水稻與稻瘟病菌相互作用研究進(jìn)展

韓藝娟 魯國東

（福建農(nóng)林大學(xué) 生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

作為一種主要糧食作物，水稻面臨著多種病害的危害，如病原真菌引起的稻瘟病和紋枯病、細(xì)菌引起的白葉枯病、病毒引起的水稻黑條矮縮病和水稻條紋葉枯病、線蟲引起的稻根結(jié)線蟲病等。這其中，稻瘟病菌Magnaporthe oryzae（syn.Pyricularia oryzae）引起的稻瘟病為世界性水稻主要病害。除此之外，稻瘟病菌還可侵害其他多種禾本科作物，每年都造成大量損失［1-2］。稻瘟病菌作為一種重要的植物病原物，除了因經(jīng)濟(jì)重要性受重視外，還因易于開展遺傳分析，近年來逐漸成為研究絲狀真菌生長發(fā)育的重要模式生物之一［3-6］。同時(shí)，稻瘟病菌與水稻的互作也成為研究植物病原真菌-寄主互作較為理想的模式系統(tǒng)之一［4-7］。本文綜述了近年來水稻與稻瘟病菌相互作用的分子模式，以期為水稻抗稻瘟病育種研究提供借鑒。

1 PMAPs介導(dǎo)的水稻PTI免疫反應(yīng)

植物在自然界中可為其他病原微生物提供營養(yǎng)來源，并受到一定的脅迫。在與病原微生物互作的進(jìn)化過程中，植物不斷產(chǎn)生一些復(fù)雜的免疫應(yīng)答反應(yīng)來抵御病原微生物的侵害。植物體內(nèi)存在兩種層次防御反應(yīng)，分別為病原菌相關(guān)模式（Pathogen associated molecular pattern，PAMP）誘發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP-triggered immunity，PTI）和效應(yīng)因子誘發(fā)的免疫反應(yīng)（Effector-triggered immunity，ETI），二者在抵御病害過程中起重要作用。PAMP是一類具保守特征的小分子物質(zhì)（如細(xì)菌的鞭毛蛋白短肽flg22、內(nèi)毒素脂多糖、真菌鞘脂及幾丁質(zhì)等），可為植物模式受體（Pattern recognition receptor，PRR）（如FLS2和EFR蛋白）識(shí)別，引發(fā)PTI反應(yīng)［8-9］，如MAPK信號(hào)途徑的激活以及活性氧爆發(fā)、胼胝質(zhì)積累等防御現(xiàn)象［10］。除了PAMPs之外，病菌編碼的一些分泌蛋白也能誘發(fā)PTI反應(yīng)，即激發(fā)子（Elicitor）。傳統(tǒng)定義上來講，“激發(fā)子”是指能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生植保素的一些分子。隨著科技的發(fā)展，這個(gè)名詞所適用的范圍更廣，如今多指能刺激植物防御的所有物質(zhì)，包括來源于病原菌（外源性激發(fā)子）以及在侵染過程中植物自身產(chǎn)生的物質(zhì)（內(nèi)源性激發(fā)子），最終提高植物抗病能力［11-13］。

稻瘟病菌激發(fā)子類型多樣，有糖蛋白［14-15］和脂蛋白等［16］?，F(xiàn)已證實(shí)菌絲細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、分生孢子及菌絲發(fā)酵液中均含有激發(fā)子［17-20］。細(xì)胞膜成分鞘脂類物質(zhì)可誘導(dǎo)水稻合成植保素、細(xì)胞死亡［21-23］。菌絲發(fā)酵液中的 MoHrip1［24］和 MoHrip2蛋白［25］引起煙草細(xì)胞程序性死亡，并且增強(qiáng)水稻免疫力。稻瘟病菌壞死-乙烯誘導(dǎo)蛋白1（Necrosis and ethylene-inducing peptide 1，Nep1）［26］和類 Nep1（Nep1-like proteins，NLPs）蛋白 MoNLP1、MoNLP2、MoNLP4［27］能引起煙草細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞壞死。在對(duì)稻瘟病菌侵染階段的轉(zhuǎn)錄分析中，Chen等［28］篩選到4個(gè)可誘導(dǎo)水稻和煙草組織產(chǎn)生細(xì)胞壞死的稻瘟分泌蛋白（MoCDIP1、MoCDIP2、MoCDIP3和MoCDIP4）。此外，Wang等［29］利用質(zhì)外體流技術(shù)，在發(fā)病水稻質(zhì)外體中分離出多個(gè)稻瘟病菌激發(fā)蛋白。其中，MSP1蛋白引發(fā)植物細(xì)胞壞死反應(yīng)，并提高水稻抵抗稻瘟病能力。稻瘟病菌激發(fā)子基因在植物中的持續(xù)表達(dá)可增強(qiáng)廣譜抗病性，如MgSM1轉(zhuǎn)基因擬南芥、水稻對(duì)細(xì)菌和真菌病菌均有較好的抵抗能力［30-31］。

