缺血性疾病是由缺血、急慢性缺氧等因素導(dǎo)致腦組織損害所致，出現(xiàn)頭暈、肢體麻木、乏力等癥狀，嚴(yán)重者具有語(yǔ)言、思維、計(jì)算、學(xué)習(xí)記憶、情感等功能下降。其發(fā)病機(jī)制雖有興奮性氨基酸毒性、Ca2+超載、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等眾多學(xué)說(shuō)，但一直未能詳細(xì)闡明[1-4]。在治療上主要針對(duì)腦細(xì)胞保護(hù)藥如谷氨酸受體拮抗劑、自由基清除劑、鈣通道拮抗劑等方法[5-8]，但效果不甚理想。解偶聯(lián)蛋白UCP4是位于細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上的一種質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜電位、抑制活性氧生成、維持線粒體鈣穩(wěn)態(tài)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)起保護(hù)作用。何首烏主要含有蒽醌、二苯乙烯苷、卵磷脂等成分，能降低血脂，抗動(dòng)脈粥樣硬化，增加衰老大鼠腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)如5-羥色胺、多巴胺的含量，增強(qiáng)超氧化物歧化酶活性，消除自由基對(duì)機(jī)體的損傷，對(duì)缺血性腦血管疾病具有緩解癥狀，神經(jīng)保護(hù)作用[9-10]。何首烏對(duì)腦缺血再灌注損傷及UCP4表達(dá)有無(wú)影響，目前未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用何首烏提取物干預(yù)腦缺血再灌注損傷大鼠，研究腦內(nèi)UCP4的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制，為何首烏治療腦缺血性血管疾病提供新靶點(diǎn)和新方法。

材料和方法

1 動(dòng)物和分組

SD大鼠128只，雄性，體重220～260g，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)：SCXK（皖）2011-002。腦缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)：大鼠隨機(jī)分成二批，每批分對(duì)照組（假手術(shù)組）和模型組，其中模型組又分成腦缺血2h再灌注6h損傷和腦缺血2h再灌注24h損傷組，每組8只。藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)：大鼠隨機(jī)分成二批，每批分對(duì)照組（假手術(shù)組）、模型組和缺血再灌注后何首烏提取物低、中、高干預(yù)組，每組8只；各干預(yù)組在缺血再灌注6h或24h后每天分別灌胃不同濃度何首烏口服液，連續(xù)7d。實(shí)驗(yàn)中死亡脫失的動(dòng)物和造模后不符合模型判定標(biāo)準(zhǔn)的都不計(jì)算在內(nèi)。

2 主要試劑

何首烏提取物由湖南醫(yī)藥學(xué)院民族醫(yī)藥研究中心贈(zèng)送。 UCP-4多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology Inc，USA)； SABC免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；PVDF膜（美國(guó)Millipore公司）；水合三氯乙醛（上?；瘜W(xué)試劑公司）；

3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

SpectraMax 190型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)MD公司）， LG10-2.4A型超速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），熒光顯微鏡（日本尼康公司），-80℃超低溫冰箱（日本三洋電子有限公司），Bioshine ChemiQ4600熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海市歐翔科學(xué)儀器有限公司），電泳儀與轉(zhuǎn)移電泳槽（美國(guó)Bio Rad公司）。

4 何首烏提取物的制備和使用

何首烏提取物劑量低、中、高三組分別按6.25g、12.50g和25.00g浸膏溶于50ml水中，配制成125mg/ml、250 mg/ml和500mg/ml濃度的口服液。按1ml/100g/d劑量術(shù)后口服灌胃，每天一次，共計(jì)7d。

