電針通過PI3K/AKT信號通路動員腦缺血/再灌注大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞至外周血

胥虹貝，母松，朱艷含，朱君，周雪靈，羅勇*

（1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶400016；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肛腸外科，貴州550004）

在缺血性腦血管病治療中，如何提高缺血半暗帶內(nèi)血流，挽救瀕死神經(jīng)元一直是缺血性腦血管病的治療難點(diǎn)。缺血性腦損傷發(fā)生后，骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）可在多種細(xì)胞因子，如缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）和趨化因子受體4（C-XC chemokine receptor type 4，CXCR4）等誘導(dǎo)下從骨髓動員至外周血，并歸巢至腦缺血區(qū)參與血管再生[1-4]。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（phosphatidylinositol -3 kinase/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase，PI3K/AKT/eNOS）是與EPCs增殖、遷移、歸巢相關(guān)的代表性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[1,5,6]。本課題組前期研究表明，電針可加速局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓EPCs動員至外周血，上調(diào)骨髓和外周血EPCs數(shù)量[1,7-9]，但其具體機(jī)制尚不十分明確。本研究旨在通過觀察電針及PI3K特異性拮抗劑LY294002干預(yù)后，大鼠骨髓和外周血CD34+EPCs數(shù)量變化情況和大腦皮質(zhì)缺血區(qū)內(nèi)CD34+微血管再生情況，以期深入探討電針促進(jìn)局灶腦缺血/再灌注后腦內(nèi)血管再生的可能機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動物分組

192只SPF級成年雄性SD大鼠（250-300g），由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心[動物資格證：SCXK（渝）2018-0003]提供。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）、缺血組（I/R）、缺血+電針組（I/RE）和缺血+電針+LY294002組（I/REL）。腦缺血90min后，根據(jù)再灌注時間不同將各組大鼠分為再灌注24h、48h和7d 三個亞組。

2 主要試劑和儀器

小鼠抗PE-CD34多克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology公司，美國）、兔抗CD34多克隆抗體（CST公司，美國）、FITC標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗（Proteintech，美國）、紅細(xì)胞裂解液（碧云天，中國）、LY294002（Sigma，美國）、p-AKT（磷酸化AKT）和總AKT ELISA試劑盒（ab126433，Abcam，美國）、eNOS ELISA試劑盒（ab230938，Abcam），G6850型電針治療儀（購自北京精工儀器廠），流式細(xì)胞儀（FACS vantage SE，BD公司，美國），激光掃描共聚焦顯微鏡（尼康，日本）。

3 局灶腦缺血/再灌注模型

采用改良線栓法[10]結(jié)合羅勇等[11]的方法，制備SD大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血/再灌注模型（transient middle cerebral artery occlusion/reperfusion，tMCAO）。大鼠術(shù)前禁食一晚，不禁飲。3.5%水合氯醛腹腔注射（1mg/100g）麻醉大鼠后，將大鼠仰臥位固定于操作臺，除頸部毛發(fā)，行頸正中縱行切口，鈍性分離頸部肌肉，充分暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈顱外段，結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)端，沿頸內(nèi)動脈分離翼顎動脈，結(jié)扎起點(diǎn)端。在頸外動脈殘端剪一斜行切口，緩慢插入提前準(zhǔn)備好的頭端圓潤、直徑為0.25～0.27mm的線栓，當(dāng)線栓頭端距頸總動脈分叉處約18～20mm處可感到明顯阻力時，表明線栓頭端已達(dá)大腦中動脈起始端。栓塞90min后將線栓拔出至頸外動脈殘端實(shí)現(xiàn)再灌注。待大鼠完全清醒后，采用Longa 5分法[10]進(jìn)行神經(jīng)功能評分，評分為2～3分者視為造模成功，入選實(shí)驗(yàn)。Sham組在造模過程中，插入的線栓距頸總動脈分叉處約10mm即可，其余操作同上。因各種原因所致各組大鼠不足預(yù)設(shè)數(shù)量，均按隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊實(shí)驗(yàn)動物。