細(xì)胞壁成分幾丁質(zhì)所介導(dǎo)的PTI信號(hào)途徑研究得較為全面。作為經(jīng)典的PAMP，幾丁質(zhì)可激發(fā)植物防御反應(yīng)，如植保素的合成［32，33］、pH 變化［34］、細(xì)胞膜穩(wěn)定性［33-35］、防御基因誘導(dǎo)表達(dá)［36-37］等方面。然而，并不是所有類型的幾丁質(zhì)都能激發(fā)宿主PTI反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，聚合度6-8的幾丁質(zhì)對(duì)水稻細(xì)胞才有活性，而聚合度小于5的幾丁質(zhì)短鏈不足以引起水稻防御反應(yīng)，并且誘導(dǎo)效應(yīng)隨著聚合度的提高而增強(qiáng)［35，37］。植物細(xì)胞膜上分布著不同的受體蛋白，各司其職，以識(shí)別不同的信號(hào)。蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明了水稻幾丁質(zhì)受體OsCEBiP蛋白可特異結(jié)合幾丁質(zhì)寡糖（GlcNAc）8［38-42］。OsCEBiP為水稻抗病反應(yīng)所需，持續(xù)表達(dá)OsCEBiP基因可提高水稻抗稻瘟病和白葉枯病能力［43］。相反，OsCEBiP基因沉默后，水稻細(xì)胞無法識(shí)別幾丁質(zhì)（GlcNAC）8，最終導(dǎo)致水稻PTI免疫反應(yīng)受抑制，喪失了抗病力［44］。OsCEBiP蛋白編碼兩個(gè)LysM結(jié)構(gòu)域和一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域［44］，但單靠這兩種結(jié)構(gòu)不足以將幾丁質(zhì)信號(hào)由胞外往胞內(nèi)轉(zhuǎn)化。受體激酶OsCERK1則可協(xié)助OsCEBiP完成信號(hào)的轉(zhuǎn)換［45］。在擬南芥中，AtCERK1識(shí)別并結(jié)合幾丁質(zhì)，在抵抗真菌病原菌過程中起關(guān)鍵作用［46-48］。 作 為 AtCERK1的 同 源 蛋 白， 雖 然OsCERK1編碼LysM和磷酸激酶結(jié)構(gòu)域，但并不直接結(jié)合幾丁質(zhì)［49-50］。然而激酶結(jié)構(gòu)域的存在，使胞外幾丁質(zhì)信號(hào)得以向胞內(nèi)轉(zhuǎn)換。OsCERK1為幾丁質(zhì)信號(hào)通路所必需，水稻Oscerk1突變體中幾丁質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)受阻，抗病能力下降［51-53］。

OsRac編碼鳥苷酸三磷酶（GTPase），屬于Rho-GTPase家族，在水稻抵御病原菌過程中起重要作用。OsRacGTPase在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中充當(dāng)分子開關(guān)，調(diào)控多種細(xì)胞生命活動(dòng)。水稻基因組編碼7個(gè)OsRac蛋白，其中OsRac1為關(guān)鍵調(diào)控因子。OsRac1響應(yīng)PAMPs并參與PTI反應(yīng)。當(dāng)幾丁質(zhì)或真菌鞘脂后處理水稻原生質(zhì)體之后，OsRac1快速聚集到細(xì)胞膜上［54-55］。持續(xù)表達(dá)型激活態(tài)（Constitutive active，CA）-OsRac1基因，可誘發(fā)水稻細(xì)胞內(nèi)ROS的爆發(fā)、細(xì)胞凋亡、植保素合成以及相關(guān)防御基因表達(dá)，最終提高了水稻對(duì)稻瘟病的抵抗能力。反之，在水稻中持續(xù)表達(dá)該基因的失活態(tài)（Dominant negative，DN），使OsRac1喪失活性，則抑制了上述的防御反應(yīng)，抵消了水稻抗稻瘟病能力［54］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OsRac1通過兩種途徑來調(diào)控胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的水平。一方面，CA-OsRac1正調(diào)控OsRbohB，與之發(fā)生相互作用后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平迅速提高。累積的Ca2+激活了NADPH氧化酶，使后者不斷產(chǎn)生活性氧ROS［56］。另一方面，OsRac1負(fù)調(diào)控ROS清除相關(guān)基因（比如OsMT2b）的表達(dá)以保證ROS的積累［56-57］，可見OsRac1在調(diào)節(jié)水稻細(xì)胞ROS爆發(fā)以及細(xì)胞死亡過程中起重要作用。此外，水稻與稻瘟病菌非親和互作中，OsRac1為水稻NB-LRR抗病蛋白Pit直接激活［58］，這說明了OsRac1在水稻PTI和ETI反應(yīng)中均起到重要作用。

