電針通過調(diào)節(jié)SIRT1活性改善局灶腦缺血/再灌注大鼠腦內(nèi)炎性損傷

秦文熠，楊涓，羅勇

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1中西醫(yī)結(jié)合科，2神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016）

腦卒中近年來已成為一類極易導(dǎo)致長期殘疾和高死亡率的疾病。眾多研究均表明非藥物治療對(duì)于腦卒中損傷有明顯改善效果。電針作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療手段之一，已被廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療。越來越多實(shí)驗(yàn)證實(shí)電針在動(dòng)物模型中具有顯著療效，如神經(jīng)保護(hù)作用、抗炎及抗凋亡作用[1-4]。研究顯示電針在腦卒中病人及大腦中動(dòng)脈閉塞動(dòng)物模型的治療中具有顯著神經(jīng)保護(hù)作用。本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果顯示，電針通過抑制NF-κBp65信號(hào)通路的活性從而抑制腦缺血再灌注后大鼠腦內(nèi)的炎性損害[3]，而沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）能有效抑制炎性損傷，在腦缺血再灌注損傷具有重要抗炎作用[5,6]。所以，本實(shí)驗(yàn)旨在深入研究電針是否通過調(diào)節(jié)SIRT1表達(dá)來抑制大鼠局灶腦缺血/再灌注炎性損傷的機(jī)制，更深層次闡明電針對(duì)腦缺血再灌注的保護(hù)機(jī)制。

SIRT1是一種尼古丁腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴蛋白脫乙酰酶，是哺乳動(dòng)物的同源性中進(jìn)化最保守的sirutrin家族中的成員之一，在代謝、癌癥、衰老、基因沉默和抗應(yīng)激等復(fù)雜的生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用。近年來的研究表明，SIRT1可調(diào)節(jié)腦卒中病理過程中的炎癥損傷和凋亡，特別是對(duì)緩解腦缺血所致?lián)p傷的作用尤為突出[8-10]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)SIRT1可通過促進(jìn)脫乙酰作用抑制NF-κB p65亞基的信號(hào)激活，進(jìn)而抑制炎性反應(yīng)[11-12]。因此，SIRT1被認(rèn)為是炎癥損傷信號(hào)通路的上游重要靶點(diǎn)。聚焦SIRT1的調(diào)節(jié)作用，有利于進(jìn)一步探究腦缺血再灌注后炎癥反應(yīng)損傷的機(jī)制，同時(shí)為本研究探究電針抗炎機(jī)制提供更新、更精確的靶點(diǎn)研究。

白藜蘆醇(RSV)是SIRT1的激活因子，具有抗氧化、抗凋亡和抑制炎癥等多種作用，離體和在體的研究證據(jù)都有力地表明，白藜蘆醇介導(dǎo)的對(duì)缺血損傷的保護(hù)需要SIRT1活性激活[13-15]，而白藜蘆醇作為SIRT1重要的激活物質(zhì)，納入本實(shí)驗(yàn)中作為藥物干預(yù)組，以便更好研究SIRT1的抗炎機(jī)制。

在本研究中，根據(jù)中醫(yī)的基本理論，我們選擇干預(yù)腦卒中最常選取的穴位“百會(huì)”(GV 20)和“合谷”(LI 4)來操作電針。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

成年雄性無特定病原體級(jí)別（specific pathogen free, SPF）級(jí)SD大鼠70只，假手術(shù)組10只，其余每組20只，體質(zhì)量250～300g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（渝）2012-0001。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針組及電針+藥物組。每組選取再灌注后72h時(shí)間點(diǎn)為研究時(shí)相。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。大鼠自由飲水進(jìn)食，造模前禁食12h。

