膿毒癥大鼠心肌損傷及清毒提取液修復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)研究*

宋欠紅 樊 睿 朱虹江 李云華 羅慶文 葉 勇 趙 淳

（云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650021）

膿毒癥（Sepsis）是臨床難治、多發(fā)?。?］。 在 ICU 患者中發(fā)病率高，耗費(fèi)大量醫(yī)療資源。盡管醫(yī)療技術(shù)日漸進(jìn)步，但病死率仍較高達(dá)30%～70%［2］。膿毒癥的大部分臨床表現(xiàn)有發(fā)熱，屬中醫(yī)學(xué)“外感熱病”“溫毒”等范疇［3］。膿毒癥并發(fā)心臟損害是其致死的重要危險(xiǎn)因素。中醫(yī)藥治療膿毒癥可通過多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用［4-5］。清毒提取液是本文通信作者全國(guó)名中醫(yī)趙淳教授治療膿毒癥氣分熱毒型的常用方劑，臨床療效顯著。本實(shí)驗(yàn)通過觀察清毒提取液對(duì)膿毒癥大鼠血清肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、B型尿鈉肽（BNP）及心肌組織丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平的調(diào)節(jié)，探討其對(duì)膿毒癥大鼠心肌損傷的修復(fù)作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠90只，體質(zhì)量260～300 g， 生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （滇）2015-0003，合格證號(hào)：430067000007126，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。大鼠自由飲水進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)前1周在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，濕度 40%～70%。

1.2 試藥與儀器 清毒提取液制備，具體組方為生大黃 15 g，炒黃連 15 g，炒黃芩 10 g，黃柏 10 g，梔子15 g［6-7］。 以上 5 味，共 10 劑劑量。 藥物浸泡 30 min，水煎2次，首煎生大黃后下10 min。加6倍量水，每次煎20 min，2次藥液混勻。減壓濃縮經(jīng)0.2 μm過濾器過濾并調(diào)整質(zhì)量濃度至 1 g/mL（按生藥計(jì)算）［8-9］。由云南中醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院制劑室提供。注射用烏斯他汀購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司。cTnⅠ試劑盒由拜耳公司提供；BNP試劑盒由羅氏公司提供；SOD試劑盒由Thermo Fisher公司提供；考馬斯亮藍(lán)由北京索萊寶科技有限公司提供；MDA試劑盒由上海信?？萍加邢薰咎峁?。FA/JA型電子天平由上海方瑞儀器有限公司生產(chǎn)；723 SPC型分光光度計(jì)由上海奧析科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；PSD800型離心機(jī)由蘇州星億機(jī)械有限公司生產(chǎn)。

1.3 造模與分組 1）分組及給藥：將大鼠用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組，分別為假手術(shù)組、模型組、烏斯他汀組各10只，清毒提取液低劑量組、清毒提取液中劑量組和清毒提取液高劑量組各20只。清毒提取液成人每日用量為65 g，實(shí)驗(yàn)大鼠與成人用藥量按照成人與大鼠體質(zhì)量比例計(jì)算，方法：成人用量（以體質(zhì)量70 kg計(jì)）×0.0026×50=大鼠用量/kg 體質(zhì)量［10］。 清毒提取液低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予4.25 mL/kg、8.5 mL/kg、17 mL/kg。于盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)前1 h和術(shù)后24 h、48 h、72 h、84 h 分別給大鼠清毒提取液灌胃、生理鹽水灌胃、烏斯他汀靜脈注射。假手術(shù)組和模型組予以生理鹽水10 mL/kg灌胃。烏斯他汀組予以注射用烏斯他汀13000 U/kg尾靜脈注射。注射用烏斯他汀10萬單位加入0.9%氯化鈉10 mL，使用針頭，左側(cè)尾靜脈注射。2）動(dòng)物模型制作：參照陸焱等［11］報(bào)道的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，復(fù)制腹腔感染型膿毒癥大鼠模型。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。在下腹部正中切長(zhǎng)約2 cm切口，分離盲腸與大腸的系膜，將腸腔內(nèi)糞便擠向遠(yuǎn)端，用滅菌3號(hào)絲線結(jié)扎盲腸，保持腸道通暢。在結(jié)扎范圍內(nèi)用12號(hào)針頭穿刺兩次腸壁，形成腸瘺，兩個(gè)針孔相距約3 mm，為防止傷口愈合在第2針孔內(nèi)放置一條寬2 mm的橡膠引流片。關(guān)閉腹腔，逐層縫合。為補(bǔ)充手術(shù)過程中體液的丟失術(shù)后立即皮下注射生理鹽水，劑量1 mL/100 g體質(zhì)量。假手術(shù)組只打開腹腔，不盲腸造瘺，然后逐層縫合腹壁。

