劉國(guó)娟， 劉殿紅， 王 闖， 劉 敏， 徐 寧， 孫曉慧

(聊城職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東聊城 252000)

蘋果(MluspumilaMill)屬薔薇科、仁果亞科蘋果屬，原產(chǎn)歐洲、亞洲，已成為世界四大水果之一[1]。蘋果的生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，風(fēng)味獨(dú)特，耐貯藏，且供應(yīng)周期長(zhǎng)[2]。我國(guó)是世界第一大蘋果生產(chǎn)國(guó)，主要集中在渤海灣、西北黃土高原、黃河故道和西南冷涼高地四大產(chǎn)區(qū)。蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展?fàn)顩r對(duì)果區(qū)經(jīng)濟(jì)振興、市場(chǎng)供應(yīng)和出口創(chuàng)匯影響巨大，在我國(guó)水果業(yè)中占最重要的地位[3]。柱型蘋果是一種新的蘋果品種類型，這類蘋果因其株形類似直立的支柱，而稱為柱型蘋果(columnar apple)，又稱芭蕾蘋果(ballerina apple)[4-5]，這類蘋果品種在田間表現(xiàn)出樹體極緊湊、萌芽率極高和節(jié)間短而粗的特點(diǎn)，非常適于設(shè)施內(nèi)高密栽培[6]。

GA3作為植物內(nèi)源激素，可促進(jìn)植物細(xì)胞伸長(zhǎng)、莖伸長(zhǎng)、葉片擴(kuò)大，加速生長(zhǎng)和發(fā)育，使作物提早成熟，并增加產(chǎn)量或改進(jìn)品質(zhì)[7]；能打破休眠，促進(jìn)發(fā)芽；減少器官脫落，提高果實(shí)的結(jié)實(shí)率或形成無(wú)籽果實(shí)等[8]。GA3最顯著的效應(yīng)是促進(jìn)莖的節(jié)間伸長(zhǎng)，而且效果比生長(zhǎng)素更為顯著，但節(jié)間數(shù)不改變，節(jié)間長(zhǎng)度的增加是由于細(xì)胞伸長(zhǎng)和細(xì)胞分裂的結(jié)果。

對(duì)GA3的生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，它主要通過(guò)增強(qiáng)淀粉酶mRNA合成、膜透性和膜結(jié)合的多聚核糖體增生，促進(jìn)淀粉酶的合成；以及通過(guò)抑制IAA氧化酶或過(guò)氧化酶的活性，促進(jìn)生長(zhǎng)素的生物合成來(lái)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的水平，從而對(duì)植物的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用[9-10]。細(xì)胞壁的松弛是細(xì)胞伸長(zhǎng)所必需的，一般認(rèn)為細(xì)胞壁的松弛是酶促反應(yīng)過(guò)程。在植物細(xì)胞壁的松弛及其他一些需要細(xì)胞伸長(zhǎng)的發(fā)育過(guò)程中，ROS(reactive oxygen species)發(fā)揮著決定性的作用，超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)等是能夠分解ROS的重要抗氧化酶，是植物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)動(dòng)態(tài)平衡的指示劑[11]，許多初級(jí)和次級(jí)代謝發(fā)揮著重要的生理作用，例如清除H2O2參與木質(zhì)化發(fā)育過(guò)程等[12]。

本試驗(yàn)采用柱型蘋果富士×特拉蒙、普通型蘋果嘎拉施加不同濃度外源GA3處理的組培苗為試材，柱型蘋果富士×特拉蒙、普通型蘋果嘎啦為對(duì)照，研究了柱型蘋果、普通型蘋果組培苗施加外源GA3后，蘋果幼苗中SOD、POD和α-淀粉酶含量的變化，初步探討了柱型蘋果和普通型蘋果葉片中氧化酶與外源GA3的關(guān)系，旨在揭示葉片內(nèi)各種酶與GA3的關(guān)系，以及GA3濃度與蘋果組培苗生長(zhǎng)勢(shì)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

