草莓根腐病的病原菌分離鑒定及拮抗菌CM3的抑制作用研究

陳哲 黃靜 趙佳 郝耀山 梁宏

（山西省農業(yè)科學院生物技術研究中心，太原 030031）

草莓是全世界范圍內種植的最重要的水果作物之一。近年來，我國的草莓產業(yè)發(fā)展十分迅速，隨之而來的就是草莓病害，尤其是連續(xù)種植所帶來的土傳病害，對草莓產量影響大，嚴重時幾乎絕產［1］。草莓根腐病是一類土傳根部病害的統(tǒng)稱，可以導致嚴重的經濟損失。從草莓根腐病的患病根部可以分離出多達20個屬的真菌，包括鐮刀菌屬（Fusariumsp.）、 炭 疽 菌 屬（Colletotrichumsp.）、 絲 核 菌 屬（Rhizoctoniasp.）、疫霉菌屬（Phytophthorasp.）和擬盤多毛孢菌屬（Pestalotiopsissp.）等［2-3］。由于病原菌多種多樣，防治根腐病就是一個難以解決問題，至今沒有強有效的方法手段。傳統(tǒng)的土壤輪作方法已被證明能有效的控制許多土傳疾病，但這種方法很難適應集約化種植系統(tǒng)；而化學試劑熏蒸的方法出于人類健康及環(huán)境的考慮，也逐漸被取代。因此，以微生物制劑為主的生物防治方法將會成為預防草莓根腐病的一種常見手段［4-5］。

目前報道過的根腐病生防菌包括芽孢桿菌（Bacillus）［6］、 木 霉 菌（Trichoderma）［7］、 鏈 霉 菌（Streptomyces）［8］等，梁銀等［9］研究發(fā)現利用生防菌與有機肥復配制成生物有機肥，既可以提高土壤肥力，又可以調節(jié)土壤微生物區(qū)系，減少病原菌數量。越來越多的人將目光聚焦到生防菌的開發(fā)利用，具有拮抗功能的菌種資源越豐富，挑選出優(yōu)良菌株的幾率也就越大，而且隨著研究的發(fā)展，人們更愿意篩選具有多種作用的功能性菌株去制備菌劑，例如同時具備抗病和促生兩種作用的菌株［10］。

本文針對當地溫室常見的草莓根腐病，從發(fā)病草莓根部中分離出兩株病原菌-尖孢鐮刀菌，并研究前期篩選到的解淀粉芽孢桿菌CM3［11-12］對此病原菌的抑制作用，同時通過盆栽實驗探索菌株CM3對根腐病的防治效果，旨在為草莓根腐病的防治提供菌種資源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 供試拮抗菌CM3由山西省農業(yè)科學院生物技術研究中心微生物課題組自行鑒定并保存。供試病原真菌炭疽病菌、灰霉病菌、西瓜枯萎病菌、西葫蘆枯萎病菌、西葫蘆根腐病菌由山西省農業(yè)科學院生物技術研究中心微生物課題組保存。1.1.2 培 養(yǎng) 基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15-20 g，自來水 1 000 mL，自然pH。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離鑒定

1.2.1.1 病原菌的分離 將發(fā)病草莓植株的根部洗凈，瀝干水分備用。在超凈臺內選取帶有病健交界處的根部，在病變組織處用手術刀切取長度約為5 mm 的根段，用 75%的酒精浸 30 s，再用 0.1%升汞水溶液處理 3-5 min，而后用無菌水沖洗 3 次，置于PDA培養(yǎng)基中，28℃條件下培養(yǎng) 3-4 d；菌落直徑約為 1 cm 時，在無菌的條件下用消毒的接種鉤挑取菌落邊緣的菌絲體，再次接到 PDA 培養(yǎng)基中央，進行多次的分離純化，直至菌落生長整齊一致沒有雜菌出現。