1.4 標(biāo)本采集 于盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后96 h使用10%水合氯醛（2.4 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉生效后，將大鼠仰臥位固定。于股動(dòng)脈處取血約3 mL，待血液在試管中自然凝固后，予以離心，取上清液即血清分裝于ependor管置于-20℃冰箱，進(jìn)行檢測(cè)血清cTnⅠ、BNP。股動(dòng)脈取血后，迅速打開胸腔，取左心室室壁組織3 mm×3 mm，剪碎，研磨，離心取上清液，左心室勻漿上清液在冰浴下使用磷酸鹽緩沖液制成10%組織勻漿液，離心取上清液以備檢測(cè)心肌組織MDA含量及 SOD 活性［12］。

1.5 觀察指標(biāo) 1）大鼠血清cTnⅠ、BNP檢測(cè)：ELISA試劑盒嚴(yán)格按照說明書操作，進(jìn)行檢測(cè)。2）MDA含量的測(cè)定：取制備的左心室勻漿上清液，按照試劑說明書依次加試劑，混勻，沸水浴，離心取上清液，于532 nm處測(cè)光密度［13］。采用硫代巴比妥酸法測(cè)定。3）SOD活性的測(cè)定：采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定。根據(jù)說明書操作后，讀取440 nm下各組吸光度。以上檢測(cè)均嚴(yán)格按照說明書操作，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定組織的蛋白含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清cTNⅠ、BNP水平比較 見表1。清毒提取液低、中、高劑量組與模型組比較，使用清毒提取液治療后cTnⅠ水平均有降低（均P＜0.05）；清毒提取液低、高劑量組與模型組比較，可降低BNP水平（均P＜0.05）；清毒提取液中、高劑量組與烏斯他汀組比較，cTnⅠ差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），清毒提取液低、高劑量組與烏斯他汀組比較，BNP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表 1 各組血清 cTnⅠ、BNP水平比較（ng/mL，±s）

表 1 各組血清 cTnⅠ、BNP水平比較（ng/mL，±s）

與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 n cTnⅠ BNP假手術(shù)組 10 0.13±0.02 1.02±0.21模型組 4 1.85±0.22 4.89±0.53烏斯他汀組 6 0.79±0.11 2.83±0.39清毒提取液低劑量組 11 1.28±0.19△ 3.11±0.43△清毒提取液中劑量組 15 0.91±0.17△ 4.33±0.51清毒提取液高劑量組 16 0.74±0.12△ 3.04±0.45△

2.2 各組心肌組織MDA、SOD水平比較 見表2。清毒提取液中、高劑量組與模型組比較，MDA水平均有降低（P＜0.05）；清毒提取液高劑量組與模型組比較，可以提高SOD水平（P＜0.05）；清毒提取液中、高劑量組與烏斯他汀組比較，MDA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；清毒提取液高劑量組與烏斯他汀組比較，MDA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組心肌組織MDA、SOD水平比較（±s）

