呼出氣體活體質(zhì)譜分析揭示中醫(yī)推拿引起的代謝反應(yīng)

朱騰高 韓 京 舒俊文 柯牡芳 王 丹 劉文杰 林年香 陳煥文*

1(東華理工大學(xué)， 江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南昌 330013) 2(吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院， 無機(jī)合成與制備化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 長春 130012) 3(德一天合健康維護(hù)中心， 北京 100089)

1 引 言

以中醫(yī)的臟腑、經(jīng)絡(luò)學(xué)說為理論基礎(chǔ)發(fā)展起來的中醫(yī)推拿兼具防病治病的功效。根據(jù)中醫(yī)理論，經(jīng)絡(luò)是人體氣血運(yùn)行的通路，它們在人體內(nèi)彼此緊密相連，內(nèi)通五臟六腑，外絡(luò)肢體皮毛，從而構(gòu)成一個(gè)完整的循環(huán)系統(tǒng)，起著興氣血、通陰陽、養(yǎng)臟腑、利關(guān)節(jié)的作用。然而，現(xiàn)代解剖學(xué)很難發(fā)現(xiàn)與中醫(yī)理論中相對(duì)應(yīng)的經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)。因此，尋求經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)的功能及其物質(zhì)基礎(chǔ)一直是研究者感興趣的課題。

呼出氣體是人體血液的一部分，攜帶了大量能反映生理/病理狀態(tài)的人體代謝產(chǎn)物[1～3]。聞識(shí)呼出氣體的味道而進(jìn)行某些疾病的辨證施治是中醫(yī)聞診的重要內(nèi)容，被確立為僅次于望診的中醫(yī)四診之一。此外，在《難經(jīng)》、《金匱要略·肺痿肺癰咳嗽上氣》中依據(jù)氣味與五臟的相應(yīng)關(guān)系，通過聞識(shí)氣味辨別病變部位[4]。近年來，無需樣品預(yù)處理的呼出氣體直接質(zhì)譜分析在臨床診斷和代謝組學(xué)研究領(lǐng)域日益受到關(guān)注[5～8]，使呼出氣體成為一類取樣方便、實(shí)時(shí)可得、具有重要診斷價(jià)值的生物樣品。以屠呦呦先生獲得諾貝爾獎(jiǎng)為里程碑[9]，國際上越來越重視中醫(yī)藥研究的開發(fā)，俄羅斯等國已設(shè)立專門的體驗(yàn)機(jī)構(gòu)和研究小組[10]。然而，受到研究手段等限制，目前對(duì)中醫(yī)基礎(chǔ)理論的研究仍然鮮見報(bào)道。Hu課題組[11～13]采用電針刺法研究了經(jīng)絡(luò)的傳導(dǎo)功能，德國學(xué)者Schroeder等[14]從中國時(shí)鐘的角度研究了部分腧穴的功能。這些研究對(duì)相關(guān)工作起到了重要參考作用。

與前人研究不同，本研究擬從分子層面出發(fā)，探尋伴隨中醫(yī)推拿出現(xiàn)的感官療效帶來的代謝產(chǎn)物的變化，旨在獲取中醫(yī)推拿療效的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子學(xué)證據(jù)。因此，本研究以志愿者接受中醫(yī)推拿術(shù)前后的呼出氣體為樣品，采用可直接分析呼出氣體樣品的電噴霧萃取電離質(zhì)譜(EESI-MS)為分析平臺(tái)，在分子層次考察中醫(yī)推拿對(duì)新陳代謝的影響。在無需樣品預(yù)處理?xiàng)l件下，EESI-MS可對(duì)液體[15～18]、氣體[19,20]、氣溶膠[18～20]和黏性樣品[22, 23]等各種形態(tài)的生物樣品進(jìn)行在線分析，能夠直接、快速地獲得呼出氣體中豐富的組分信息。在此基礎(chǔ)上，采用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)處理代謝組學(xué)大量多變量數(shù)據(jù)，通過對(duì)比不同志愿者呼出氣體數(shù)據(jù)的PLS-DA分析結(jié)果驗(yàn)證中醫(yī)推拿前后呼吸氣體中代謝產(chǎn)物的變化，并對(duì)部分具有顯著變化的代謝產(chǎn)物進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

高分辨率靜電場軌道阱質(zhì)譜儀(LTQ Orbitrap XL，美國ThermoFisher Scientific公司)，配有Xcalibur 2.2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng); EESI離子源(江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制)；Matlab數(shù)據(jù)分析軟件(Version 7.8.0, Mathworks, Inc., Natick, MA)；Simca數(shù)據(jù)分析軟件(Version 13.0, Umetrics, Sweden)。甲醇(色譜純，美國ROE公司)。