1.2.1.2 病原菌的鑒定 形態(tài)鑒定：將分離菌株接種在PDA平板上 25℃ 下培養(yǎng)，觀察氣生菌絲生長狀況、菌落顏色和質地，是否產生孢子和菌核等培養(yǎng)性狀。分子生物學鑒定：將分離純化到的菌株進 行 18S rDNA、EF-1α（Translation elongation factor 1 alpha）、IGS（Nuclear ribosomal intergenic spacer region）和 mtSSU（Mitochondrial small subunit）基因序列測序，其中18S rDNA鑒定是真菌鑒定中常用的方法，后三者則都是鐮刀菌分類鑒定中常用基因手段［13-14］。測序后獲得的DNA序列在 NCBI 網站用Blast 進行序列比對分析，最后使用軟件 MEGA 6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 解淀粉芽孢桿菌CM3對尖刀鐮孢菌的抑制作用研究

1.2.2.1 解淀粉芽孢桿菌CM3的抑菌譜測定 采用平板對峙法，在 PDA 平板中心接種直徑為 8 mm的病原菌（包括分離的根腐病病菌FC2016-3和FC2016-7、草莓炭疽病菌、草莓灰霉病菌、西瓜枯萎病菌、西葫蘆枯萎病菌和西葫蘆根腐病菌），在距菌塊 3 cm 處接種菌株CM3，對照為只接種病原菌的平板，28℃ 培養(yǎng) 3-5 d，重復3次，觀察實驗結果。1.2.2.2 解淀粉芽孢桿菌CM3對尖刀鐮孢菌的預防效果 選擇草莓進行盆栽防治實驗。盆栽實驗使用無菌土，將蛭石和土以 1∶1 比例（w∶w）混合，160℃ 干熱滅菌5 h。選取生長一致的草莓匍匐莖幼苗，移栽于處理好的營養(yǎng)缽（10 cm×10 cm）中，緩苗 15 d 后，對幼苗進行刀片傷根處理（同時設置無傷處理），然后開始進行實驗［15］。

實驗設置4個處理組，處理組1：接種拮抗菌CM3（濃度為1×108CFU/mL），48 h后接種病原菌孢子懸液（濃度為1×106CFU/mL）。處理組2：接種病原菌孢子懸液（濃度為1×106CFU/mL），48 h后接種拮抗菌CM3（濃度為1×108CFU/mL）。處理組3：只接種病原菌孢子懸液（濃度為1×106個/mL）。處理組4：只接種拮抗菌CM3（濃度為1×108CFU/mL）。處理組5：同樣量的無菌水。每組10株草莓苗，重復3次。

移栽后對每種作物進行正常的栽培管理，10 d后開始進行病害觀察，30 d后進行病害調查以及指標檢測。檢測指標包括病情指數和防治效果，還有植株的株高、葉片面積、葉柄長和鮮重，其中葉片面積和葉柄長度統(tǒng)計選擇草莓心葉外第三片葉子。

草莓根腐病發(fā)病程度參考Vestberg等［16］的方法，分為6級：0級為根系未發(fā)病；1級為根系發(fā)病率≤30%，葉片正常；2級為30%＜ 根系發(fā)病率 ≤60%，葉片正常；3級為60%＜ 根系發(fā)病率≤80%，葉片變黃；4級為根系發(fā)病率 80%以上，葉片枯萎；5級為整株死亡，葉片干枯。

病情指數計算公式為：

病情指數（DSI）=100×∑（病害的級別 × 該級別的植株數）/（總株數 × 病害的最高級別）

防治效果 = 100% ×（對照發(fā)病指數-處理發(fā)病指數）/對照發(fā)病指數

2 結果

2.1 草莓根腐病的病原菌分離與鑒定

2.1.1 病原菌分離及形態(tài)鑒定 在發(fā)病草莓的根部（圖1）分離純化到了2株病原菌，將其命名為FC2016-3和 FC2016-7。菌株FC2016-3 在 28℃ 的PDA 培養(yǎng)基上，菌落為白色，平均日生長量為12 mm，氣生菌細絲絨毛狀，為白色，培養(yǎng)基不變色（圖2-A、B）。菌株FC2016-7，菌落為白色，中心處漸漸變?yōu)樽仙?，平均日生長量為11 mm，氣生菌絲絮狀茂密，培養(yǎng)基背面會變深紫色（圖2-C、D）。