表2 各組心肌組織MDA、SOD水平比較（±s）

組 別 n MDA（μmol/mg） SOD（U/mg）假手術(shù)組 10 0.43±0.08 14.02±1.21模型組 4 1.85±0.22 8.89±1.53烏斯他汀組 6 0.79±0.11 12.33±1.39清毒提取液低劑量組 11 1.48±0.31 9.11±1.43清毒提取液中劑量組 15 0.91±0.17△ 9.03±1.41清毒提取液高劑量組 16 0.74±0.21△ 12.04±1.88△

3 討 論

心肌損傷是膿毒癥常見的臟器損害，常表現(xiàn)為心律失常、心肌供血不足和心力衰竭，一旦出現(xiàn)心力衰竭常導(dǎo)致其他器官功能的進(jìn)一步惡化［14］。其主要病機(jī)為熱毒熾盛，耗傷氣陰，心氣陰兩虛。臨床以發(fā)熱、面赤、胸悶、心悸、乏力、氣短、舌質(zhì)紅、苔黃膩，脈滑數(shù)為主要表現(xiàn)。其根本原因?qū)贌岫窘?，氣分熱盛，故?yīng)用清熱解毒，瀉火攻下之法。臨床研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用清毒提取液能夠緩解患者上述證候，并能降低患者心肌損傷、心力衰竭標(biāo)志物如cTnⅠ、BNP的水平。

清毒提取液為黃連解毒湯加大黃而成，以大黃、黃連、黃芩、黃柏、梔子按 3∶3∶2∶2∶3 比例組方［15-16］。 其不僅瀉火解毒力強(qiáng)，且有引熱下行之功，使熱邪從大腸而解。該方是本文通信作者全國(guó)名中醫(yī)趙淳教授治療膿毒癥氣分熱毒型的常用方劑，臨床療效顯著，其組方原則主要是根據(jù)膿毒癥主要病機(jī)即菌、毒、炎浸淫三焦，三焦熱盛，熱毒內(nèi)侵，熱擾心神，熱毒耗傷心氣、心陰所確定。

應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿孔復(fù)制的膿毒癥模型，其膿毒癥機(jī)制符合熱毒蘊(yùn)結(jié)陽明大腸，陽明熱盛、陽明腑實(shí)的特點(diǎn)。因腸道有多種細(xì)菌，形成腸瘺后，細(xì)菌快速繁殖，并產(chǎn)生大量?jī)?nèi)毒素，故膿毒癥發(fā)生急劇、嚴(yán)重，心肌損害產(chǎn)生比較典型。該方具有清熱解毒、瀉火攻下，蕩滌濕熱毒邪之功，屬釜底抽薪之法。三黃清解三焦火毒，梔子引邪從小便而出，大黃瀉火攻下，清解陽明熱毒，蕩滌濕熱毒邪?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芩具有解熱、抑菌、抗炎、抑制血小板聚集、抗氧化作用。黃連能夠興奮心臟、增強(qiáng)心肌收縮力、增加冠脈血流量、抗心律失常作用。黃柏具有抗炎、降壓作用。梔子具有解熱、抗炎、抗內(nèi)毒素作用。大黃能增加腸蠕動(dòng)、促進(jìn)排便，抗動(dòng)脈粥樣硬化，改善血液循環(huán)，保護(hù)腸屏障功能調(diào)節(jié)免疫作用［17］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)膿毒癥狀態(tài)下cTnⅠ、BNP增高，證明膿毒癥狀態(tài)下大鼠心肌存在不同程度地?fù)p傷。清毒提取液低、中、高劑量組與模型組比較，3組cTnⅠ水平均有降低；清毒提取液低、高劑量組與模型組比較，BNP水平均有降低。cTnⅠ、BNP 2項(xiàng)指標(biāo)主要從心肌損傷及心力衰竭的程度方面反映膿毒癥對(duì)心臟的損害［18］，清毒提取液降低cTnⅠ、BNP的水平，證明清毒提取液可有效降低膿毒癥心臟損害。清毒提取液中、高劑量組與模型組比較，心肌MDA水平均降低；清毒提取液高劑量組與模型組比較，可提高心肌SOD水平，證明高劑量清毒提取液可提高SOD活力，降低 MDA含量。其作用機(jī)理可能是全方發(fā)揮解熱、抑菌、抗內(nèi)毒素、清除氧自由基協(xié)同作用，特別是黃連能夠興奮心臟、增強(qiáng)心肌收縮力、增加冠脈血流量；大黃能改善血液循環(huán)，保護(hù)腸屏障功能［19］。本實(shí)驗(yàn)初步顯示，清毒提取液是治療膿毒癥心肌損傷的有效方法，其更深入的作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