特拉蒙×富士柱型蘋果和普通型蘋果嘎拉。

1.2 方法

1.2.1 MS培養(yǎng)基的配制 配制1 L MS培養(yǎng)基：100 mL大量元素(10倍液)+10 mL微量元素(10倍液)+10 mL鐵鹽(100倍液)+10 mL有機(jī)物(100倍液)+10 mL CaCl2(100倍液)+1 mL NAA(1 mg/L)+1 mL 6-BA(0.1 mg/L)置容量瓶中，再加入7 g瓊脂，30 g蔗糖，溶解混勻，先加熱沸騰，再定容至1 L，用0.5 mol/L NaOH調(diào)pH值至5.8～6.2之間，121 ℃下大三角瓶?jī)?nèi)高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2.2 培養(yǎng)基分裝 按試驗(yàn)要求每次吸取75、150、300、600、1 200 μL母液于1 L MS液態(tài)固體培養(yǎng)基中，即可配成含0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L GA3的MS培養(yǎng)基。每1 L MS培養(yǎng)基可分裝20瓶。

1.2.3 培養(yǎng)觀察和取樣 接種完畢后將組培瓶置于26～28 ℃ 的恒溫培養(yǎng)箱中，光照條件下培養(yǎng)，觀察記錄蘋果幼苗發(fā)芽情況、生長(zhǎng)狀況。

1.3 測(cè)定方法

SOD測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法，依據(jù)SOD抑制NBT(氮藍(lán)四唑)在光下的還原程度來(lái)確定SOD活性的大小，活性單位以抑制NBT光化還原的50%為1個(gè)酶活性單位(U)[13]。POD測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[13]；參考李合生的α-淀粉酶活性測(cè)定方法[13]測(cè)定α-淀粉酶的活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源GA3對(duì)柱型蘋果和普通型蘋果表型的影響

2.1.1 外源GA3對(duì)柱型蘋果富士×特拉蒙組培苗表型的影響 柱型蘋果富士×特拉蒙組培苗在不同濃度的GA3上培養(yǎng)16 d后，其組培苗新梢生長(zhǎng)狀態(tài)存在差異(圖1)。GA3在一定濃度內(nèi)，均能促進(jìn)蘋果組培苗新梢的生長(zhǎng)，當(dāng)GA3的濃度為 0～4 mg/L 時(shí)，均能促進(jìn)富士×特拉蒙新梢的生長(zhǎng)。當(dāng)GA3濃度為8 mg/L時(shí)，蘋果組培苗新梢的生長(zhǎng)受到明顯的抑制(圖1-F)，植株株高明顯變矮，節(jié)間變短，但分枝數(shù)量明顯增多。

2.1.2 外源GA3對(duì)普通型蘋果嘎啦組培苗表型的影響 普通型蘋果嘎啦組培苗添加不同濃度的GA3培養(yǎng)16 d后，在一定濃度范圍內(nèi)顯著促進(jìn)蘋果組培苗生長(zhǎng)，當(dāng)超出一定濃度范圍，則抑制其新梢的生長(zhǎng)(圖2)。當(dāng)GA3的濃度為0～2 mg/L 時(shí)，處理均能促進(jìn)普通型蘋果新梢的生長(zhǎng)。隨著GA3濃度的增加，促進(jìn)分枝，但抑制節(jié)間伸長(zhǎng)(圖2-E)。當(dāng)GA3濃度為8 mg/L時(shí)，蘋果組培苗新梢的生長(zhǎng)受到明顯的抑制(圖2-F)。同時(shí)，植株株高明顯變矮，節(jié)間變短，但分枝數(shù)量明顯增多，表現(xiàn)為簇生狀態(tài)。