5 大鼠局灶性腦缺血模型的建立

腹腔注射10%水合氯醛（0.3ml/100g）麻醉大鼠，仰臥固定，頸正中切口，依次暴露并分離右頸總動(dòng)脈，右頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，分別置4-0號(hào)線備用。結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，在頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉處開(kāi)口，將經(jīng)石蠟處理的尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，插入長(zhǎng)度以分叉處計(jì)約18mm～20mm。結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈，固定尼龍線，縫合。在缺血2h后，分別固定大鼠，將尼龍線抽拉出至頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處，實(shí)現(xiàn)再灌注。按Bederson的方法對(duì)大鼠的神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分[11]。選取得分1～3分的大鼠為成功模型，剔除未出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙以及昏迷或者死亡的大鼠。腦缺血再灌注損傷大鼠UCP4表達(dá)實(shí)驗(yàn)，在腦缺血2h再灌注6h和腦缺血2h再灌注24h后處死大鼠。何首烏干預(yù)實(shí)驗(yàn)，在腦缺血2h再灌注24h后喂藥7d，每天一次，第7d后處死大鼠。

6 腦組織梗死面積的測(cè)定

建模成功后，大鼠在灌服何首烏最末一次60min后，立即斷頭取腦，去除嗅球、小腦及低位腦干后，腦組織放于-20℃冰箱中，冷凍20min，取出后間隔3mm連續(xù)做冠狀切片，置于1%TTC磷酸緩沖液中，37℃下恒溫避光孵育30min，正常組織染成紅色，梗塞灶染成白色，腦片置4%多聚甲醛固定，數(shù)碼相機(jī)拍照，采用Image J 分析梗死面積和總面積，記錄梗死面積占總面積的百分比。梗死面積百分比（%）＝蒼白區(qū)面積/腦片面積×100%。

7 UCP4免疫組織化學(xué)染色

大鼠腦缺血2h再灌6h或腦缺血2h再灌注24h后立即斷頭處死，取腦進(jìn)行石蠟包埋；石蠟切片用二甲苯和梯度酒精脫蠟至水后，PBS浸泡切片5 min；3%過(guò)氧化氫室溫孵育5min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，PBS沖洗3次，每次2min；在切片上滴加10%正常山羊血清（PBS緩沖液稀釋），放置在濕盒中，室溫孵育10～15min，以封閉游離的結(jié)合位點(diǎn)，減少非特異性染色；甩去多余山羊血清，勿洗，滴加抗UCP4一抗，4℃孵育過(guò)夜；PBS漂洗3次，每次2min；滴加生物素標(biāo)記的二抗（羊抗兔lgG工作液），37℃孵育30min；PBS漂洗3次，每次2min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育20min；PBS漂洗3次，每次2min； DAB顯色后蘇木精染液染色5 min，蒸餾水沖洗后脫水、透明、封片。

8 UCP4的Western blot檢測(cè)

斷頭處死大鼠，取腦放入勻漿器，按1g∶10ml加入裂解液，碾碎后置于冰上裂解30min。將裂解好的蛋白移入1.5ml離心管中4℃高速離心機(jī)中，10000r/min離心15min。上清液移入EP管中，-80℃保存。將所提蛋白按與上樣緩沖液按體積1∶4進(jìn)行混合后置于金屬浴槽內(nèi)100℃變性10min。經(jīng)10%SDSPAGE電泳后，再進(jìn)行轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%牛奶封閉液室溫1h。用TBST（Tris-HCl緩沖液 100ml，Nacl 87.6g，Tween20 5ml，蒸餾水1000ml）洗3次，每次5min。滴加UCP4抗體4℃過(guò)夜。用TBST洗膜3次（每次5min）后，用二抗稀釋液按說(shuō)明書(shū)上的倍數(shù)稀釋相對(duì)應(yīng)的二抗，室溫下孵育1h，TBST洗3次膜（每次5min）后加ECL孵育，Bioshine ChemiQ4600熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影，用Image J軟件對(duì)蛋白條帶光密度進(jìn)行定量分析，以UCP4條帶光密度與β-actin條帶光密度比值代表UCP4相對(duì)水平。

9 統(tǒng)計(jì)方法

利用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)描述，用方差分析進(jìn)行多組間UCP4指標(biāo)表達(dá)水平的比較，SNK-q檢驗(yàn)法進(jìn)行各組間的兩兩比較，P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腦缺血再灌注損傷早期大鼠腦內(nèi)UCP4水平上調(diào)