2 主要試劑和儀器

試劑：兔抗SIRT1及NF-κB p65單克隆抗體（CST Cell Signaling公司，美國）；小鼠抗β-actin抗體（碧云天公司）；兔抗Sirt1單克隆抗體（Abcam，美國，NO.ab104833）；兔抗NF-κBp65單克隆抗體（CST，美國，NO.8242）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）；RIPA裂解液、PMSF蛋白提取試劑（碧云天生物公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Pierce，美國）；Fluoro-Jade B（FJB；Millipore公司，德國）；白藜蘆醇（resveratrol，Sigma公司）儀器：G6850型電針治療儀（北京精工儀器廠）；電泳、電轉(zhuǎn)儀及顯影儀（美國Bio-Rad公司）；Olympus IX70 倒置顯微鏡(Olympus, Tokyo, Japan)； Fluoview FVX 共聚焦掃描頭(Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Wetzlar, Germany)。

3 動(dòng)物模型制備

根據(jù)Longa等[16]報(bào)道的方法，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室[1-3]報(bào)道的經(jīng)驗(yàn)方法，規(guī)范化制備線栓法右側(cè)大腦中動(dòng)脈（MCA）梗塞模型。造模前，大鼠禁食12h，可自由飲水。用3.5%水合氯醛（1ml/100g）腹腔注射麻醉。仰臥位固定，頸正中線切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）。切斷ECA游離備用，暫時(shí)夾閉ICA、CCA。將2.0號(hào)直徑約0.24mm的尼龍絲插入到ICA，輕推至MCA處遇到輕微阻力即停止（深度約為18～20mm）。閉塞2h后輕柔將栓子拔至ECA處固定實(shí)現(xiàn)對(duì)側(cè)動(dòng)脈血流再灌注。假手術(shù)組處理插入線栓之前步驟同模型組，但線栓只緩慢推至ICA10mm（即頸內(nèi)動(dòng)脈顱外部）即可。MCA閉塞時(shí)間為2h，而后將線栓輕柔拔出至ECA中實(shí)現(xiàn)再灌注。

4 電針刺激方法及參數(shù)選擇

根據(jù)中國針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸委員會(huì)制定的《動(dòng)物穴位圖譜》，選取大鼠“百會(huì)”穴（GV 20）及病側(cè)“四關(guān)”穴（合谷 LI 4/太沖 LR 3）；進(jìn)針深度約2mm。連接電針治療儀，刺激參數(shù)采用頻率100/2Hz，疏密波，電流強(qiáng)度1mA，刺激時(shí)間為20min。拔出栓子實(shí)現(xiàn)再灌注開始即時(shí)行電針刺激1次，12h行電針刺激1次，之后每1天電針1次，處死前電針1次。

5 白藜蘆醇給藥方法

大鼠稱重后以20mg/kg的劑量腹腔注射白藜蘆醇，每日一次，再灌注72h后給予最后一次腹腔注射，然后3.5%水合氯醛麻醉斷頭取材備用。白藜蘆醇配置成1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，利用DSMO稀釋成濃度為0.2mg/ml的白藜蘆醇溶液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫麄€(gè)配置過程在室溫避光條件下進(jìn)行[18]。

6 神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分

再灌注后24h及72h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)6組大鼠進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)的評(píng)估，由一名不清楚實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組的調(diào)查者采用Garcia[17]等報(bào)道的18點(diǎn)評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分。該系統(tǒng)由以下6個(gè)試驗(yàn)組成：①自發(fā)的活動(dòng)；②四肢運(yùn)動(dòng)的對(duì)稱性；③前爪伸開；④攀登；⑤本體覺和⑥觸須觸碰反應(yīng)。評(píng)估完成后給每只大鼠的評(píng)分為所有6個(gè)試驗(yàn)的總和。最低神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分為3分，最高得分為18分。

7 FJB及HE染色

HE及FJB染色測(cè)定缺血再灌注腦組織區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元的損傷程度：大鼠腦組織4%多聚甲醛灌流固定后，經(jīng)脫水、浸蠟、石蠟包埋，切取4μm冠狀面連續(xù)切片備用。經(jīng)脫蠟、蘇木素染色、分色、伊紅復(fù)染后脫水、透明及封片。FJB的染色標(biāo)本制備步驟與HE染色相同。制備1%氫氧化鈉與80%乙醇混合液、0.06%高錳酸鉀溶液、0.4% FJB染料及0.0004%FJB工作液后進(jìn)行染色，二甲苯透明后激光共聚焦觀察并采集圖片。用于HE及FJB染色的組織細(xì)胞計(jì)數(shù)方法參照文獻(xiàn)[3]所用細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。采用專業(yè)圖像分析軟件Image-Pro Plus（Media Cybernetics公司，美國）進(jìn)行分析。計(jì)算存活的細(xì)胞數(shù)目，胞體小于3μm的細(xì)胞被視為膠質(zhì)細(xì)胞或壞死神經(jīng)細(xì)胞。對(duì)照組切片的平均存活細(xì)胞數(shù)視為100%。