4 電針治療和PI3K/AKT通路抑制處理

參照中國針灸學(xué)會實(shí)驗(yàn)針灸委員會制定的實(shí)驗(yàn)動物穴位圖譜，選取大鼠“百會”穴（GV20）及左側(cè)“四關(guān)”穴（合谷 LI4/太沖 LR3）為電針穴位，利用直徑為0.38mm，長度為1寸的華佗牌不銹鋼銀針于“百會”穴處斜刺入頭皮1mm，直刺“四關(guān)”穴2mm，針刺“百會”穴及“四關(guān)”穴通電刺激。連接電針治療儀，刺激參數(shù)為：頻率2/20 Hz，疏密波型，強(qiáng)度以大鼠肢體輕微震顫為宜。I/RE和I/REL組首次電針刺激于再灌注后1h進(jìn)行，刺激時間20min/次，每天治療1次，最長7d。I/REL組動物在造模成功后立即腹腔注射和PI3K/AKT通路抑制劑LY-294002。LY294002溶解于二甲亞砜，終濃度為0.1mg/ml，計量為0.3mg/kg/d[12]。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測

3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，用含肝素鈉的抗凝管取腹主動脈血約2ml備用。后用含2%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基沖洗出大鼠脛骨和股骨的骨髓細(xì)胞，吹打混勻后，采用70μm細(xì)胞篩過目，離心后重懸細(xì)胞，采用1% PBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106左右備用[1]。取骨髓和外周血細(xì)胞懸液各100μl，各加2μl PE-CD34抗體，4℃避光孵育20min，后加 ml紅細(xì)胞裂解液，4℃避光孵育10min，4℃ 1500r/min離心5min，棄上清，加入2ml PBS重懸細(xì)胞，4℃1500r/min 離心5min，最后用100μl PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

6 酶聯(lián)接免疫吸附劑測定（ELISA）

將清洗干凈的玻璃勻漿管行高溫高壓滅菌備用，加入1ml蛋白裂解液RIPA和10μl PMSF，在各指定時間點(diǎn)分別提取各組大鼠股骨和脛骨新鮮骨髓，放入勻漿管中充分勻漿至組織溶解，將組織勻漿液移入離心管，于4℃條件下12000rpm/min離心10min，取上清備用。按照ELISA操作步驟按照說明書分別檢測各樣本p-AKT、AKT、eNOS含量。

7 CD34+ 微血管密度的免疫熒光檢測

將各組大鼠腦組織冰凍切片（厚度為10μm）于-80℃冰箱取出，室溫放置10min，PBS沖洗5min，加入5% Trition 于37 ℃孵育30min，PBS洗5min共3次，后用5% 山羊血清于37℃封閉1h，甩干血清，兔抗CD34一抗（1∶50）孵育，4℃過夜。第二天，37℃復(fù)溫1h，后用FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗于37℃孵育1h。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察、拍照和計數(shù)。CD34+微血管密度判定方法：在20倍（物鏡）視野下計數(shù)血管直徑＜20μm或單個細(xì)胞陽性，但和周圍細(xì)胞分界清楚視為一個新生血管，微血管數(shù)(個/HP)為每個視野下的血管數(shù)。

8 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LY294002抑制電針對腦缺血再灌注大鼠骨髓和外周血中CD34+ EPCs數(shù)量的增加

流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，腦缺血再灌注后24h和48h，大鼠骨髓和外周血中CD34+EPCs數(shù)量較Sham組明顯增多，再灌注后第7d，CD34+EPCs數(shù)量高于Sham組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。缺血再灌注后進(jìn)行EA處理，骨髓和外周血中CD34+EPCs數(shù)量在各個觀察時間點(diǎn)均較未進(jìn)行電針處理的缺血再灌注大鼠均明顯增多，而用LY294002阻斷PI3K/AKT通路后，電針處理不再增加缺血再灌注大鼠骨髓和外周血CD34+EPCs數(shù)量（圖1）。

2 LY294002抑制電針對腦缺血再灌注大鼠骨髓p-AKT和eNOS含量的增加

ELISA檢測顯示，腦缺血再灌注后24h、48h和72h，大鼠骨髓p-AKT和eNOS含量較Sham組明顯增多；缺血再灌注后進(jìn)行EA處理，骨髓p-AKT和eNOS含量在各個觀察時間點(diǎn)均較未進(jìn)行電針處理的缺血再灌注大鼠均明顯增多，而用LY294002阻斷PI3K/AKT通路后，電針處理不再增加缺血再灌注大鼠骨髓p-AKT和eNOS。不同組別在缺血再灌注后各個時間點(diǎn)總AKT蛋白含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 電針對腦缺血再灌注大鼠骨髓及外周血CD34+ EPCs數(shù)量的影響。A1，骨髓CD34+ EPCs代表性流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果；A2，骨髓CD34+EPCs數(shù)量統(tǒng)計分析；B1，外周血CD34+ EPCs代表性流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果； B2，外周血CD34+ EPCs數(shù)量的統(tǒng)計分析；*，P＜0.01 vs Sham組；#，0.01＜P＜0.05 vs I/R組；&，0.01＜P＜0.05 vs I/REL組；n=6Fig.1 Effect of electronacupuncture on the number of CD34+ EPCs in the bone marrow and peripheral blood of the rats with cerebral ischemia/reperfusion. A1, representative flow cytometry results of CD34+ EPCs in the rat bone marrow; A2, statistical analysis for the number of CD34+ EPCs in the rat bone marrow; B1, representative flow cytometry results of CD34+ EPCs in the rat peripheral blood; B2, statistical analysis for the number of CD34+EPCs in rat peripheral blood; *, P＜0.01 vs Sham group; #, 0.01＜P＜0.05 vs I/R group; &, 0.01＜P＜0.05 vs I/REL group; n=6

