腎缺血再灌注損傷大鼠腎內(nèi)AQP2表達水平降低

阿不都許庫爾·阿不力米提，阿力木江·吐拉洪，熱娜古麗·努爾，楊盼，比拉力·艾山，姚巧玲

（1新疆醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院組織胚胎學教研室；2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院泌尿外一科；3新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腎病科；4新疆醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院；5新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院；6新疆醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理教研室，烏魯木齊 830011）

缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)，是指組織發(fā)生缺血時和其后恢復血液灌注時器官功能不能恢復正常，甚至組織損傷進一步加重或器官功能衰竭。腎作為高灌注器官，是對IRI較為敏感的器官之一。在腎手術(shù)、腎移植、休克，體外震波碎石等過程中均會發(fā)生不同程度的IRI，并可能出現(xiàn)急性腎功能衰竭（acute renal failure, ARF）[1]，其機制可能與氧自由基生成過多、細胞內(nèi)鈣超載、炎癥因子及遞質(zhì)參與、細胞凋亡、膜脂質(zhì)過氧化、一氧化氮含量變化等多因素參與引起的腎功能紊亂[2]。水通道蛋白（aquaporins, AQPs）是一種與水分子進出細胞膜相關(guān)的膜鑲嵌蛋白，其中AQP2主要分布在腎集合管上皮細胞，在水分子重吸收，尿液形成過程中起重要作用[3,4]。本實驗通過將大鼠右側(cè)腎蒂夾閉45min后恢復血液灌注，建立IRI模型，觀察雙側(cè)腎集合管AQP2分布的變化，探討IRI時發(fā)生多尿與AQP2表達間的相關(guān)性。

材料與方法

1 實驗動物分組與模型建立

健康成年雄性SD大鼠（體重250～300g）50只（由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供），隨機分為腎IRI 1d、3d、5d、7d和假手術(shù)1d組。應用10%水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，右上腹備皮，取仰臥位，應用5ml/L碘伏溶液常規(guī)消毒鋪無菌孔巾，取右肋緣下斜切口，進入腹腔后小心分離右側(cè)腎蒂用無損傷動脈夾夾閉，阻斷出入右側(cè)腎臟血流（在此過程中注意保持實驗大鼠體溫及減少腹腔的不顯性失水），45min后重新恢復腎臟血液灌注。當松開動脈夾后腎臟在2～5min內(nèi)顏色從暗紫色轉(zhuǎn)為紅色說明缺血再灌注損傷模型建立成功，腎血管無血栓形成，關(guān)腹。若超過5min未轉(zhuǎn)為正常的紅色則認為腎臟有血栓形成，模型建立失敗，排除出實驗組。假手術(shù)組僅游離右側(cè)腎蒂而不進行夾閉，45min后關(guān)腹。實驗大鼠麻醉清醒后轉(zhuǎn)入相對清潔的代謝籠中，接24h尿液，標準飼料喂養(yǎng)和自由飲水。所有實驗大鼠均于術(shù)后30min內(nèi)清醒，1h內(nèi)進水。所有實驗大鼠均無腹腔感染、大出血等手術(shù)并發(fā)癥發(fā)生，術(shù)后成活率為100%。

2 標本采集

分別于再灌注1d、3d、5d、7d和假手術(shù)組1d后處死大鼠。留處死前24h尿液，測尿量。經(jīng)腹主動脈取血4～8ml靜置30min后3000r/min，離心10min，取血清檢測血肌酐及尿素氮。摘除左右側(cè)腎，切成1cm × 1cm小塊用4%、10%的甲醛/PBS固定24h，用10%和20%梯度焦糖清洗各8h，4%甲醛固定的腎組織用OCT包埋劑（optimal cutting temperature compound，萊卡，德國）包埋，液氮冷凍后轉(zhuǎn)入 80℃冰箱保存；10%甲醛固定的腎組織用石蠟包埋后行HE病理學檢測。

3 免疫組織化學

光鏡：腎臟冰凍組織標本用冰凍切片機（萊卡，德國）切成厚度為4μm切片，PBS液沖洗，滴加5%正常山羊血清，室溫孵育30min，傾去血清，直接滴加1∶500的AQP2單克隆抗體（Abcam, Cambridge,UK），4℃冰箱過夜，經(jīng)PBS沖洗，滴加抗HRP標記聚合物（P0488, Dako, Japan） 稀釋500倍，室溫孵育2h，經(jīng)PBS沖洗，滴加DAB顯色復合液（K3467, Dako, Japan）顯色5～60s，Mayer蘇木素復染，封片。以胞膜有黃褐色顆粒為陽性表達。