8 免疫組織化學(xué)染色

4μm石蠟切片用SABC免疫組織化學(xué)方法染色。將組織切片烘烤干燥后置于二甲苯I、二甲苯II中各浸泡25min脫蠟；梯度酒精中各浸泡5min；蒸餾水及PBS沖洗；加入0.01mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液浸泡，微波抗原修復(fù)。3%過氧化氫室溫孵育后PBS沖洗；加即用型山羊血清封閉液37℃恒溫孵育，加入兔抗SIRT1抗體（1∶50）4℃孵育12h以上，PBS沖洗后加入生物素標(biāo)記二抗，37℃恒溫孵育30min，PBS沖洗后加入SABC及DAB顯色，蘇木素染核、分別于鹽酸酒精、飽和碳酸鋰、二甲苯I、二甲苯II中浸泡，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片染色情況，每張切片上觀察5個(gè)高倍視野（×200），計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞光密度值，陽性細(xì)胞為胞核/胞漿呈黃褐色著染。

9 Western blot

取缺血區(qū)皮質(zhì)加入由RIPA裂解液、PMSF（碧云天公司）蛋白提取劑，用超聲破碎儀在冰上勻漿后按照胞漿胞核提取試劑盒的步驟提取胞漿、胞核蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。10%SDS-PAGE凝膠電泳分離后將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜置于5%脫脂奶粉中常溫封閉2h，加小鼠抗β-actin抗體（稀釋濃度1∶2000）、兔抗SIRT1單克隆抗體、兔抗NF-κBp65單克隆抗體（稀釋濃度1∶1000）4℃孵育過夜。TBS/T漂洗后滴加辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG及辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶3000）37℃孵育2h。TBS/T漂洗后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Pierce，美國）在暗室中顯色，凝膠成像儀（Bio-Rad，美國）采集圖像，Quantity One軟件處理分析目標(biāo)及內(nèi)參條帶及相應(yīng)OD值，二者OD值比值即為目標(biāo)條帶的蛋白表達(dá)強(qiáng)度值。

10 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（ANOVA），組間比較用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 白藜蘆醇促進(jìn)電針增加神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和減少神經(jīng)元丟失的作用

神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示，在腦缺血再灌注后72h時(shí)相點(diǎn)，電針組評(píng)分高于模型組評(píng)分，藥物組+電針組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯高于模型組和電針組（圖1）；

HE染色及FJB染色觀察再灌注后72h腦缺血區(qū)域神經(jīng)元損傷情況顯示，神經(jīng)元丟失數(shù)量模型組明顯高于其他組別，同時(shí)藥物+電針組神經(jīng)元丟失數(shù)量較電針組明顯減少（圖2和圖3）。

圖1 Garcia法神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（Mann-Whitney U 檢驗(yàn)）。**，P＜0.01Fig.1 Statistical analysis for Garcia neurological behavior scores(Mann-Whitney U test). **, P＜0.01

圖2 HE染色檢測(cè)各組缺血皮質(zhì)區(qū)內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞幸存百分比。A，假手術(shù)組；B，模型組；C，電針組；D，電針+藥物組；箭頭示存活神經(jīng)細(xì)胞核，箭示死亡神經(jīng)細(xì)胞核；E，神經(jīng)細(xì)胞幸存百分比統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01，比例尺，50μmFig.2 The survival percentage of neurons in the ischemic cortex was detected by HE staining. A, sham group; B, model group; C, EA group; D,EA+RSV group; arrow heads indicating the nuclei of survival neuronal cells, arrows indicating the nuclei of dead neuronal cells; E, statistical analysis for survival percentage of neuronal cells; *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01, scale bar, 50μm