圖2 LY294002和電針對腦缺血再灌注大鼠骨髓p-AKT 和eNOS含量的影響。A，ELISA檢測骨髓pAKT含量的統(tǒng)計學(xué)分析；B，ELISA檢測骨髓總AKT含量的統(tǒng)計學(xué)分析比較；C，ELISA檢測骨髓eNOS含量的統(tǒng)計學(xué)分析；*，P＜0.01 vs Sham組；#，0.01＜P＜0.05 vs I/R組；&，P＜0.01 vs I/REL組；n=4Fig.2 Effect of LY294002 and electroacupuncture on the content of p-AKT, AKT and eNOS in the bone marrow of the rats with cerebral ischemia/reperfusion. A, statistical analysis for the content of pAKT detected by ELISA in the bone marrow; B, statistical analysis for the content of total AKT detected by ELISA in the bone marrow; C, statistical analysis for the content of eNOS detected by ELISA in the bone marrow; *, P＜0.01 vs Sham group; #, 0.01＜P＜0.05 vs I/R group; &, P＜0.01 vs I/REL group; n=4

3 LY294002抑制電針對腦缺血再灌注大鼠缺血區(qū)大腦皮質(zhì)CD34+微血管密度的增加

免疫熒光共聚焦結(jié)果顯示，再灌注后24h，大腦皮質(zhì)缺血區(qū)CD34+的新生血管以單個細(xì)胞為主，管腔較小，再灌注后7d缺血區(qū)新生血管密度增加，多種管徑大小的血管并存。腦缺血再灌注后24h、48h和7d，大鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)CD34+MVD較Sham組明顯增多。缺血再灌注后進(jìn)行EA處理，大腦皮質(zhì)缺血區(qū)CD34+MVD在各個觀察時間點(diǎn)均較未進(jìn)行電針處理的缺血再灌注大鼠均明顯增多，而用LY294002阻斷PI3K/AKT通路后，電針處理不再增加缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)CD34+MVD。

圖3 LY294002和電針對腦缺血再灌注大鼠缺血區(qū)大腦皮質(zhì)CD34+ 微血管密度的影響。A，大腦皮質(zhì)CD34+微血管密度的免疫熒光檢測；B，CD34+微血管密度的統(tǒng)計分析；*，P＜0.01 vs Sham組；#，0.01＜P＜0.05 vs I/R組；&，P＜0.01 vs I/REL組；n=6Fig.3 Effect of LY294002 and electroacupuncture on the CD34+ microvessel density in the ischemia cerebral cortex of the rats with cerebral ischemia/reperfusion. A, immuno fluorescent detection for CD34+ microvessel density in the cerebral cortex; B, statistical analysis for the CD34+ microvessel density; *, P＜0.01 vs Sham group; #, 0.01＜P＜0.05 vs I/R group; &, P＜0.01 vs I/REL group; n=4