所有切片隨機選取10個視野，在40×物鏡下拍片后用Image pro軟件對陽性表達部位行量化處理，測IOD值。

免疫電鏡[5]：冰凍切片用PBS液沖洗3次，每次15min，滴加含有0.02% sapponin 的5%正常山羊血清（上海翊圣生物），室溫孵育20min；用AQP2單克隆抗體（Abcam, Cambridge, UK）用含有0.005%sapponin 的5%正常山羊血清稀釋500倍，4℃冰箱孵育過夜；經(jīng)PBS（含有0.005% sapponin）沖洗5×10min，滴加納米金（nanogold）標記的羊抗兔IgG Fab片段二抗（Nanoprobes, USA）；（用含有0.005%sapponin 的5%正常山羊血清稀釋50倍），室溫孵育2h；經(jīng)PBS沖洗 5次，每次10min，用1%的戊二醛固定10min，雙蒸水沖洗；繼而用含有1mg/ml醋酸銀（silver acetate）、4mg/ml檸檬酸三鈉（trisodium citrate）、15mg/ml一水檸檬酸（citric acid monohydrate）和2.5 mg/m對苯二酚（p-dihydroxy-benzene）的銀增強溶液孵育8min，增強納米金電子密度，迅速雙蒸水沖洗后用0.05%醋酸鈉（sodium acetate）孵育1min，再用雙蒸水沖洗6次，每次2min；用0.05%氯化金染色2min，經(jīng)6次沖洗后用1%四氧化鋨（osmium tetroxide）再固定，20min后雙蒸水沖洗3次，每次2min。最后切片，用乙醇脫水，用內(nèi)含Epon的膠囊蓋至切片組織上方包埋，50°C溫箱保存。包埋凝固后撥開膠囊，從接觸面切成60nm厚度超薄切片，電鏡（JEM-100CXII）觀察記錄。

4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示。兩兩比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 成功建立腎缺血再灌注模型

所有實驗大鼠均于術(shù)后30min內(nèi)清醒，1h內(nèi)進水。所有實驗大鼠均無腹腔感染、大出血等手術(shù)并發(fā)癥發(fā)生，術(shù)后成活率為100%。通過對尿量和尿比重的檢測發(fā)現(xiàn)，腎IRI后尿量增多，再灌注第1d起開始，3d尿量達到高峰，隨后開始逐漸減少，第7d有所恢復（表1）；尿比重在IRI 3d最低，5d其次，假手術(shù)1d組最高（表1）。血尿素氮在腎IRI 1d和5d組間變化無統(tǒng)計學意義，其余組間比較在0.5水平均有統(tǒng)計學差異。IRI 1d后血尿素氮升高，3d最高，以后逐漸降低，至7d恢復至接近正常（表1），但仍高于正常；腎IRI組1d大鼠術(shù)后血肌酐較對照組明顯升高，IRI 第3d達到最高，隨后開始逐漸減少，于IRI第7d恢復恢復至接近正常（表1），但仍高于正常。

表1 腎臟缺血再灌注損傷提高尿量、血肌酐和尿素氮水平Tab.1 Renal ischemia-reperfusion injury increased the volume of urine and the levels of serum creatinine and BUN of the experimental rats

2 腎臟缺血再灌注損傷術(shù)后腎組織呈充血、水腫和炎性改變

通過對腎臟組織切片HE染色、光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，再灌注右腎組織1d充血、水腫，小管上皮細胞明顯腫脹，可見部分小管上皮細胞壞死、脫落；腎間質(zhì)可見炎性細胞浸潤（圖1A）。在3d和5d這些病理變化逐步消失（圖1B，C），腎組織在7d基本恢復正常（圖1D）。

3 腎臟缺血再灌注損傷術(shù)后AQP-2免疫反應性減弱

在腎髓質(zhì)集合管處有AQP2陽性表達（圖2A），放大后發(fā)現(xiàn)AQP-2主要分布在集合管主細胞管腔側(cè)（圖2B），相鄰的閏細胞AQP2為陰性（圖2B）。免疫電鏡觀察顯示，AQP2主要分布在腎臟集合管主細胞管腔側(cè)和靠近管腔側(cè)的囊泡內(nèi)（圖2C，D），閏細胞AQP2為陰性（圖2C）。

對免疫反應性進行定量分析顯示，在腎缺血再灌注各時間組，左腎和右腎AQP2免疫反應性均具有顯著差異：再灌注1d左腎AQP2免疫反應性代償性升高，3d最高，以后逐漸降低，7d最低。右腎AQP2免疫反應性以假手術(shù)1d組最高，以后逐漸減少，再灌注5d時最低（圖3）。

討 論

AQPs是分布在細胞膜的水分子進出細胞相關(guān)的通道蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)有13種AQPs，分布不同的組織器官中，分別介導不同類型細胞膜的跨膜水轉(zhuǎn)運。近期研究發(fā)現(xiàn)AQPs與某些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。腎臟是水代謝的主要器官，我們發(fā)現(xiàn)，在大鼠腎組織中AQP2主要分布在腎臟集合管主細胞管腔側(cè)和靠近管腔側(cè)的囊泡內(nèi)，這與AQP2分布相關(guān)報道相符。AQP2是血管升壓素（vasopressin，VP）誘導性水通道蛋白。VP通過與集合管集合管上皮細胞基底膜上的V2受體結(jié)合，誘導細胞內(nèi)cAMP水平升高，激活PKA，后者使囊泡磷酸化，囊泡內(nèi)的AQP2插入細胞頂膜，參與水分子的重吸收過程，并在尿液形成中起重要作用[6]。