與Rho家族成員一樣，OsRac1的失活型（GDP結(jié)合型）和激活態(tài)（GTP結(jié)合型）構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)換由鳥苷酸交換因子（Guaninenucleotide Exchanging Factors，GEFs）催化。據(jù)報(bào)道，兩類鳥苷酸交換因子（OsSWAP70A和OsRacGEF1）參與OsRac1蛋白的激活［59-60］。水稻OsSWAP70A和OsRacGEF1分別編碼 Db1（diffuse B-cell lymphoma）-homology（DH）和PRONE（Plant-specific Rac/Rop）類型GEF。這兩個(gè)基因的過表達(dá)均加劇了OsRac1介導(dǎo)的活性氧爆發(fā)，增強(qiáng)了幾丁質(zhì)介導(dǎo)的PTI反應(yīng)和水稻抗稻瘟病菌能力［59-60］。

水稻進(jìn)化出多個(gè)蛋白復(fù)合體來識(shí)別并轉(zhuǎn)化PAMP信號(hào)［59-65］，以實(shí)現(xiàn)幾丁質(zhì)信號(hào)自外向內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)?？偟膩碇v，這些復(fù)合體主要由以下蛋白組成：OsCEBiP-OsCERK1、OsRac1、OsRacGEF1、熱激蛋白Hsp90和Hsp70、分子伴侶Hop/Sti1、支架蛋白OsRACK1、級(jí)聯(lián)反應(yīng)相關(guān)OsMAPK3/OsMAPK6、轉(zhuǎn)錄因子RAI1/Rap2.6等［64-67］。OsRac1參與多個(gè)復(fù)合體的構(gòu)成，在熱激蛋白Hsp90、分子伴侶輔助因子Hop/Sti1和支架蛋白OsRACK1的協(xié)助下，OsRac1與OsRAR1、Hsp90、Hsp70組成復(fù)合體［64-67］。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，在幾丁質(zhì)介導(dǎo)的PTI反應(yīng)中，OsCERK1、Hop/Sti1a、Hsp90、Hsp70和OsRac1以復(fù)合體的形式在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜上執(zhí)行功能。分子伴侶和支架蛋白的存在則有助于承接OsCERK1與OsRac1之間的信號(hào)傳導(dǎo)。

OsRac1和OsCERK1復(fù)合體成員在水稻免疫反應(yīng)中起重要作用。在功能上，OsRAR1與OsRac1相互影響。植物RAR1（for required forMla12resistance）為多個(gè)R基因調(diào)控的抗病反應(yīng)所需，如Mla、RPM1、RPS2、RPS5［68-75］。OsRAR1參 與 水稻抗稻瘟病菌過程，在水稻基礎(chǔ)抗性中也起了重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OsRAR1和Hsp90共同協(xié)助OsRac1調(diào)控稻瘟病菌鞘脂介導(dǎo)的PTI反應(yīng)。持續(xù)表達(dá)CA-OsRac1基因可轉(zhuǎn)錄上調(diào)OsRAR1和OsSGT1（for suppressor of the G2 allele of skp1），引起水稻細(xì)胞ROS爆發(fā)，激活抗病反應(yīng)；OsRac1基因的沉默則抑制了OsRAR1基因的表達(dá)，這說明了OsRac1正向調(diào)控OsRAR1。OsRAR1也可影響OsRac1的功能發(fā)揮，OsRAR1基因的沉默削弱了CA-OsRac1轉(zhuǎn)基因水稻的抗病力?？梢?，這兩個(gè)基因之間存在某種程度的相互調(diào)控作用［64］。另外，分子伴侶輔助因子Hop/Sti1a也參與了幾丁質(zhì)介導(dǎo)的水稻抗病反應(yīng)。過表達(dá)Hop/Sti1a基因明顯提高了水稻對(duì)稻瘟病菌的抵抗能力；該基因的沉默則降低了水稻的抗病能力［63］。作為復(fù)合體中的支架蛋白，OsRACK1同樣參與調(diào)控ROS爆發(fā)和PTI反應(yīng)。過表達(dá)OsRACK1基因明顯提高了水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性［67，76］。

絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與水稻生長發(fā)育與基礎(chǔ)抗病過程。作為MAPK的激酶，活性態(tài)OsMKK4（即OsMKK4-dd）可激活OsMAPK3/OsMAPK6，并且這3個(gè)蛋白均響應(yīng)幾丁質(zhì)處理［77-78］。據(jù)報(bào)道，OsRac1正向調(diào)控OsMAPK3、OsMAPK6與轉(zhuǎn)錄因子OsRAI1。OsRAI1（bHLH transcription factor Rac Immunity 1）參與水稻抵抗稻瘟?。?2］。OsRAI1和OsRac1均可與OsMAPK3、OsMAPK6發(fā)生直接互作，但尚未文章報(bào)道OsRAI1和OsRac1是否發(fā)生互作。在水稻原生質(zhì)體細(xì)胞持續(xù)表達(dá)OsMKK4-dd與OsMAPK3/6后，防御相關(guān)基因OsPAL1、OsWRKY19轉(zhuǎn)錄水平明顯提高［62］。因此OsRac1可能通過OsMAPK3、OsMAPK6來激活OsRAI1，而磷酸化的OsRAI1結(jié)合靶標(biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，以啟動(dòng)相關(guān)防御基因的表達(dá)［26，62］。