2.2 研究對(duì)象

選擇年齡為28～60歲、不同健康狀態(tài)的男女志愿者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)前對(duì)研究對(duì)象作了臨床醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)調(diào)查問卷，包含了年齡、飲食、睡眠、情緒、病史、運(yùn)動(dòng)習(xí)慣等項(xiàng)目。為了最大程度地排除其它因素干擾機(jī)體的激素釋放，在多名志愿者中考慮了飲食、睡眠、病史、精神狀態(tài)、情緒等情況，經(jīng)綜合考量，最后優(yōu)選了4名志愿者作為本研究的對(duì)象。其中，志愿者1，男性，年齡60歲，身體情況接近理想健康狀態(tài)，無任何不適癥狀，采用輕柔溫補(bǔ)手法推拿心經(jīng)和肺經(jīng)；志愿者2，女性，年齡28歲，主要為肝膽火旺，推拿肝經(jīng)和膽經(jīng)；志愿者3，女性，年齡35歲，主要為心脾陽虛，自感肩膀僵痛，胸悶氣短，久坐腰疼，推拿脾經(jīng)和心經(jīng)；志愿者4，女性，年齡28歲，主要為心脾陽虛，寒濕厚重，推拿心經(jīng)、脾經(jīng)和胃經(jīng)。中醫(yī)診斷志愿者的病癥狀態(tài)由3位中醫(yī)醫(yī)生做出。

志愿者經(jīng)過西醫(yī)體檢后發(fā)現(xiàn)身體各項(xiàng)指標(biāo)正常，屬于健康志愿者。推拿前，志愿者維持正常作息、飲食及工作量，沒有經(jīng)過特殊護(hù)理。實(shí)驗(yàn)前3 h內(nèi)不進(jìn)飲食，以免因食物不同而干擾呼出氣體檢測。實(shí)驗(yàn)前1 h結(jié)束工作，充分休息后記錄志愿者的呼出氣體質(zhì)譜指紋譜圖。接受30 min專業(yè)中醫(yī)推拿治療，再采集中醫(yī)推拿治療后志愿者的呼出氣體指紋譜圖，直接進(jìn)行EESI-MS分析。

2.3 EESI-MS分析

2.3.1分析步驟中醫(yī)推拿醫(yī)生首先對(duì)志愿者進(jìn)行中醫(yī)診斷(望、聞、問、切)，詳細(xì)了解志愿者的身體狀況，根據(jù)診斷結(jié)果，針對(duì)性地對(duì)志愿者進(jìn)行穴位或經(jīng)絡(luò)方面的中醫(yī)推拿調(diào)理。設(shè)置儀器參數(shù)，由志愿者口含一根特氟龍管直接吹氣，引入EESI離子源進(jìn)入質(zhì)譜儀檢測，吹氣流速通過玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)控制在800 mL/min，吹氣時(shí)間保持30 s。每測完一個(gè)志愿者，更換新的特氟龍管路，并用高純氮?dú)膺M(jìn)行沖洗。最后，利用Simca軟件對(duì)獲得的EESI-Orbitrap-MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA分析。

圖1 電噴霧萃取電離質(zhì)譜分析呼出氣體實(shí)驗(yàn)示意圖Fig.1 Schematic diagram of extractive electrospray ionization-mass spectrometry (EESI-MS) for exhaled breath analysis

2.3.2質(zhì)譜條件正離子檢測模式，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1000，噴霧電壓4.0 kV，離子傳輸管溫度200℃，毛細(xì)管電壓35 V， 透鏡電壓110 V。EESI離子源： 2個(gè)噴頭毛細(xì)管噴霧尖端距離1～2 mm； 夾角120°； 質(zhì)譜進(jìn)樣錐口的距離0.5 cm；如圖1所示，詳細(xì)參見文獻(xiàn)[24,25]。萃取劑：甲醇，萃取劑流速： 8 μL/min； 鞘氣流速： 5 arb； 呼出氣體流速： 800 mL/min。 其它條件由LTQ Orbitrap XL系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化。