討 論

修復(fù)受損內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)腦血管再生一直是缺血性腦卒中的治療難題。近年來， EPCs以其強(qiáng)大的促血管再生潛能成為缺血性腦卒中治療的研究熱點(diǎn)。EPCs是一類主要來源于骨髓，具有游走性，并能定向分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞特性的未成熟內(nèi)皮細(xì)胞[13]。缺血性腦卒中后患者外周血EPCs水平與患者腦梗死面積及預(yù)后明顯相關(guān)[14,15]。近年來對腦缺血后EPCs在腦血管再生中的作用研究多采用細(xì)胞移植手段，研究發(fā)現(xiàn)移植的EPCs可定向歸巢至腦缺血區(qū)參與血管再生[16,17]。本課題組前期從整體水平出發(fā)，對局灶腦缺血/再灌注大鼠脛骨骨髓腔注射可被EPCs特異性攝取的Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―IL-acLDL），追蹤活體內(nèi)骨髓EPCs的運(yùn)行軌跡，于再灌注后第1-7d均在大鼠外周血檢測出DIL-acLDL+CD34+EPCs，直觀證實(shí)了腦缺血損傷后機(jī)體可動員自身內(nèi)源性骨髓EPCs至外周血參與血管再生[18]。然而生理條件下，機(jī)體骨髓和外周血EPCs數(shù)量相當(dāng)有限[19]，盡管腦缺血后腦內(nèi)血管生成機(jī)制立即被啟動，但機(jī)體的自我修復(fù)能力有限，遠(yuǎn)不足以代償原有血供。因此，在缺血性腦損傷修復(fù)過程中，探索如何促進(jìn)骨髓EPCs動員到外周血，歸巢到腦內(nèi)，促進(jìn)腦內(nèi)血管再生至關(guān)重要。

大量研究表明，電針治療可有效上調(diào)局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓和外周血EPCs數(shù)量。由于EPCs具有許多細(xì)胞表面標(biāo)記物，如CD34、CD133、CD144、CD31、Vwf、VEGFR2、Tie2和c-kit/CD117等，在EPCs增殖分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞過程中，EPCs可呈現(xiàn)多種動態(tài)細(xì)胞表面標(biāo)記組合，至今尚無特異性鑒定EPCs的方法。因此，在研究電針對缺血性腦卒中大鼠骨髓及外周血EPCs數(shù)量時，不同研究所選取的標(biāo)記物有所不同。王秀志等[20]發(fā)現(xiàn)，電針可增加局灶腦缺血/再灌注大鼠外周血VEGFR2+PECAM-1+EPCs數(shù)量，上調(diào)腦缺血皮質(zhì)VEGFR-2、PECAM-1的表達(dá)，促進(jìn)缺血區(qū)腦血管形成。趙瑛等[21]研究表明，電針可通過上調(diào)局灶腦缺血/再灌注大鼠外周血CD31+VEGFR2+EPCs數(shù)量、上調(diào)外周血VEGF的表達(dá)從而促進(jìn)血管再生，推測電針動員大鼠內(nèi)源性EPCs的機(jī)制可能與VEGF表達(dá)上調(diào)有關(guān)。Xie等[1]研究表明，電針治療可上調(diào)局灶腦缺血/再灌注大鼠外周血和骨髓CD34+VEGFR2+EPCs數(shù)量，該作用與電針治療增加大鼠骨髓、外周血和大腦缺血皮質(zhì)SDF-1α表達(dá)，促進(jìn)SDF-1α濃度梯度的形成，增加SDF-1α濃度梯度差值并延長作用時間有關(guān)。此外，電針亦可上調(diào)缺血性腦卒中大鼠骨髓及外周血VEGFR2+EPCs、CD34+EPCs數(shù)量。由于CD34是一直存在于不同時期EPCs表面的標(biāo)記物，對鑒定EPCs具有敏感性、特異性和可靠性，是科研及臨床研究與應(yīng)用中較好的標(biāo)記物等[22,23]，故本研究選取CD34作為EPCs表面標(biāo)記物。本研究結(jié)果表明，電針可上調(diào)局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓和外周血CD34+EPCs數(shù)量，其中骨髓內(nèi)CD34+EPCs數(shù)量于再灌注后24h達(dá)到高峰，后隨再灌注時間的延長逐漸減少，而外周血中CD34+EPCs數(shù)量于再灌注后24h開始增高，48h時升至最高，后逐漸減少，骨髓CD34+EPCs數(shù)量逐漸減少，而外周血CD34+EPCs數(shù)量逐漸升高，但再灌注后48h，外周血CD34+EPCs數(shù)量隨再灌注時間延長而呈遞減趨勢，推測該結(jié)果與CD34+EPCs在機(jī)體內(nèi)先由骨髓內(nèi)動員至外周血，之后又歸巢到腦缺血區(qū)有關(guān)。