總的來講，當(dāng)水稻細(xì)胞尚未感知幾丁質(zhì)時(shí)（即非激活狀態(tài)下），OsCEKR1由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)囊泡運(yùn)輸至細(xì)胞膜，與伴侶蛋白、OsRacGEF1、Hop/Sti1和失活態(tài)的OsRac1組合成一個(gè)蛋白復(fù)合體。當(dāng)膜受體OsCEBiP識(shí)別幾丁質(zhì)之后，OsCERK1立即與之形成二聚體。隨后，OsRacGEF1-OsCERK1-分子伴侶形成的復(fù)合體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜。OsCERK1結(jié)合OsRacGEF1并對(duì)其進(jìn)行磷酸化，后者則進(jìn)一步識(shí)別并激活OsRac1。通過MAPK級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，OsRac1將信號(hào)逐步傳到細(xì)胞核中，激活防御基因表達(dá)，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)（圖 1）［79］。

為了維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，植物進(jìn)化出一些負(fù)調(diào)控因子，來抑制細(xì)胞的過激反應(yīng)。水稻U-box E3連接酶OsSPL11（Spotted leaf11）負(fù)調(diào)控細(xì)胞程序性死亡和免疫反應(yīng)。spl11突變體水稻廣譜抗菌、體內(nèi)防御基因轉(zhuǎn)錄水平和ROS含量偏高［80-82］。后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OsSPL11與GTP酶激活蛋白（GTPaseactivating proteins，GAPs）RhoGAP SPIN6發(fā)生相互作用并將后者進(jìn)行泛素化降解。SPIN6催化小GTP酶OsRac1由GTP結(jié)合態(tài)向GDP結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變，使其失活。SPIN6基因的沉默導(dǎo)致了活性態(tài)OsRac1的積累，激活了OsRac1復(fù)合體中其他基因（如OsSGT1和OsRAR1）轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使得胞內(nèi)活性氧水平劇增，引起細(xì)胞程序性死亡，對(duì)PAMPs（flg22和幾丁質(zhì)）更加敏感，最終提高了水稻對(duì)稻瘟病菌和白葉枯病菌的抵抗力［83］。OsRac1 GEF1催化OsRac1由失活態(tài)向激活態(tài)轉(zhuǎn)化，正向調(diào)控OsRac1介導(dǎo)的水稻免疫反應(yīng)［60］。相比之下，SPIN6則控制活性O(shè)sRac1的積累，防止過度免疫事件的發(fā)生，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定（圖1）。SPIN6對(duì)水稻PTI的影響則助于完善OsRac1復(fù)合體的功能，如SPIN6是否與OsRac1、OsRac1 GEF1相互作用，SPIN6是否與OsCERK1存在功能上的關(guān)聯(lián)等。

圖1 幾丁質(zhì)介導(dǎo)的水稻PTI信號(hào)傳導(dǎo)

2 稻瘟病菌效應(yīng)蛋白的分泌

在由幾丁質(zhì)介導(dǎo)的PTI反應(yīng)中，幾丁質(zhì)短鏈并未進(jìn)入水稻細(xì)胞中，而是通過細(xì)胞膜外受體識(shí)別，進(jìn)而將幾丁質(zhì)信號(hào)由胞外往胞內(nèi)轉(zhuǎn)換。在與宿主相互作用過程中，稻瘟病菌往往通過分泌一系列效應(yīng)蛋白來促進(jìn)在水稻體內(nèi)的增殖。稻瘟病菌的效應(yīng)因子編碼序列呈現(xiàn)多樣化，但是根據(jù)其分泌途徑的差異，效應(yīng)因子可分為兩類［84］：可進(jìn)入植物細(xì)胞的胞質(zhì)型效應(yīng)蛋白（Cytoplasmic effector）［85-87］、不進(jìn)入植物細(xì)胞的質(zhì)外體效應(yīng)蛋白（Apoplastic effectors）［86］。胞質(zhì)型效應(yīng)蛋白主要通過Biotropic Interfacial Complex（BIC）［88］進(jìn)入水稻細(xì)胞中。BIC是一種源自植物細(xì)胞膜的多層膜結(jié)構(gòu)，與初級(jí)侵染菌絲毗鄰。隨著侵染菌絲的擴(kuò)展，BIC結(jié)構(gòu)又轉(zhuǎn)移到接近侵染菌絲頂端的位置。胞質(zhì)型效應(yīng)效應(yīng)蛋白在BIC積累到一定程度后，轉(zhuǎn)運(yùn)到Extrainvasive Hyphal Membrane（EIHM）［88］后再進(jìn)入植物細(xì)胞。這個(gè)過程則需要植物細(xì)胞囊泡運(yùn)輸系統(tǒng)（如Sso1 t-SNARE 和 exocyst 復(fù)合體中的 Exo70、Sec5［84，89］）協(xié)助完成。胞質(zhì)型效應(yīng)蛋白一般在侵染菌絲破壞植物細(xì)胞膜之前就分泌到植物細(xì)胞中，為后續(xù)侵染做準(zhǔn)備，如抑制宿主免疫反應(yīng)。效應(yīng)因子PWL2［88］和AvrPiz-t［90］為典型的胞質(zhì)型分泌蛋白，均可經(jīng)過BIC結(jié)構(gòu)分泌到水稻細(xì)胞中。