免疫組織化學(xué)染色顯示，UCP4在正常大鼠腦組織內(nèi)UCP4免疫反應(yīng)性較弱，免疫陽(yáng)性產(chǎn)物位于胞質(zhì)內(nèi)（圖1A）。腦缺血2h再灌6h后UCP4免疫組織化學(xué)陽(yáng)性產(chǎn)物明顯增多（圖1B），再灌注24h后UCP4免疫組織化學(xué)表達(dá)增加不明顯（圖1C）。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，腦缺血再灌注6h組，UCP4蛋白水平明顯增加，再灌注24h組UCP4表達(dá)與對(duì)照組相近（圖1D）。

圖1 腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)UCP4表達(dá)變化。A-C，UCP4表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)（比例尺：20μm）；A，對(duì)照組；B，缺血再灌注6h組；C，缺血再灌注24h組；D，UCP4表達(dá)的Western blot檢測(cè)；E，Western blot檢測(cè)的UCP4表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，P＜0.01Fig.1 Changes of UCP4 expression level in the cerebral cortex with ischemia reperfusion injury of the rats. A to C, UCP4 expression detected by immunohistochemistry (scale bar, 20μm); A, control group (Ctrl); B, ischemia reperfusion for 6h group (6h); C, ischemia reperfusion for 24h group (24h);D, UCP4 expression detected by Western blot; E, statistical analysis for UCP4 expression level detected by Western blot; *, P＜0.01

2 何首烏干預(yù)減少腦缺血再灌注損傷大鼠腦損傷面積

在腦缺血2h再灌注6h后，按1ml/100g/d不同濃度的何首烏口服液術(shù)后灌胃干預(yù)，連續(xù)7d后處死大鼠進(jìn)行TTC染色分析。結(jié)果顯示，何首烏低濃度（125mg/ml）組腦缺血損傷面積較大，較未干預(yù)的模型組略減小，中濃度（250 mg/ml）組損傷面積明顯減小，高濃度（500mg/ml）組損傷面積減小更為明顯（圖2）。說(shuō)明何首烏能減輕腦缺血再灌注損傷所致腦組織壞死。

圖2 何首烏提取物對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠皮質(zhì)損傷面積的影響。中、高濃度何首烏能顯著減輕腦缺血再灌注損傷大鼠皮質(zhì)損傷。*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01Fig.2 Effect of polygonum multi florum extract on the injured area of cerebral cortex with ischemia reperfusion injury of the rats. PME-M and PME-H could alleviate the cortical damage after ischemia reperfusion injury. *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01

3 何首烏上調(diào)腦缺血再灌注損傷大鼠腦內(nèi)UCP4蛋白水平

在大鼠腦缺血2h再灌注24h服用何首烏提取物， Western blot結(jié)果顯示，模型組大鼠UCP4表達(dá)水平與對(duì)照組相近，何首烏干預(yù)后UCP4的表達(dá)濃度隨藥物濃度的增加而增高。當(dāng)何首烏提取物為125mg/ml 時(shí)，UCP4表達(dá)最低，當(dāng)濃度為500mg/ml時(shí)，UCP表達(dá)最高。說(shuō)明經(jīng)何首烏干預(yù)后，腦缺血再灌注急性損傷UCP4水平逐漸恢復(fù)并高于正常（圖3）。

討 論

1 UCP4蛋白在腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

通過(guò)免疫組織化學(xué)和Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：腦缺血再灌注損傷大鼠UCP4在腦缺血再灌注損傷6h表達(dá)升高，缺血再灌注24h表達(dá)恢復(fù)至對(duì)照組水平。由此提示腦缺血再灌注損傷早期UCP4表達(dá)增高，后期表達(dá)降低。運(yùn)用何首烏提取物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)該藥能減少腦缺血再灌注損傷的面積，提高UCP4在腦組織的表達(dá)，并且UCP4的表達(dá)隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)。

圖3 何首烏提取物對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦內(nèi)UCP4表達(dá)的影響。PME-L，低濃度何首烏提取物；PME-M，中濃度何首烏提取物；PME-H，高濃度何首烏提取物；*，P＜0.01；**，P＜0.001Fig.3 Effect of polygonum multi florum root extract on the expression of UCP4 in the cortex with cerebral ischemia reperfusion injury of the rats.PME-L, low concentration of polygonum multi florum extract; PME-M, medium concentration of polygonum multi florum extract; PME-H, high concentration of polygonum multi florum extract; *, P＜0.01; **, P＜0.001