圖3 FJB染色檢測(cè)缺血皮質(zhì)區(qū)內(nèi)神經(jīng)元丟失百分比。A，假手術(shù)組；B，模型組；C，電針組；D，電針+藥物組；E，神經(jīng)細(xì)胞丟失百分比統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01，比例尺，50μmFig.3 FJB staining was used to detect the loss percentage of neuronal cells in ischemic cortex. A, sham group; B, model group; C, EA group; D,EA+RSV group; E, statistical analysis for loss percentage of neuronal cells; *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01, scale bar, 50μm

2 電針上調(diào)缺血再灌注腦組織內(nèi)SIRT1水平

免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)顯示，正常（假手術(shù)組）大鼠腦內(nèi)SIRT1免疫反應(yīng)性較弱，模型組大鼠缺血損傷腦區(qū)SIRT1免疫反應(yīng)性較假手術(shù)組增強(qiáng)，電針組大鼠缺血損傷腦區(qū)SIRT1免疫反應(yīng)性則明顯增強(qiáng)（圖4）。Western blot分先顯示，假手術(shù)組大鼠腦內(nèi)SIRT1水平較低，模型組大鼠缺血損傷腦區(qū)SIRT1水平較假手術(shù)組增加，電針組SIRT1水平上升更為明顯（圖5）。

3 白藜蘆醇增強(qiáng)電針對(duì)缺血再灌注腦組織內(nèi)SIRT1水平的上調(diào)

為明確電針對(duì)SIRT1的調(diào)節(jié)作用，白藜蘆醇作為SIRT1激動(dòng)劑為藥物干預(yù)對(duì)照。Western blot檢測(cè)顯示，電針+藥物組中SIRT1水平明顯高于單純單針組（圖6）。

4 白藜蘆醇促進(jìn)電針對(duì)缺血再灌注腦組織內(nèi)NF-κBp65水平的降低

NF-κBp65是在神經(jīng)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄促炎癥介質(zhì)的主要轉(zhuǎn)錄因子，它的激活加劇了腦缺血再灌注后的神經(jīng)損傷。免疫印跡分析顯示，模型組NF-κBp65水平明顯高于假手術(shù)組，電針能明顯降低缺血再灌注腦組織內(nèi)NF-κBp65水平的升高，而SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇可加強(qiáng)電針對(duì)缺血再灌注腦組織內(nèi)NF-κBp65水平的降低作用（圖7）。

圖4 電針上調(diào)腦組織內(nèi)SIRT1免疫組織化學(xué)表達(dá)。A，假手術(shù)組；B，模型組；C，電針組；D，SIRT1表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01，比例尺，50μmFig.4 The expression of SIRT1 was upregulated in the ischemic cortex detected by immunohistochemistry stainning. A, sham group; B, model group;C, EA group; D, statistical analysis for SIRT1 immunoreactivity in cortex; *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01，scale bar, 50μm

圖5 Western blot示電針處理上調(diào)腦組織內(nèi)SIRT1水平。A，代表性Western blot；B，SIRT1表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01Fig.5 The expression of SIRT1 were increased in the ischemic brain tissue detected by Western blot. A, representative western blot; B, statistical analysis for SIRT1 level in cortex; *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01

圖6 Western blot檢測(cè)顯示電針和白藜蘆醇上調(diào)缺血皮質(zhì)區(qū)SIRT1蛋白表達(dá)。*0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01Fig.6 SIRT1 level was increased after EA and RSV treatment in the ischemic cortex detected by western blot *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01

討 論

腦卒中是嚴(yán)重危害人類健康及誘發(fā)高致殘率、高死亡率的疾病之一，其中又以缺血性腦卒中為主要發(fā)病類型。局灶腦缺血/再灌注引起的損害伴隨局部過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生，眾多炎癥介質(zhì)與細(xì)胞因子均參與了炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，對(duì)腦細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p害。在局灶腦缺血/再灌注的炎癥損害病理過程中，NF-κB信號(hào)通路的激活占據(jù)了炎癥反應(yīng)的核心地位，大量研究證實(shí)抑制NF-κB信號(hào)通路的過度激活，確能有效減輕局灶腦缺血/再灌注的炎癥損傷。