與胞質(zhì)型效應(yīng)蛋白相比，質(zhì)外體效應(yīng)蛋白不進(jìn)入宿主細(xì)胞，而是停留或是分散在EIHM膜中，并包圍整個(gè)侵染菌絲。EIHM也是一種源于植物細(xì)胞膜的膜結(jié)構(gòu)［86，88-89］。在侵染早期，這種膜結(jié)構(gòu)可將整個(gè)腫脹侵染菌絲包圍住。這期間質(zhì)外體效應(yīng)蛋白經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體這一傳統(tǒng)分泌途徑進(jìn)入胞外間隔層中［91，88-89］。效應(yīng)因子 BAS4［86，92］和 Slp1［92］為質(zhì)外體型分泌蛋白，并未進(jìn)入水稻細(xì)胞中。

3 稻瘟病菌致病因子介導(dǎo)的水稻抗性反應(yīng)

3.1 效應(yīng)因子介導(dǎo)的水稻ETI、ETS反應(yīng)

幾乎所有的病原菌都帶有PAMPs，然而植物仍然遭受侵染，這說明某些病原菌可以克服植物的PTI。病原菌通過分泌一些效應(yīng)蛋白，繞過宿主的抵御防線，抑制PTI的產(chǎn)生，這個(gè)過程稱為效應(yīng)因子引發(fā)的感病反應(yīng)（Effector Triggered Susceptible reaction，ETS）［93-95］。與此同時(shí)，植物也進(jìn)化出基于R蛋白的第二道防線，直接和間接識(shí)別并結(jié)合病原菌的無毒蛋白（Avr），即效應(yīng)因子激發(fā)的免疫反應(yīng)（Effector-triggered immunity，ETI），主要表現(xiàn)出植物組織強(qiáng)烈的過敏性反應(yīng)［93-95］。ETI反應(yīng)模式符合基因-基因假說［95］，當(dāng)與含相應(yīng)R蛋白的宿主發(fā)生反應(yīng)，由無毒基因編碼或是加工的效應(yīng)蛋白才顯示出無毒的表型，即非親和反應(yīng)。近20年，水稻抗稻瘟病基因和稻瘟病菌無毒基因的克隆工作并駕齊驅(qū)。已克隆的水稻抗病基因普遍含有NBS-LRR結(jié)構(gòu) 域［96］， 如Pib、Pita、Pi-kh（Pi54）、Pid2、Pi9、Piz-t、Pi2、Pi36、Pi37、Pi-km、Pi5、Pi21、Pit、Pid3、Pish、Pik、Pik-p、Pia、Pi25、Pil［97］以及 Pi-CO39［98］、Pi41［99］、Pi55（t）［100］、Pi50（t）［101］等。目前超過10個(gè)稻瘟病菌無毒基因得到克隆與鑒定，如PWL2、AvrPita、Avr-CO39、AvrPiz-t、AVR-Pii、Avr-Pia、AVR-Pik/km/kp［97］和ACE1［102］、AVR-Pikm［103］、AvrPi9［104］、AvrPib［105］。 在 水 稻 與 稻 瘟 病菌的互作過程中，抗病基因與無毒基因之間可產(chǎn)生直接、間接物理相互作用，以啟動(dòng)高級(jí)防御反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，Pita/AvrPita、Pik/AvrPik、Pi-CO39/Avr1-CO-39、Pia/AvrPia［93，106-107］等基因組合可發(fā)生直接互作。以Pita/AvrPita為例，稻瘟病菌無毒基因Avr-Pita編碼的依賴于鋅的金屬蛋白酶，該蛋白的C端亮氨酸富集區(qū)可結(jié)合水稻Pi-ta，并參與稻瘟病菌整個(gè)致病過程。Pi-ta蛋白催化區(qū)域的突變會(huì)減弱二者之間的相互作用，說明Pi-ta很可能是Avr-Pita蛋白的一個(gè)底物［108-109］。相比之下，無毒基因AVR-Pii與水稻抗性基因Pii［91，110］、AvrPiz-t與Piz-t［90，111-113］不直接發(fā)生互作，而是需借助其他蛋白來完成互作。