3 結(jié)果與討論

3.1 EESI-MS分析中醫(yī)推拿前志愿者呼出氣體

圖2 EESI-MS分析中醫(yī)推拿前、后志愿者呼出氣體指紋譜圖： A 志愿者1前； B 志愿者1后； C 志愿者2前； D 志愿者2后； E 志愿者3前； F 志愿者3后； G 志愿者4前； H 志愿者4后Fig.2 EESI-MS spectra of exhaled breath of volunteers before and after receiving Traditional Chinese Medicine massage: (A) volunteer 1 before； (B) volunteer 1 after； (C) volunteer 2 before； (D) volunteer 2 after； (E) volunteer 3 before； (F) volunteer 3 after； (G) volunteer 4 before； (H) volunteer 4 after

呼出氣體可能具有復(fù)雜的分子組成，而各分子種類與含量的差異構(gòu)成了該樣品的分子指紋。本研究對(duì)4位志愿者接受中醫(yī)推拿前呼出氣體進(jìn)行EESI-MS分析，獲得具有豐富的質(zhì)譜信號(hào)的一級(jí)指紋譜圖(圖2A,C,E,G)。 通過對(duì)比圖2中A、C、E、G發(fā)現(xiàn)，不同志愿者呼出氣體的指紋譜圖存在差別，這可能與志愿者不同的身體狀態(tài)和健康狀態(tài)有關(guān)。采用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，發(fā)現(xiàn)志愿者1明顯區(qū)分于其他3名志愿者(圖3)。實(shí)際上，志愿者1經(jīng)過中醫(yī)診斷為接近理想的健康狀態(tài)，沒有氣滯血瘀或陰陽失衡方面的問題。這與圖3反映的數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。志愿者2、3和4的PLS-DA分析結(jié)果有部分重疊，這主要因?yàn)槠湓谥嗅t(yī)診斷中均存在不同程度的病癥，而且志愿者3和4同時(shí)表現(xiàn)心脾陽虛，故而其呼出氣體的譜圖重疊更加明顯。這些結(jié)果表明，EESI-MS分析結(jié)合PLS-DA處理數(shù)據(jù)可以獲得呼出氣體中多種組分信息，并且根據(jù)這些信息可進(jìn)行生理/病理狀態(tài)歸類。

圖3 中醫(yī)推拿前4位志愿者呼出氣體PLS-DA 分析三維得分圖Fig.3 Partial least squares discrimination analysis (PLS-DA) score plots for 4 volunteers before receiving Traditional Chinese Medicine massage

3.2 EESI-MS分析中醫(yī)推拿后志愿者呼出氣體

4位志愿者分別接受30 min中醫(yī)推拿治療后，采用EESI-MS直接對(duì)其呼出氣體進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得的指紋譜圖如圖2B，D F H所示。對(duì)比經(jīng)過中醫(yī)推拿前(圖2A， C， E， G)后(圖2B， D， F， H)志愿者呼出氣體指紋譜圖發(fā)現(xiàn)，所有志愿者呼出氣體的質(zhì)譜指紋譜圖在推拿前后均發(fā)生了變化。如，經(jīng)過輕柔溫補(bǔ)手法推拿心經(jīng)和肺經(jīng)后，志愿者1自我感覺更加輕松有活力，而呼出氣體指紋譜圖(圖2B)較治療前(圖2A)具有顯著差異，如推拿后m/z108.6944和m/z83.0516譜峰強(qiáng)度較推拿前顯著降低； 其它信號(hào)峰，如m/z149.0504、m/z184.0889、m/z167.0620、m/z173.0845、m/z205.0935、m/z217.1166、m/z241.0834、m/z261.1417、m/z189.0406等質(zhì)譜峰的信號(hào)強(qiáng)度也發(fā)生了變化。志愿者2主要為肝膽火旺，自感平時(shí)多口干舌燥，經(jīng)過中醫(yī)推拿后感覺良好，口干舌燥情況立即得到顯著緩解；志愿者3經(jīng)過推拿脾經(jīng)和心經(jīng)后，無肩膀僵痛和胸悶氣短癥狀。志愿者4通過推拿心經(jīng)、脾經(jīng)和胃經(jīng)后，自感神清氣爽，渾身輕松，狀態(tài)良好。對(duì)比發(fā)現(xiàn)志愿者2、志愿者3和志愿者4經(jīng)過中醫(yī)推拿前后呼出氣體中的質(zhì)譜信號(hào)峰強(qiáng)度也存在變化。在EESI-MS呼出氣體的質(zhì)譜指紋譜圖中可以反映出這些變化，但是經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后，變得更加清晰(圖3)。

3.3 偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)

圖4 中醫(yī)推拿前后4位志愿者呼出氣體PLS-DA 分析三維得分圖。A，志愿者1；B，志愿者1和2；C，志愿者1，2和3；D，所有志愿者。Fig.4 Three dimensional PLS-DA score plots for 4 volunteers before and after receiving Traditional Chinese Medicine massage. (A) Volunteer 1; (B) Volunteer 1, 2; (C) Volunteer 1, 2, and 3; (D) All the four volunteers.