圖1 大鼠腎HE染色。A，術(shù)后1d右腎組織炎性變化；B，術(shù)后3d右腎組織炎性變化；C，術(shù)后5d右腎組織炎性變化；D，術(shù)后7d右腎組織炎性變化；比例尺，50μmFig.1 HE staining of the rat kidney tissue. A, in flammatory changes of right kidney tissue 1 day after operation; B, in flammatory changes of right kidney tissue 3 days after operation; C, in flammatory changes of right kidney tissue 5 days after operation; D, in flammatory changes of right kidney tissue 7 days after operation; scale bar, 50μm

本實驗中，結(jié)扎右腎蒂45min后，在1d和3d內(nèi)，腎24h尿量、尿蛋白、尿素氮和血肌酐水平明顯升高，病理切片示腎上皮細胞腫脹，脫落嚴重，提示大鼠腎缺血再灌注損傷模型復制成功。此時右腎集合管上皮AQP2表達量明顯下降，其機制可能與以下因素有關(guān)：缺血再灌注過程中腎組織產(chǎn)生大量氧自由基，再加上再灌注后組織對氧自由基的清除功能下降，導致氧自由基大量堆積。這些氧自由基可導致細胞膜損傷，生物膜功能障礙，攻擊蛋白質(zhì)分子使蛋白質(zhì)分子氧化而發(fā)生變形、破壞[7,8]，這可能是AQP2表達量降低的主要因素之一。細胞膜受到破壞后可導致大量細胞外鈣離子內(nèi)流，引起的鈣離子超載，加上炎癥因子和炎癥遞質(zhì)的介入使核酸和染色體受到破壞，蛋白質(zhì)功能被抑制，最終導致細胞變性、壞死。此外，研究表明細胞凋亡也是腎缺血再灌注組織和器官損傷的主要途徑之一[9]。而且腎臟皮髓交界處是凋亡細胞主要集中部位之一。這些因素均可導致右側(cè)腎蒂結(jié)扎后AQP-2表達量降低。AQP-2表達的減少可能是導致再灌注損傷后尿液濃縮障礙、尿量增多的主要原因。大量研究結(jié)果表明，腎功能與腎臟缺血再灌注受損嚴重程度有關(guān)。隨著機體的自身免疫調(diào)節(jié)能力、抗氧化能力的逐漸恢復，腎缺血再灌注損傷逐步修復，大鼠腎功各項指標，病理變化漸趨于模型組5d和7d基本恢復正常，AQP2表達量也逐漸上升，24h尿量也恢復正常范圍。

本實驗研究表明，與結(jié)扎腎（右腎）相比，對側(cè)腎（左腎）的AQP2的表達量在缺血再灌注損傷內(nèi)增高，隨著右腎缺血再灌注損傷逐步修復，表達逐步降低，與右側(cè)缺血再灌注損傷的AQP2表達程度的變化趨勢相反。雖然對24h尿量變化的影響不明顯，但可以說明一側(cè)腎在缺血再灌注損傷時對側(cè)有一定的代償功能，但具體機制尚不明確。

圖2 腎組織中AQP-2的免疫組織化學定位。A，腎髓質(zhì)集合管處AQP2陽性表達的光鏡免疫組織化學定位；B，A中方框內(nèi)放大圖像，示AQP-2主要分布在集合管主細胞管腔側(cè)（箭），相鄰的閏細胞AQP2為陰性（箭頭）；C和D， AQP2在腎髓質(zhì)集合管的免疫電鏡定位，示AQP2定位于主細胞管腔側(cè)和靠近管腔側(cè)的囊泡內(nèi)（箭），而閏細胞內(nèi)無表達（箭頭）；比例尺：A，100μm；B，50μm；C和D，1μmFig.2 Immunohistochemical localization of AQP-2 in the kidney tissue. A, immunohistochemical localization of positively expressed AQP2 in renal medullary collecting duct under light microscope; B, high magnification image of the frame in A, showing positive expression of AQP2 on the luminal side of the collecting duct principal cells (arrow) but negative expression in the adjacent intercalated cells (arrow head); C and D, immunoelectron microscopic localization of AQP2 in renal medullary collecting duct, showing positive expression of AQP2 on the luminal side of the principle cells and in the vesicles near the lumen sides of the principle cells but no expression of AQP2 in the intercalated cells; scale bar, 100μm in A; 50μm in B; 1μm in C and D

圖3 缺血再灌注損傷后腎組織AQP-2 IOD表達降低。#示IRI組左腎與對照組左腎相比P＜0.001；*示IRI組右腎與對照組右腎相比，P＜0.001Fig.3 Level of AQP-2 IOD decreased in kidney after ischemia-reperfusion injury. # indicating P＜0.001, left kidney of IRI group compared with sham operation; * indicating P＜0.001, right kidney of IRI group compared with sham operation

綜上所述，除了溶質(zhì)因素導致的滲透性利尿和腎小管的重吸收率失衡外，AQP2表達量的降低與也與腎缺血再灌注損傷發(fā)生多尿密切相關(guān)，故AQP-2表達的高低是腎缺血再灌注損傷時決定腎功紊亂的重要因素之一。