在AVR-Pii與Pii的互作模式中，二者的成功識(shí)別需要其他水稻基因的參與，如囊泡運(yùn)輸相關(guān)蛋白、氧化還原相關(guān)的酶。AVR-Pii與水稻胞吐相關(guān)蛋白OsExo70-F2、OsExo70-F3發(fā)生直接的物理互作［91，110］。在Pii背景水稻下，對(duì)OsExo70-F3基因進(jìn)行沉默，轉(zhuǎn)基因水稻則喪失了對(duì)AVR-Pii菌株的抵抗能力，但仍對(duì)親和菌株的表現(xiàn)出感病性，這說明了OsExo70-F3特異參與Pii介導(dǎo)的抗病反應(yīng)［91］。此外，蘋果酸酶（NADP-ME 2-3）與AVR-Pii蛋白發(fā)生特異相互作用［110］。NADP-MEs催化氧化脫羧反應(yīng)，將蘋果酸可逆轉(zhuǎn)變成丙酮酸，并伴隨著NADP向NADPH的轉(zhuǎn)化。NADPH是NADPH氧化還原酶的的電子供體，為細(xì)胞防御性氧爆發(fā)的一個(gè)重要源泉［114-115］。在非Pii水稻中，AVR Pii蛋白專一性地抑制OsNADP-ME 2-3的酶活力，阻止水稻細(xì)胞氧爆發(fā)，進(jìn)而抑制水稻免疫防御反應(yīng)［110］。在Pii水稻中，OsNADP-ME 2-3基因的沉默則導(dǎo)致了Pii水稻喪失了對(duì)AVR-Pii稻瘟病菌的抵抗力［110］。綜上，OsExo70-F3和OsNADP-ME 2-3均參與AVR-Pii與Pii介導(dǎo)的稻瘟病菌-水稻的相互作用過程。然而OsExo70-F3和OsNADP-ME 2-3是否與Pii蛋白發(fā)生互作或是形成復(fù)合體則有待于進(jìn)一步研究。

無毒基因AvrPiz-t與抗病基因Piz-t的作用模式需要E3連接酶、轉(zhuǎn)錄因子以及核孔蛋白的參與［90，111-113］。當(dāng)侵染非Piz-t水稻的時(shí)候，稻瘟病菌無毒基因AvrPiz-t執(zhí)行有毒效應(yīng)因子的功能，抑制宿主免疫反應(yīng)。AvrPiz-t轉(zhuǎn)基因水稻中的PTI反應(yīng)受到不同程度的抑制，最終削弱了水稻的抗病性。AvrPiz-t蛋白不與Piz-t直接互作，而是與水稻蛋白APIP6、APIP10、APIP5和 APIP12相互作用（互作模式如圖 2 所示）［90，111-113］。在非Piz-t水稻中，AvrPiz-t通過誘導(dǎo)E3連接酶APIP6、APIP10泛素化降解來阻斷信號(hào)傳導(dǎo)，以抑制水稻PTI免疫反應(yīng)，達(dá)到感病的目的［90，111］。反之，APIP6/10亦可泛素化降解AvrPiz-t。在Piz-t水稻中，APIP10負(fù)調(diào)控Piz-t基因的表達(dá)，使其蛋白產(chǎn)物維持在較低的水平。當(dāng)含有AvrPiz-t的稻瘟病菌侵染水稻后，AvrPiz-t蛋白進(jìn)入水稻細(xì)胞，結(jié)合APIP10蛋白，解除了APIP10對(duì)Piz-t的抑制。隨后，Piz-t蛋白迅速積累，導(dǎo)致HR爆發(fā)，引發(fā)下游抗病反應(yīng)。APIP10基因的沉默導(dǎo)致水稻出現(xiàn)細(xì)胞程序性死亡，同時(shí)誘導(dǎo)Piz-t大量積累，可見AvrPiz-t蛋白通過抑制APIP10來穩(wěn)定Piz-t表達(dá)［111］。

圖2 稻瘟病菌AvrPiz-t與水稻Piz-t介導(dǎo)的ETI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