圖1 發(fā)病草莓根部橫切圖

2.1.2 病原菌分子鑒定 菌株FC2016-3和FC2016-7的 18S rDNA、EF-1α、IGS和 mtSSU 基因序列在GenBank 數據庫GenBank 中分別進行比對發(fā)現，兩個菌株與尖孢鐮刀菌的基因序列同源性都達 99%以上，說明分離到的菌株FC2016-3和FC2016-7均為尖孢鐮刀菌。每個基因序列分別構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3-圖6）。

圖2 菌株FC2016-3和FC2016-7在PDA培養(yǎng)基上生長狀態(tài)

2.2 解淀粉芽孢桿菌CM3對根腐病病原菌的抑制作用

菌株CM3對于根腐病病原菌的抑菌效果見圖7，明顯看出CM3對多種常見的土傳病害均有良好的效果，尤其是對草莓和瓜類的病害。同時，針對灰霉病這種既可以通過土壤傳播又可以通過水、空氣等途徑傳播的病害，菌株CM3同樣有抑制作用。說明菌株CM3不僅能防治土壤中的病害，還能制備成噴施微生物制劑進行病害防治。

2.3 解淀粉芽孢桿菌CM3對根腐病的防治效果

根據分離病原菌的出現頻率及生長狀態(tài)，選擇病原菌FC2016-7進行盆栽防治實驗，在接種7 d后草莓葉片邊緣開始變色，15 d地上莖部開始變色，逐漸干枯，30 d后地上植株完全干枯。此時將草莓根部小心撥出，洗去附著在根系的泥土，發(fā)現有70%的根系完全變黑，剩余沒有完全變黑的根上存在黑褐色的病斑；切開根莖部發(fā)現其內部變色明顯（圖8），與健康根部比較幾乎全部變色，有1/3的部分已經變成了深紅褐色，病情與在大田中發(fā)現的病株一致。對此病根進行分離，仍可分離出病原菌FC2016-7。

圖3 根據2株病原菌18S rDNA基因序列同源性構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 根據2株病原菌EF-1α基因序列同源性構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 根據2株病原菌IGS基因序列同源性構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

從表1中看出，尖孢鐮刀菌FC2016-7對于草莓的致病性較強，處理組3的病情指數達到了58.57%，各項指標均顯著低于對照水平。先接種病原菌后接種CM3的處理組1的病情指數為44.33%，防治效果達到了37.14%，但是植株生長狀態(tài)明顯受到了抑制，各項指標均低于對照組，但是仍好于只接種病原菌的處理組3；而先接種CM3后接種病原菌的處理組2，病情指數則降低到了26.09%，防治效果可以達到64.86%，草莓的生長狀態(tài)要優(yōu)于處理1，幾乎和對照組持平。說明只要預先用菌株CM3對栽培基質進行處理，就能夠達到預防病原菌FC2016-7的效果，否則會影響其防治效果。

圖6 根據2株病原菌mtSSU基因序列同源性構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖7 拮抗菌CM3對多種病原菌的抑制效果

圖8 盆栽實驗草莓根部圖

從促進生長的角度來看，只用菌株CM3處理的處理組4可以促進草莓生長。株高、根部鮮重和地上鮮重比對照組有顯著提高，分別提高了17.51%、16.08%、9.06%；葉柄長度和葉面積的增加則不顯著。說明解淀粉芽孢桿菌CM3不僅有防治病原菌的能力，還有一定的促生長能力，十分適合作為微生物制劑進行開發(fā)利用。

表1 解淀粉芽孢桿菌CM3對尖刀鐮孢菌FC2016-7的防治效果及生長影響

3 討論

研究植物病害首先就要進行病原菌的分離鑒定，使用分子技術對病原菌進行鑒定已經成為一種常用、快速、靈敏且準確可靠的手段［17-18］。本研究根據2個菌株的18S rDNA、EF-1α、IGS和mtSSU 4個基因序列的分析結果，再結合病原菌的形態(tài)特征，將分離到的菌株 FC2016-3和FC2016-7 確定為尖孢鐮刀菌，結果準確可信。盆栽實驗顯示，菌株FC2016-7的致病性較強，發(fā)病率能夠達到80%，病情指數也高達58.57%。張陽等［19］從草莓根腐病株中分離到41個菌株，通過形態(tài)學、分子生物學手段對菌株的分類地位進行了鑒定發(fā)現，尖孢鐮刀菌占菌株總量的9.75%，并且其致病力較強，可達90%。比較蛋白質組學分析發(fā)現［20］，不同毒力的尖孢鐮刀菌株的蛋白質組是有顯著性差異的，部分蛋白僅僅存在于高毒力菌株中，還有一些蛋白質在高毒力菌株中的含量較高，這些蛋白質主要與菌株的代謝、抗氧化、電子傳遞、細胞周期和轉錄活動有關。