圖7 Western blot檢測(cè)電針和白藜蘆醇對(duì)缺血皮質(zhì)區(qū)NF-κB p65表達(dá)水平的影響。**，P＜0.01Fig.7 Statistical analysis for effect of EA and RSV on NF-κB p65 level in the ischemic cortex detected by Western blot. **, P＜0.01

針灸是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中重要的組成部分，在腦卒中后的康復(fù)中，電針可發(fā)揮積極治療作用，但電針在缺血性腦卒中急性期的治療作用機(jī)制仍有待深入。本團(tuán)隊(duì)既往研究中確已證實(shí)電針能有效抑制局灶腦缺血/再灌注后的炎癥損傷，對(duì)NF-κB信號(hào)通路的過度激活有顯著抑制作用。因此電針作為“非藥物”治療手段，在局灶腦缺血/再灌注后的炎癥反應(yīng)中有極大的治療價(jià)值與探索價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)的研究方向，深入研究電針抗炎的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)機(jī)制及干預(yù)的作用靶點(diǎn)，為“外治內(nèi)病”的“非藥物”治療手段擴(kuò)展新視角與新平臺(tái)。

在近年的研究中，眾多的學(xué)者針對(duì)局灶腦缺血/再灌注后炎癥反應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行深層次的研究，其中SIRT1因其在炎癥、心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性變等過程中的多種不同作用而成為藥物開發(fā)的靶點(diǎn)。已有研究證實(shí)SIRT1對(duì)于炎癥損傷亦有抑制作用，且SIRT1蛋白為NF-κBp65的上游蛋白，該信號(hào)通路的激活受SIRT1的調(diào)控，因此進(jìn)一步研究SIRT1的作用機(jī)制，以及是否受電針調(diào)控從而調(diào)節(jié)炎癥損害成為本研究的主旨。作為SIRT1的藥物干預(yù)對(duì)照，其激動(dòng)劑白藜蘆醇能促進(jìn)SIRT1蛋白表達(dá)，提高SIRT1生物活性。

本研究結(jié)果顯示電針干預(yù)后改善腦缺血損傷大鼠的神經(jīng)功能行為評(píng)分，減少神經(jīng)元損傷，SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇組的神經(jīng)保護(hù)作用較單獨(dú)使用電針干預(yù)更為顯著。對(duì)SIRT1水平檢測(cè)顯示，電針能增加局灶腦缺血/再灌注損傷大鼠大腦皮質(zhì)中SIRT1水平，電針與白藜蘆醇聯(lián)合能進(jìn)一步增加SIRT1水平。進(jìn)一步對(duì)SIRT1通路下游蛋白NF-κB p65檢測(cè)顯示，電針可顯著降低腦缺血/再灌注損傷大鼠的大腦皮質(zhì)中NF-κB p65水平，聯(lián)合白藜蘆醇干預(yù)后，這一抑制作用更為顯著。由此表明電針通過調(diào)節(jié)腦缺血/再灌注后腦內(nèi)SIRT1的表達(dá)從而改善炎癥損傷，減輕炎癥的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，研究證實(shí)電針在SIRT1激活時(shí)具有更強(qiáng)的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。

總之，電針改善炎癥損傷的機(jī)制涉及多個(gè)環(huán)節(jié)與靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)SIRT1蛋白表達(dá)從而緩解炎癥損害是電針抗炎的機(jī)制之一，亦是本團(tuán)隊(duì)今后繼續(xù)探索電針抗炎機(jī)制的方向之一。今后實(shí)驗(yàn)中擬行基因干預(yù)的方法進(jìn)一步論證電針的抗炎機(jī)制，為我國傳統(tǒng)非藥物治療手段的機(jī)制研究提供更為扎實(shí)的理論基礎(chǔ)與廣闊視角。