APIP5編碼一個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子，與AvrPiz-t、Piz-t發(fā)生直接相互作用［112］。APIP5以二聚體的形式進(jìn)入細(xì)胞核中，負(fù)調(diào)控細(xì)胞壞死相關(guān)基因表達(dá)，抑制細(xì)胞程序性死亡。APIP5基因沉默導(dǎo)致了水稻自發(fā)細(xì)胞壞死癥狀，而AvrPiz-t的存在則加劇了壞死癥狀的發(fā)生。在非Piz-t水稻中，AvrPiz-t蛋白可在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合并降解APIP5，進(jìn)而解除了APIP5對(duì)細(xì)胞壞死的抑制，最終誘導(dǎo)稻瘟病菌侵染病斑的形成。在Piz-t水稻中，Piz-t蛋白的存在有利于維持APIP5蛋白的穩(wěn)定性，抑制稻瘟病菌侵染后期壞死斑的形成。反過來，APIP5蛋白亦促進(jìn)Piz-t蛋白的積累，最終激活ETI抗病反應(yīng)［112］。

AvrPiz-t與APIP12的作用模式不同于上述3個(gè)水稻蛋白［113］。APIP12編碼一個(gè)核孔蛋白，與Nup98同源。APIP12蛋白與AvrPiz-t、APIP6發(fā)生直接相互作用。在非Piz-t水稻背景下，APIP12基因的沉默或敲除均抑制了防御相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而降低了水稻對(duì)稻瘟病菌的抵抗力。然而，在Piz-t水稻中對(duì)APIP12進(jìn)行過表達(dá)或沉默，由Piz-t介導(dǎo)的ETI反應(yīng)卻不受影響，可見APIP12主要參與水稻基礎(chǔ)免疫反應(yīng)，該蛋白與AvrPiz-t的互作獨(dú)立于ETI反應(yīng)［113］。

除了無毒基因?qū)λ拗髅庖呦嚓P(guān)基因進(jìn)行修飾之外，病原菌還存在一類非無毒基因的效應(yīng)因子，通過干擾PTI反應(yīng)來抑制宿主抗病能力。植物病原菌編碼的一些核心效應(yīng)因子含LysM結(jié)構(gòu)域效應(yīng)蛋白，在致病過程中起重要作用。幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白番茄葉霉病菌（Cladosporiu fluvum）ECP6［116-117］、稻瘟病菌 Slp1［92］、油菜炭疽病菌（Colletotrichum higginsianum）ChELP1 和 ChELP2［118］蛋白結(jié)構(gòu)保守，功能相似，均可抑制宿主PTI反應(yīng)。稻瘟病菌Slp1與水稻細(xì)胞膜幾丁質(zhì)受體CEBiP蛋白競爭結(jié)合幾丁質(zhì)，以切斷幾丁質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終抑制宿主防御反應(yīng)（圖1）［92］。深入研究發(fā)現(xiàn)，Slp1受多個(gè)稻瘟病菌蛋白調(diào)控。首先內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MoSec62決定了 Slp1的正常分泌［119］。其次，α-1，3-甘露糖轉(zhuǎn)移酶ALG3催化Slp1的糖基化修飾過程，糖基化的Slp1才能抑制宿主PTI反應(yīng)［120］。MoSec62或ALG3基因缺失突變體菌體均可快速激活水稻防御相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄、活性氧爆發(fā)，導(dǎo)致無法順利侵染水稻細(xì)胞，喪失致病能力［119-120］。與Slp1類似，稻瘟病菌分泌蛋白MC69基因的缺失則限制了侵染菌絲的擴(kuò)展，導(dǎo)致稻瘟病菌對(duì)感病水稻和大麥的致病力下降［121］。同樣，西瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）中該同源基因CoMC69的敲除，則削弱了該菌對(duì)黃瓜和本氏煙草的致病力［121］，這說明MC69基因可能在單、雙子葉病原菌中都起著致病的功能。

3.2 非效應(yīng)因子型蛋白介導(dǎo)的水稻感病反應(yīng)

為保證順利侵染水稻，稻瘟病菌通過加固侵染菌絲細(xì)胞壁來避開宿主細(xì)胞的識(shí)別。據(jù)研究，稻瘟病菌細(xì)胞壁成分α-1，3-葡聚糖可干擾水稻防御反應(yīng)，并為病程所需［122］。當(dāng)α-1，3-葡聚糖合成基因MgAGS1發(fā)生缺失或α-1，3-葡聚糖的合成受到抑制，稻瘟病菌絲對(duì)植物幾丁質(zhì)酶的敏感性則明顯提高。MgAGS1的缺失激活了水稻防御相關(guān)基因表達(dá)，導(dǎo)致稻瘟病菌致病力下降。α-1，3-葡聚糖酶可水解α-1，3-葡聚糖，然而水稻基因組尚無該酶的編碼基因。異源表達(dá)細(xì)菌α-1，3-葡聚糖酶編碼基因可激活水稻防御相關(guān)基因表達(dá)，增強(qiáng)水稻廣譜抗病能力。由此可見，α-1，3-葡聚糖可保護(hù)稻瘟病菌細(xì)胞壁，防止被水稻相關(guān)水解酶所降解，以阻止PAMP物質(zhì)的釋放，進(jìn)而抑制宿主PTI的發(fā)生［122］。