UCP4蛋白在腦缺血再灌注6h后腦組織內(nèi)表達(dá)增高，再灌注24h后表達(dá)降低；這與王麗榮等報(bào)道的原代培養(yǎng)神經(jīng)元類缺血再灌注損傷后表達(dá)結(jié)果相反[13]，但與曲方等大鼠腦缺血后腦組織UCP4表達(dá)情況一致[14]。本研究可能由于腦組織急性缺血、缺氧導(dǎo)致線粒體發(fā)生功能障礙，而氧化損傷是線粒體功能障礙的主因；同時(shí)線粒體內(nèi)UCP4蛋白被激活，表達(dá)上調(diào)，在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增多，使腦組織缺血反應(yīng)減輕，提示UCP4對(duì)腦組織具有保護(hù)作用。神經(jīng)元類缺血再灌注損傷由于氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，活性氧ROS產(chǎn)生增多，可能導(dǎo)致腦內(nèi)合成的UCP4蛋白減少，提示UCP4可能參與了腦損傷的病理過(guò)程，其作用機(jī)制須進(jìn)一步研究。資料表明UCP2基因敲除小鼠會(huì)加重腦缺血再灌注損傷[15-16]。UCP4蛋白能使線粒體增殖，減少氧化損傷，保護(hù)線粒體膜電位，維持ATP水平[17-18]。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，UCP4和UCP2蛋白可以調(diào)節(jié)線粒體ROS產(chǎn)量，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。本研究證實(shí)UCP4在腦缺血再灌注損傷后早期表達(dá)增強(qiáng)，后期表達(dá)降低，經(jīng)何首烏干預(yù)治療后表達(dá)增高。我們推測(cè)UCP4是細(xì)胞內(nèi)一種抗氧化損傷蛋白，對(duì)線粒體和細(xì)胞起保護(hù)作用。目前證明，腦梗塞患者發(fā)病后血液中UCP4蛋白的表達(dá)增高，腦組織SOD活性降低，MDA含量升高[19]，表明UCP4在腦梗塞中參與了線粒體氧化代謝作用。

2 何首烏提取物對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠UCP4的影響

生首烏能解毒、消癰、潤(rùn)腸通便，制首烏能補(bǔ)肝腎、益精血、烏發(fā)、強(qiáng)筋骨?，F(xiàn)代中醫(yī)臨床上何首烏常用于治療高脂血癥。據(jù)報(bào)道何首烏提取物在抗皮膚衰老和大腦衰老、抗高脂血癥、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗老年性癡呆等方面發(fā)揮重要作用[9]。近來(lái)報(bào)道，何首烏提取物對(duì)Alzheimer病Ach酶活性有明顯的增強(qiáng)作用和提高BDNF因子含量，促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶能力提高[21-22]。解偶聯(lián)蛋白UCP4是位于細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，使細(xì)胞氧化磷酸化過(guò)程解偶聯(lián)作用，ATP產(chǎn)生減少。何首烏對(duì)腦組織線粒體解偶聯(lián)蛋白UCP4是否有影響，能否作為何首烏藥物治療的靶蛋白，資料少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)?zāi)X缺血再灌注損傷大鼠服用何首烏后UCP4表達(dá)濃度增高，其作用機(jī)制可能是何首烏能提高腦缺血再灌注損傷大鼠UCP4蛋白的合成，降低線粒體ROS的產(chǎn)生，消除自由基對(duì)機(jī)體的損傷，減緩線粒體功能障礙。對(duì)于UCP4的神經(jīng)保護(hù)作用，尚缺少在基因摘除條件和抑制劑作用下，何首烏對(duì)腦缺血再灌注損傷的影響，目前需進(jìn)一步完善。綜上所述，何首烏提取物可能通過(guò)合成腦內(nèi)線粒體UCP4的含量，提高UCP4的表達(dá)，發(fā)揮腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。