研究表明，PI3K/AKT是具有代表性的與EPCs增殖、遷移、歸巢相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[4-6]。在各種病生理條件刺激下，機(jī)體骨髓PI3K/AKT信號途徑被激活，AKT磷酸化增多，活化的AKT可誘導(dǎo)eNOS合成，使一氧化氮（NO）合成增多，NO促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）硝基化，活化的MMP-9使EPCs易于脫離骨髓微環(huán)境，參與缺血區(qū)血管生成[24-26]。本團(tuán)隊前期研究表明，電針治療可通過PI3K/AKT信號促進(jìn)腦缺血后腦內(nèi)血管再生[8,27]。Ying等[24]發(fā)現(xiàn)采用LY294002阻斷PI3K作用后，EPCs的細(xì)胞活力降低，EPCs促血管再生的能力明顯減弱。Wang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PI3K作用被wortmannin阻斷后，骨髓EPCs的遷移能力顯著降低。此外，研究表明缺乏eNOS的小鼠，VEGF誘導(dǎo)的骨髓EPCs的動員能力明顯減弱[26]，提示PI3K/AKT信號途徑在促進(jìn)骨髓EPCs動員及血管再生中具有重要作用。由于目前關(guān)于骨髓PI3K/AKT/eNOS信號途徑在電針上調(diào)骨髓及外周血EPCs數(shù)量中的作用尚不十分明確，故本研究通過采用藥物干預(yù)，探討電針對骨髓EPCs的動員作用是否是通過對PI3K/AKT的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果表明，腦缺血可誘導(dǎo)骨髓pAKT和eNOS蛋白表達(dá)增多，且pAKT和eNOS蛋白表達(dá)隨再灌注時間延長逐漸增多，而總AKT蛋白含量不變，提示腦缺血損傷可誘導(dǎo)機(jī)體骨髓內(nèi)源性PI3K/AKT/eNOS信號途徑的激活。根據(jù)本研究結(jié)果，電針治療使得骨髓PI3K/AKT/eNOS信號途徑被進(jìn)一步激活，同時電針可促進(jìn)骨髓EPCs動員至外周血，這提示我們兩者之間是否具有某種關(guān)聯(lián)呢？為進(jìn)一步證實(shí)電針上調(diào)骨髓、外周血EPCs是否是通過進(jìn)一步促進(jìn)骨髓PI3K/AKT信號途徑激活完成，本研究采用腹腔注射LY294002特異性阻斷PI3K作用的方式，探討電針促進(jìn)骨髓EPCs動員的可能機(jī)制。研究表明，采用0.3mg/kg劑量的LY294002腹腔注射，可以有效抑制SD大鼠體內(nèi)PI3K/AKT信號通路，故本研究亦采用該劑量[12]。本研究結(jié)果表明，腹腔注射LY294002后，電針未能促進(jìn)AKT蛋白磷酸化，且未能明顯上調(diào)eNOS蛋白表達(dá)。同時，電針促進(jìn)骨髓CD34+EPCs動員至外周血的作用被明顯削弱，表現(xiàn)為LY294002處理可抑制電針對EPCs再生能力的增加，提示電針可通過動員骨髓內(nèi)EPCs至外周血的作用是通過其促進(jìn)骨髓PI3K/AKT信號通路完成的。研究表明，歸巢至缺血區(qū)的EPCs可通過參與缺血組織的血管重建和損傷血管的再內(nèi)皮化發(fā)揮促血管再生的作用。由于CD34廣泛分布于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及其前體細(xì)胞，在成熟血管內(nèi)皮中的表達(dá)很低[28]，采用CD34作為細(xì)胞表面標(biāo)記計數(shù)微血管密度，具有較高的特異性、敏感性和可重復(fù)性[29]。因此本研究采用CD34作為微血管的標(biāo)記物。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)阻斷PI3K/AKT通路后，電針治療未能提高大腦皮質(zhì)缺血區(qū)CD34標(biāo)記的微血管密度，表明電針治療促進(jìn)腦內(nèi)血管再生的作用被明顯抑制，而這一結(jié)果可能與電針促進(jìn)骨髓EPCs動員至外周血的效應(yīng)被抑制有關(guān)。

本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，采用腹腔注射LY294002特異性阻斷PI3K作用，抑制AKT磷酸化，同時研究不同時間點(diǎn)大腦皮質(zhì)缺血區(qū)內(nèi)腦內(nèi)血管再生情況。我們發(fā)現(xiàn)電針上調(diào)局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓和外周血EPCs數(shù)量以及促進(jìn)大腦皮質(zhì)缺血區(qū)血管再生的效應(yīng)在阻斷PI3K/AKT信號通路后明顯減弱，直接證實(shí)了電針可通過PI3K/AKT介導(dǎo)骨髓EPCs動員至外周血，為電針在臨床上治療缺血性腦卒中提供了一定的理論依據(jù)。