2.1.3 外源GA3對(duì)柱型和普通型蘋果新梢生長(zhǎng)影響的比較 不同濃度的GA3處理能明顯促進(jìn)柱型蘋果富士×特拉蒙和普通型蘋果嘎啦新梢的生長(zhǎng)，其新梢增長(zhǎng)量均高于對(duì)照(圖3)。但處理16 d后，柱型蘋果對(duì)GA3產(chǎn)生的反應(yīng)較慢，其新梢生長(zhǎng)增加量不明顯(圖3-A)；而普通型蘋果對(duì)GA3反應(yīng)非常敏感，產(chǎn)生的反應(yīng)非?？?，新梢生長(zhǎng)增加量很明顯(圖3-B)。二者不同之處還在于，當(dāng)GA3濃度為4.0 mg/L時(shí)，富士×特拉蒙的新梢增長(zhǎng)量最大，說(shuō)明富士×特拉蒙新梢生長(zhǎng)的GA3最敏感濃度為4.0 mg/L；相對(duì)而言，普通型蘋果嘎啦新梢生長(zhǎng)的GA3最敏感濃度為2.0 mg/L。

2.2 GA3對(duì)蘋果組培苗SOD和POD酶活性的影響

2.2.1 GA3對(duì)柱型蘋果和普通型蘋果組培苗SOD和POD酶活性的影響 GA3處理16 d后，POD活性的變化比較明顯(圖4)。富士×特拉蒙蘋果組培苗節(jié)間的POD含量明顯提高。在0～2.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，隨著GA3濃度的增加，POD活性隨著GA3濃度的提高而增加，當(dāng)GA3濃度為1.0 mg/L時(shí)，POD活性達(dá)到最高，當(dāng)其超過(guò)2.0 mg/L時(shí)，POD活性開始下降，但是仍舊高于對(duì)照的POD活性。而普通型蘋果嘎啦的POD活性變化并不明顯，GA3濃度在0～1.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，隨濃度的增加而提高，1.0 mg/L濃度時(shí)，POD活性達(dá)到最大值，超過(guò)1.0 mg/L逐漸呈下降趨勢(shì)，GA3濃度 8.0 mg/L 時(shí)POD活性降至最低。說(shuō)明外源GA3可以促進(jìn)普通型蘋果組培苗節(jié)間的POD活性，但富士×特拉蒙的POD活性明顯高于普通型蘋果，說(shuō)明POD活性與樹體矮化程度呈正相關(guān)。

此外，GA3處理16 d后，隨著GA3濃度的增加，富士×特拉蒙組培苗的SOD活性明顯下降。在0～2.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，隨著GA3濃度的增加，SOD活性變化不明顯，當(dāng)濃度為1.0 mg/L時(shí)，SOD活性達(dá)到最大。GA3濃度超過(guò)1.0 mg/L時(shí)，其SOD活性明顯下降，在4.0 mg/L時(shí)，SOD活性降至最低，說(shuō)明外源GA3抑制柱型蘋果組培苗節(jié)間SOD的活性，普通型蘋果與柱型蘋果節(jié)間SOD活性大體一致，都是呈下降趨勢(shì)，但是普通型蘋果的SOD活性略高于柱型蘋果。

2.3 GA3對(duì)柱型蘋果和普通型蘋果組培苗α-淀粉酶活性的影響

試驗(yàn)結(jié)果(圖5)表明，GA3處理16 d后，柱型蘋果和普通型蘋果α-淀粉酶活性有明顯的變化，不管是富士×特拉蒙還是嘎啦蘋果組培苗節(jié)間的α-淀粉酶都受GA3的誘導(dǎo)。在0～2.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，隨著GA3濃度的增加，富士×特拉蒙α-淀粉酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，隨后加強(qiáng)，濃度增至2.0 mg/L時(shí)，α-淀粉酶活性達(dá)到最大，隨著濃度的再次增加，α-淀粉酶活性迅速下降，與普通型蘋果相比，柱型蘋果變化很明顯，說(shuō)明2.0 mg/L是GA3促進(jìn)柱型蘋果α-淀粉酶活性的最佳反應(yīng)濃度，普通型蘋果的變化則不那么明顯，在0.5 mg/L時(shí)α-淀粉酶活性達(dá)到最大，隨著濃度的不斷增加，α-淀粉酶活性不斷下降。但在0～2.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，普通型蘋果的α-淀粉酶活性要大于柱型蘋果，說(shuō)明普通型蘋果初期受GA3影響較大。