本研究采用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)處理數(shù)據(jù)，對(duì)比不同志愿者呼出氣體中醫(yī)推拿前后呼吸氣體中代謝產(chǎn)物的變化。分別選取志愿者20次中醫(yī)推拿前后的呼出氣體質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA分析，結(jié)果表明，PLS-DA方法可以有效區(qū)分4名志愿者中醫(yī)推拿前后的呼出氣體(圖4)。在圖4A中，志愿者1在中醫(yī)推拿前、后呼出氣體的指紋譜圖發(fā)生了顯著的變化，其中m/z184.0889、m/z108.6944、m/z83.0516、m/z149.0504、m/z167.0620、m/z205.0935等差異顯著。在PLS-DA分析結(jié)果中，VIP值反映了各個(gè)質(zhì)荷比對(duì)樣品區(qū)分的貢獻(xiàn)，VIP值>1.0的物質(zhì)對(duì)區(qū)分貢獻(xiàn)較大。經(jīng)過精確質(zhì)量分析發(fā)現(xiàn)，m/z184.0889對(duì)應(yīng)的物質(zhì)可能是腎上腺素(偏差≤20 ppm)。腎上腺素是一種具有重要生理功能的激素，能夠直接作用于腎上腺素能α、β受體，產(chǎn)生強(qiáng)烈快速而短暫的興奮α和β型效應(yīng)，對(duì)心臟β1-受體的興奮，可使心肌收縮力增強(qiáng)，心率加快，心肌耗氧量增加；同時(shí)作用于血管平滑肌β2-受體，使血管擴(kuò)張，松弛支氣管平滑肌，擴(kuò)張支氣管，解除支氣管痙攣，降低周圍血管阻力而減低舒張壓。這些效應(yīng)與志愿者1自感評(píng)價(jià)一致。類似地，質(zhì)譜峰m/z184.0889在其他志愿者推拿后的呼出氣體中都有檢出，雖然濃度差異較大，可能與志愿者各自的身體健康差異與中醫(yī)推拿的穴位或經(jīng)絡(luò)部位不同有關(guān)。目前的初步結(jié)果預(yù)示腎上腺素可作為評(píng)價(jià)推拿療效的重要物質(zhì)之一。

類似地，志愿者2、3和4的呼出氣體在接受中醫(yī)推拿前后均發(fā)生了顯著變化，他們的得分圖即使與志愿者1的得分圖疊加在一起仍然可清晰地區(qū)分，分別如圖4B、4C和4D所示。在志愿者2的呼出氣體中，m/z75.5626、m/z184.0896、m/z217.1228、m/z167.0615等成分存在顯著性差異；在志愿者3的呼出氣體中，m/z223.0716、m/z163.1406、m/z151.1066、m/z205.0935等成分存在顯著性差異；在志愿者4的呼出氣體中，m/z283.8838、m/z217.1228、m/z205.0933等成分存在顯著性差異。通過高分辨質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，這些物質(zhì)，如m/z167.0615(3-(3-羥基苯基)丙酸)、m/z205.0933(L-色氨酸)、m/z223.0716(L-胱硫醚)最有可能存在于呼出氣體中。中醫(yī)推拿對(duì)志愿者的新陳代謝產(chǎn)生了影響，呼出氣體可反映代謝產(chǎn)物的變化，EESI-MS呼出氣體分析平臺(tái)可從分子層次上揭示這些代謝物的變化。

4 結(jié) 論

采用電噴霧萃取電離質(zhì)譜(EESI-MS)直接分析了志愿者推拿治療前后的呼出氣體樣品，并對(duì)比了不同的志愿者呼出氣體指紋譜圖。初步研究結(jié)果表明，志愿者呼出氣體中的腎上腺素、氨基酸等物質(zhì)有顯著變化，意味著中醫(yī)推拿影響了志愿者新陳代謝過程，從而造成了人體呼出氣體代謝產(chǎn)物的變化。呼出氣體的EESI-MS質(zhì)譜分析可獲得呼吸氣體樣品物質(zhì)指紋譜圖，并可通過高分辨質(zhì)譜分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，有望作為跟蹤中醫(yī)推拿引起的代謝組學(xué)變化的有效工具。

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