解淀粉芽孢桿菌CM3本實驗室在前期研究中篩選到的一株有抑菌效果的菌株，可以有效的預防草莓灰霉病和番茄灰霉病的發(fā)生，抑菌成分有穩(wěn)定的性能及較強的環(huán)境適應性。本研究發(fā)現菌株CM3同樣可以抑制土傳病害的病原菌，如根腐病、枯萎病和炭疽??；盆栽實驗也顯示其能夠有效的防治尖孢鐮刀菌引起的根腐病的發(fā)生，防治效果達到了64.86%，而且越早加入，防治的效果會越好；同時也發(fā)現菌株CM3可以促進草莓植株的生長發(fā)育，株高、根鮮重以及地上鮮重分別提高了17.51%、16.08%、9.06%。Shen等［4］證實吸水鏈霉菌BOF-B04可以顯著增加草莓植物的鮮重并且降低根腐病的發(fā)生率，盆栽防治效果達到了63.35%；同時菌株也改變了微生物根際土壤的群落結構，土壤中的真菌數量顯著減少，比對照組降低了82.43%。

在整個植物發(fā)育階段，由于土壤環(huán)境的復雜性，只具有單一功能的微生物已經無法滿足實際生產的需求，所以許多學者開始關注具有多種功能的有益微生物。這類微生物會產生抗生素，通過與病原菌競爭營養(yǎng)物質或誘導宿主植物的系統(tǒng)性抗性來抵抗病原菌；還可能生產植物激素，通過促進植物根部對養(yǎng)分的吸收而達到促進植物生長的能力［21］。Mukta等［22］發(fā)現兩株植物益生菌鏈霉菌StenotrophomonasBph-4和蒼白桿菌OchrobacterumBTLK6a均可以顯著增加草莓果實產量，與對照組相比分別增加了56%和43%，進一步研究揭示了它們不僅可以分泌生長激素吲哚乙酸，同時也能分析抗生素抑制致病微生物的生長。梁曉琳等［23］將Bacillus amyloliquefaciensSQR9制成了復合微生物肥料進行實驗發(fā)現，復合微生物肥料集化肥速效、有機肥長效和生物肥增效等優(yōu)勢為一體，能明顯促進番茄的生長，在總養(yǎng)分 100 g/kg和140 g/kg 施肥水平下，番茄增產幅度分別達 37.73% 和 44.77%。

本實驗中解淀粉芽孢桿菌 CM3不僅可以防治草莓根腐病的發(fā)生，也促進了草莓植株的生長，綜合前期研究積累，可以說菌株CM3是一株多功能微生物菌株，滿足了開發(fā)微生物制劑的條件，可以將其應用于草莓土傳病害的生物防治中。若能將其開發(fā)成新型微生物復合肥料，不僅可以提供作物生長所需的全面營養(yǎng)，促進植物生長，提高其抗逆性，免受病原菌的侵害，還能改善土壤結構，增加肥力，改善農產品的品質，提高產量。同時，能達到減少化肥用量，保護生態(tài)環(huán)境的效果。

4 結論

本研究從草莓根腐病根部分離到了2株病原菌，根據 18S rDNA、EF-1α、IGS和 mtSSU 4個基因序列的分析結果和菌株形態(tài)特征，將這兩株菌株鑒定為尖孢鐮刀菌，分別命名為FC2016-3和FC2016-7。解淀粉芽孢桿菌CM3對菌株FC2016-3和FC2016-3在內的多株土傳病害病原菌有明顯的抑制作用。盆栽實驗結果顯示，菌株CM3對尖孢鐮刀菌FC2016-7引起的草莓根腐病有良好的生物防治效果，防治效果分別為64.86%，同時也發(fā)現菌株CM3可以促進草莓植株的生長發(fā)育，株高、根鮮重以及地上鮮重分別提高了17.51%、16.08%、9.06%。

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