3 討論

3.1 GA3與SOD和POD的關(guān)系

對(duì)柱型蘋果的研究集中在相關(guān)酶活性和內(nèi)源激素水平的測(cè)定上，本研究發(fā)現(xiàn)具有矮化生長(zhǎng)特性的柱型蘋果富士×特拉蒙POD、SOD酶活性與生長(zhǎng)勢(shì)密切相關(guān)，柱型蘋果葉片內(nèi)的POD、SOD酶活性顯著高于普通型蘋果。外源GA3處理后，不管是柱型蘋果富士×特拉蒙還是普通型蘋果嘎啦，其SOD活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而POD活性則呈上升趨勢(shì)， 這也證明了，POD活性與樹體矮化程度呈顯著正相關(guān)， 酶活性越高，矮化程度越大[14]。

3.2 GA3與α-淀粉酶的關(guān)系

GA3是誘導(dǎo)多種植物一些組織中α-淀粉酶的必要條件，α-淀粉酶為淀粉水解過(guò)程重要的水解酶，現(xiàn)已用α-淀粉酶來(lái)檢測(cè)植物組織中GA的響應(yīng)狀態(tài)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)外源GA3能促進(jìn)柱型蘋果富士×特拉蒙和普通型蘋果嘎啦α-淀粉酶的活性，但在測(cè)定過(guò)程中，柱型蘋果和普通型蘋果組培苗內(nèi)α-淀粉酶不太穩(wěn)定，很可能因?yàn)槊傅男再|(zhì)不穩(wěn)定導(dǎo)致的。

參考文獻(xiàn)：

[1]中華人民共和國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局.中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒[M]. 北京：中國(guó)統(tǒng)計(jì)出版社，2013：451-455.

[2]孟艷玲，汪景彥，康國(guó)棟，等. 我國(guó)蘋果生產(chǎn)現(xiàn)狀分析[J]. 中國(guó)果樹，2007(1)：43-44.

[3]王金政，薛曉敏，路 超. 我國(guó)蘋果生產(chǎn)現(xiàn)狀與發(fā)展對(duì)策[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(6)：117-119.

[4]劉國(guó)娟，劉殿紅，王 闖，等. 柱型和普通型蘋果枝條木質(zhì)部導(dǎo)管分子觀察[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，45(5)：214-216.

[5]王彩虹，田義軻，戴洪義. 柱型蘋果的研究和利用現(xiàn)狀[J]. 河北林果研究，2000，15(2)：197-200.

[6]高國(guó)訓(xùn)，李光晨，袁麗慧. 柱型蘋果莖尖培養(yǎng)中嫩莖增殖與植物激素的關(guān)系[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，5(2)：20-24.

[7]劉林德，姚敦義. 植物激素的概念及其新成員[J]. 生物學(xué)通報(bào)，2002，37(8)：18-20.

[8]鮮開梅，張永華. GA的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 北方園藝，2007(6)：74-75.

[9]張石城，劉祖祺. 植物化學(xué)調(diào)控與原理[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996.

[10]張興春，高 峰. 赤霉素對(duì)紫心甘薯花青素積累及相關(guān)酶基因表達(dá)的影響[D]. 廣州：華南師范大學(xué)，2009.

[11]梁美霞，鄧子牛，戴洪義. 柱型蘋果生長(zhǎng)特性的細(xì)胞學(xué)與分子生物學(xué)研究[D]. 長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010：36-38

[12]張志華，劉新彩，王紅霞，等. 核桃IOD和POD酶活性與生長(zhǎng)勢(shì)的關(guān)系[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2006，33(2)：229-232.

[13]李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社，2000.

[14]張維強(qiáng)，唐秀芝. 矮生型蘋果苗的預(yù)選指標(biāo)[J]. 植物學(xué)報(bào)，1997，29(4)：377-400.

[15]王 忠. 植物生理學(xué)[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999：227-278.