PTI和ETI介導(dǎo)的宿主免疫防御反應(yīng)常常伴隨著活性氧的爆發(fā)，稻瘟病菌還可通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞氧化還原環(huán)境來加速侵染過程。稻瘟病菌DES1編碼一個(gè)富含絲氨酸的蛋白，該基因的缺失提高了稻瘟病菌對(duì)過氧化物脅迫的敏感性，并抑制了過氧化物酶和漆酶編碼基因的正常轉(zhuǎn)錄活動(dòng)。在侵染感病水稻初期，DES1缺失突變體可引起水稻細(xì)胞ROS爆發(fā)，同時(shí)也激活了PR防御基因的表達(dá)，使得侵染菌絲擴(kuò)展受限，最終降低了稻瘟病菌的致病性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NADPH氧化還原酶抑制劑DPI可回補(bǔ)des1突變體的致病性［123］。與之類似，谷胱甘肽過氧化物酶編碼基因MoHYR1參與清除體內(nèi)活性氧，維持穩(wěn)定的氧化還原環(huán)境，促進(jìn)稻瘟病菌成功侵染水稻［124］。

除此之外，稻瘟病菌還面臨另外一種脅迫，即一氧化氮（NO）介導(dǎo)的植物氧化反應(yīng)。NO是植物免疫反應(yīng)中的一個(gè)組成部分，與ROS一類化合物相互作用，并衍生出具有高度氧化活性的硝基類化合物，即活性氮（Reactive nitrogen species，RNS）［125］?；钚匝鹾突钚缘勺柚共≡倪M(jìn)一步侵染。然而，稻瘟病菌的一些酶可清除活性氮積累，如氮酸酯單加氧酶NMO。在稻瘟病菌營養(yǎng)生長過程中，NMO2催化硝基烷的脫硝基化反應(yīng)，緩解硝基氧化脅迫給菌體細(xì)胞帶來的脂質(zhì)硝化。NMO2基因的缺失抑制了侵染菌絲的擴(kuò)展，并且引起水稻細(xì)胞氧爆發(fā)。NMO2基因?qū)λ狙趸€原環(huán)境的調(diào)節(jié)也影響了稻瘟病菌效應(yīng)蛋白的分泌，這種情況下效應(yīng)蛋白無法抑制宿主PTI反應(yīng)［126］。然而，提前用DPI處理水稻組織，使水稻細(xì)胞處于還原狀態(tài)，阻止氧爆發(fā)，mno2突變體則可正常地侵染水稻組織。這從側(cè)面反映了，當(dāng)水稻失去活性氧這一抵御防線后，其自身產(chǎn)生的活性氮或是由NO介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)不足以抵抗稻瘟病菌的侵染。在對(duì)抗稻瘟病菌的侵染，水稻細(xì)胞內(nèi)氧化環(huán)境的變化影響到抗病進(jìn)程。以活性氧引起的ROS爆發(fā)起主導(dǎo)作用，而以活性氮引起的RNS起輔助作用，但二者均在水稻抗病過程中起重要作用，缺一不可。稻瘟病菌則通過釋放一系列效應(yīng)蛋白，調(diào)控水稻相關(guān)基因的表達(dá)，阻止抗病信號(hào)的傳導(dǎo)，抑制ROS或是RNS的爆發(fā)，保證菌絲的成功增殖。

4 展望

水稻與稻瘟病菌之間的相互作用是一項(xiàng)持久的“軍事裝備戰(zhàn)”。為抵抗稻瘟病菌的侵害，在自然或是人工選育的條件下，水稻基因組進(jìn)化出一些抗性相關(guān)基因，然而隨著種植年限的延長或其他的氣候因素，稻瘟病菌小種不斷發(fā)生突變以攻克水稻防御體系。這些如此往復(fù)的相互進(jìn)化事件推動(dòng)了水稻-稻瘟病菌相互作用的發(fā)展。近20年來，水稻抗病基因、稻瘟病菌無毒基因的克隆為二者相互作用機(jī)理的解析提供了大量的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但從水稻PTI基礎(chǔ)免疫反應(yīng)到ETI高級(jí)防御體系，這中間包含極其復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)，目前的研究只是掀開了該互作網(wǎng)絡(luò)的一角。為了進(jìn)一步揭示水稻與稻瘟病菌互作的機(jī)理，今后可以從以下幾個(gè)方面開展研究：（1）新型水稻PRR受體的鑒定以及與PAMP的識(shí)別機(jī)制；（2）新型PAMP的發(fā)現(xiàn)，明確它們激發(fā)水稻免疫反應(yīng)的途徑；（3）新的效應(yīng)蛋白和無毒蛋白基因的克隆，解析它們介導(dǎo)水稻感病和抗病反應(yīng)的作用機(jī)理；（4）通過各種組學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步尋找水稻與稻瘟病菌互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白，明確它們的功能。

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