結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖核抗原及生長(zhǎng)抑制因子4表達(dá)的關(guān)系及預(yù)后因素

孫旭凌，申 婧，黃桂林，李豫江，李志剛

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，從2000年～2011年，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率及年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率均顯著上升，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重的影響[1]。細(xì)胞增殖核抗原(Ki-67)是具有代表性的增殖抗原之一，與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)[2]，生長(zhǎng)抑制因子4 ( inhibitor of growth family member 4 ,ING4)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的候選抑癌基因，與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修補(bǔ)及血管生成密切相關(guān)[3]。該研究通過(guò)比較結(jié)直腸癌患者中Ki-67和ING4的表達(dá)情況，觀察其與臨床病理特征的關(guān)系，探討二者的相關(guān)性以及對(duì)預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1病例資料收集2010年1月～2010年12月石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸癌患者石蠟病理標(biāo)本71例。71例患者術(shù)前均未經(jīng)過(guò)化療，其中有5例術(shù)前肝轉(zhuǎn)移，1例肺轉(zhuǎn)移。其中男33例，女38例，年齡34～79歲，中位年齡62歲；右半結(jié)腸癌11例，橫結(jié)腸2例，左半結(jié)腸癌18例，直腸癌39例，多發(fā)癌(降結(jié)腸+低位直腸癌)1例；高分化5例，中分化56例，低分化10例； T1期3例，T2期23例，T3期22例，T4期23例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例(12例N1，12例 N2)；Ⅰ期19例，Ⅱ期26 例，Ⅲ期20例，Ⅳ期6例。同時(shí)選擇30例距腫瘤>5 cm的癌旁正常組織作為對(duì)照組。

1.2試劑與方法兔抗人ING4多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)abcam公司；鼠抗人Ki-67單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司。采用免疫組織化學(xué)SP法。將標(biāo)本連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化，經(jīng)0.3% H2o2消化內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后，高壓抗原修復(fù)，一抗(兔抗人ING4、鼠抗人Ki-67)、二抗(生物素標(biāo)記)、三抗(鏈霉抗生物素-過(guò)氧化物酶)作用后，DAB顯色，蘇木精復(fù)染后脫水透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3結(jié)果判定由兩名高年資病理科醫(yī)師在雙盲情祝下進(jìn)行染色評(píng)分。Ki-67以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。ING4陽(yáng)性表達(dá)以細(xì)胞核和或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為準(zhǔn)；使用半定量的評(píng)分系統(tǒng)來(lái)評(píng)估抗體的染色效果，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野或500個(gè)細(xì)胞。按染色強(qiáng)度計(jì)分：0分為無(wú)色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：0分為陰性，1分為陽(yáng)性細(xì)胞≤10%，2分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)11%～50%，3分陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51%～75%，4分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>75%，染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比乘積為最后評(píng)分，本研究以3分以上判定為陽(yáng)性結(jié)果。

1.4隨訪術(shù)后采用電話(huà)及入戶(hù)方式進(jìn)行隨訪，起點(diǎn)為手術(shù)日，終點(diǎn)事件定義為患者死亡，定義從手術(shù)日到患者死亡的時(shí)間為生存時(shí)間，如患者出現(xiàn)失訪或截止研究結(jié)束時(shí)患者仍生存，則定義為截尾數(shù)據(jù)，終點(diǎn)為患者出現(xiàn)死亡、失訪或至截止時(shí)間(2015年12月30日)。隨訪結(jié)束時(shí)，獲得完整隨訪資料69例，隨訪率為97.1%。18例患者死亡，其中11例死于癌轉(zhuǎn)移，2例死于心梗，1例死于肝硬化。術(shù)前肝轉(zhuǎn)移的4例患者中3例死亡，1例帶瘤生存。術(shù)后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者有9例，其中5例肝轉(zhuǎn)移，3例肺轉(zhuǎn)移，1例骨轉(zhuǎn)移。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料的比較用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，生存分析采用Kaplan-Meier和Longrank檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Ki-67、ING4在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織的表達(dá)Ki-67在結(jié)直腸癌組織陽(yáng)性表達(dá)率為85.9%(61/71)，高于癌旁組織的6.7%(2/30)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=56.437，P=0.001)。ING4結(jié)直腸癌組織陽(yáng)性表達(dá)率為56.3%(40/71)，低于癌旁組織的90%(28/30)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.701，P=0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 結(jié)直腸癌及癌旁組織中Ki-67和ING4表達(dá) SP×400

2.2Ki-67、ING4的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系及兩者相關(guān)性71例結(jié)直腸癌組織中Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率極高，從5%～95%，不服從正態(tài)分布，中位數(shù)75%，以此將Ki-67分為高表達(dá)、低表達(dá)組。分組后，Ki-67表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、TNM分期有關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度無(wú)關(guān)；71例結(jié)直腸癌組織中，ING4陽(yáng)性表達(dá)與分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、TNM有關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)。見(jiàn)表1。

以每位患者Ki-67、ING4的原始數(shù)據(jù)作為變量，Ki-67、ING4在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.428，P=0.001)。