［1］李楠，張彧，劉紅陽，等.膿毒癥患者血清NT-proBNP水平檢測(cè)臨床意義的研究［J］.浙江臨床醫(yī)學(xué)，2012，14（9）：1060-1062.

［2］曹書華.膿毒癥與多臟器功能失常綜合征［J］.中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2010，19（7）：781-782.

［3］王慶，賴國(guó)祥，吳文燕.中西醫(yī)對(duì)膿毒癥發(fā)病機(jī)制的研究［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，16（20）：2940-2942.

［4］姚詠明，盛志勇.膿毒癥防治學(xué)［M］.北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2008：3-24.

［5］李志軍.“三證三法”及“菌毒炎并治”治療膿毒癥的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2012，19（6）：321-323.

［6］趙保勝，劉永剛，王秀麗.黃連解毒湯解熱、抗炎作用研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15（11）：55-57.

［7］戴錫珍，高淑娟.“黃連解毒湯”體外抗內(nèi)毒素作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2006，6（5）：31-33.

［8］李學(xué)林，孟菲淺.析影響湯劑煎煮質(zhì)量的因素［J］.中醫(yī)雜志，2006，36（6）：38-38.

［9］宋欠紅，樊睿，蘇玉杰，等.魚金葶顆粒對(duì)AECOPD模型大鼠血清 IL-8、TNF-α 及 CRP的影響［J］.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，39（2）：5-7.

［10］李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)［M］.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2003：25-26.

［11］陸焱，邵耀明，陳文，等.小檗堿對(duì)膿毒癥小鼠血清高遷移率族蛋白B1水平的影響［J］.中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2009，3（7）：1170-1173.

［12］陳國(guó)鋒，高東雁，張文鑫，等.龍膽苦苷的體外穩(wěn)定性［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2008，43（2）：220-223.

［13］劉丹，劉晗喆，周秀華.烏斯他丁聯(lián)合參附注射液治療膿毒癥心肌損傷的療效分析［J］.醫(yī)學(xué)臨床研究，2015，25（9）：1685-1687.

［14］馬偉斌，江榮林，雷澍，等.參附注射液對(duì)膿毒癥大鼠心肌氧化應(yīng)激的影響［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，36（9）：1009-1011.

［15］楊文斌，馬世民，張秋錦.黃連的藥證及臨床應(yīng)用［J］.中醫(yī)藥通報(bào)，2008，7（5）：35-37.

［16］趙保勝，劉永剛，王秀麗.黃連解毒湯解熱、抗炎作用研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15（11）：55-57.

［17］周禎祥，唐德才.中藥學(xué)［M］.北京：中國(guó)中國(guó)醫(yī)藥出版社，2016：78-86，131.

［18］楊博，楊亞東，吳志雄，等.腦利鈉肽、肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白Ⅰ監(jiān)測(cè)在評(píng)估重癥膿毒癥和膿毒癥休克預(yù)后的意義［J］.中外醫(yī)療，2013，33（28）：101-102.

［19］畢銘華，張淑文，王寶恩，等.大鼠內(nèi)毒素血癥早期肝細(xì)胞線粒體的氧化損傷及中藥912液的干預(yù)作用［J］.中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2001，12（2）：79-81.