2.3Ki-67、ING4的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存率的關(guān)系Ki-67高表達(dá)組和低表達(dá)組術(shù)后5年生存率分別為63.9%、85.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ING4陽(yáng)性組和陰性組術(shù)后5年生存率分別為97.4%、45.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。單因素分析顯示，腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目、TNM分期、 Ki-67和ING4表達(dá)情況與患者的預(yù)后均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2、3。

表1 Ki-67、ING4的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4Cox模型分析影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的因素Cox多因素分析結(jié)果顯示，TNM分期、ING4表達(dá)情況均為影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素。見(jiàn)表3。

3 討論

Ki-67是具有代表性、應(yīng)用廣泛的增殖抗原之一，在細(xì)胞周期各期中，其表達(dá)受到高度準(zhǔn)確的調(diào)控，在多種惡性腫瘤中均能檢測(cè)到高表達(dá)的Ki-67，并表明其與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)性[2]。本課題結(jié)果顯示Ki-67在結(jié)直腸癌組織陽(yáng)性表達(dá)率為85.9%(61/71)，高于癌旁組織的6.7%(2/30)，71例結(jié)直腸癌組織中Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率極高，從5%～95%，且不服從正態(tài)分布，中位數(shù)75%，以此將Ki-67分為高表達(dá)、低表達(dá)組，其表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、TNM分期有關(guān)。這與侯寶洲 等[4]、馬海龍 等[5]研究結(jié)果類(lèi)似，證實(shí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量越多、浸潤(rùn)程度越深，Ki-67的陽(yáng)性率越高。在本課題中，Ki-67高表達(dá)組和低表達(dá)組術(shù)后5年生存率分別為63.9%、85.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但侯寶洲、馬海龍等未進(jìn)行Cox多因素分析，來(lái)判斷Ki-67是否為結(jié)直腸癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。而本課題在進(jìn)行Cox多因素分析分析時(shí)顯示，Ki-67并不是結(jié)直腸癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，原因何在，還需進(jìn)一步研究探討，可能是Ki-67在結(jié)直腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)太高，加之免疫組化在多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的評(píng)估方法不一致，標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法統(tǒng)一。這不同于目前Ki-67在乳腺癌中的認(rèn)識(shí)，目前在乳腺癌基因分型中14%是重要臨界值，目前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，雖然Ki-67的高低表達(dá)的判定值在不同病理實(shí)驗(yàn)中心可能不同，可統(tǒng)一采用14%作為判斷其高低的界值，以區(qū)分Luminal分型[6]。

圖2 Ki-67表達(dá)陽(yáng)性與Ki-67陰性生存曲線

臨床病理特征n生存率(%)χ2值P值性別 男3372．10．1650．684 女3876．3年齡(歲) <603065．61．9310．165 ≥604180．5腫瘤部位 結(jié)腸3173．7 直腸3976．82．3190．314 結(jié)腸+直腸10．0腫瘤大小(cm) <53677．10．5500．459 ≥53571．4分化程度 高5100．0 中5678．214．3080．001 低1040．0浸潤(rùn)深度 T22390．7 T32272．79．3080．025 T42356．5淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無(wú)4784．98．0410．005 有2454．2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù) 04784．9 1～31275．014．0920．001 ≥41233．3TMN分期 Ⅱ2680．8 Ⅲ2060．030．6920．001 Ⅲ616．7Ki?67 低表達(dá)3585．54．0200．043 高表達(dá)3663．9ING4 陰性3145．226．0680．001 陽(yáng)性4097．4

表3 結(jié)直腸癌患者預(yù)后影響因素的Cox多因素回歸分析結(jié)果

圖3 ING4表達(dá)陽(yáng)性與ING4陰性生存曲線

ING4蛋白的C端有一植物同源結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通過(guò)和磷脂酰肌醇磷酸信號(hào)分子結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖與存活[7]。Yan et al[8]研究顯示ING4與乳腺癌、胃癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在本課題中，ING4結(jié)直腸癌組織陽(yáng)性表達(dá)率為56.3%(40/71)，低于癌旁組織的90%(28/30)，ING4陽(yáng)性表達(dá)與分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、TNM有關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)。ING4陽(yáng)性組和陰性組術(shù)后5年生存率分別為97.4%、45.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Cox多因素分析結(jié)果顯示，TNM分期、ING4表達(dá)情況均為影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素。這與趙海舟 等[9]研究結(jié)果相似，該學(xué)者研究顯示ING4在直腸癌組織中的陽(yáng)性率53.4%顯著低于正常直腸組織的陽(yáng)性率85.5%，多因素Cox分析ING4表達(dá)水平是影響直腸癌患者術(shù)后的獨(dú)立因素。本研究顯示，結(jié)直腸癌組織中Ki-67 和ING4蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，且二者均與5年生存率有關(guān)，究其原因可能ING4可能抑制腫瘤細(xì)胞惡性增殖，使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等，兩者存在緊密的負(fù)調(diào)節(jié)關(guān)系。目前已有學(xué)者將ING4可作為治療骨肉瘤的候選基因[10]。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)了 Ki-67 和ING4在結(jié)直腸癌生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，并證實(shí)ING4是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，為進(jìn)一步的臨床研究提供更多參考。

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