復(fù)方潰結(jié)康灌腸液對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜的保護(hù)作用*

毛堂友 陳 晨 史 瑞 謝添弘 郭 一 石 磊劉佳麗 譚 祥 丁龐華 姜 慧 李軍祥

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是炎癥性腸病的主要表現(xiàn)形式之一，是一種結(jié)腸和直腸的非特異性炎癥性疾?。?-2］，目前其病因及發(fā)病機(jī)制均尚不清楚，也尚無(wú)確切有效的治療方法，極大地影響了患者的身心健康。本課題組在前期臨床觀察中發(fā)現(xiàn)［3］，復(fù)方潰結(jié)康灌腸液對(duì)UC的治療具有較好的臨床效果，但其作用機(jī)制不明。因此，本研究利用葡聚糖硫酸鈉（DSS）制備UC大鼠模型，探討復(fù)方潰結(jié)康灌腸液對(duì)UC大鼠結(jié)腸黏膜的保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只健康SD雄性SPF級(jí)大鼠，體質(zhì)量（200±20）g。購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2011-0004。常規(guī)飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所SPF級(jí)動(dòng)物房，12 h光照/黑夜循環(huán)，溫度20～24℃，濕度50%～60%，自由飲食飲水飼養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器 復(fù)方潰結(jié)康灌腸液組成：苦參15 g，青黛5 g，地榆炭 30 g，五倍子10 g。劑型為配方顆粒，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院配方顆粒藥房統(tǒng)一購(gòu)自于北京康仁堂藥業(yè)有限公司。美沙拉嗪灌腸液（mesalazine，商品名為莎爾福）購(gòu)自德國(guó)Losan Pharma GmbH 公司。 DSS （MW36-50KDa；MP Bio-medical，Burlingame，CA，USA），便潛血試紙（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；UCT型超薄切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司），全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（MULTISKAN MK3，美國(guó)）。

1.3 造模與分組 本課題組的動(dòng)物模型建立方法參考文獻(xiàn)［4］，繼續(xù)采用自由飲用4.5%DSS溶液制備UC大鼠模型，將60只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，以4.5%DSS（MW 36000-50000，MP Biomedical）溶液自由飲水7 d，普通飼料喂養(yǎng)，晝/夜12/12 h交替，溫度25℃，濕度60%。同時(shí)運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)均等分為正常組、模型組、中藥低劑量組（787.5 mg/kg）、中藥中劑量組（1575 mg/kg）、中藥高劑量組（3150 mg/kg）、美沙拉嗪組（5 mL/kg）。造模的同時(shí)各組均以相應(yīng)藥物灌腸治療7 d。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 將大鼠稱重后，按照0.3 mL/100 g體質(zhì)量以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，大鼠翻身反射消失為麻醉成功。將麻醉成功后的大鼠仰臥位固定于鼠板上，用直徑為2 mm橡膠軟管涂抹液體石蠟油潤(rùn)滑后由大鼠肛門(mén)緩慢輕插入直腸約8 cm。一次性緩慢推注事先備好的溶液1 mL/200 g體質(zhì)量，5 min之內(nèi)完成，盡量減少液體流出量，灌腸成功后保持大鼠仰臥位臀部向上15 min。正常組和模型組均給10 mL/kg鼠體質(zhì)量的0.9%氯化鈉注射液，一次性緩慢推注事先配好的灌腸方1 mL/200 g體質(zhì)量，5 min之內(nèi)完成，盡量減少液體流出量。正常組和模型組均灌入等量的0.9%氯化鈉注射液，正常組灌入等量去離子水，美沙拉嗪組灌入等量的美沙拉嗪灌腸液，中藥高、中、低劑量組灌入相應(yīng)等量的復(fù)方潰結(jié)康灌腸液。灌腸成功后保持大鼠仰臥位臀部向上15 min，自然蘇醒后放回籠中，常規(guī)飼養(yǎng)。各組均灌腸給藥，每日1次，連用7 d。每日稱取大鼠體質(zhì)量，檢測(cè)便潛血，確保造模7 d中大鼠均維持便血狀態(tài)，造模結(jié)束后查看大鼠結(jié)腸病理，結(jié)腸黏膜病變不超過(guò)黏膜下層，炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)明顯，使得模型維持在炎癥階段，避免異型增生的干預(yù)。各組大鼠末次給藥后，禁食不禁水，24 h后取材，分離遠(yuǎn)端結(jié)腸10 cm，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)價(jià)。見(jiàn)表1。每日稱取大鼠體質(zhì)量，觀察大便性狀，并用便潛血試劑盒檢測(cè)便潛血，以評(píng)估疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）［5］。 計(jì)算公式：DAI＝（體質(zhì)量下降指數(shù)+大便性狀+大便潛血）/3。DAI評(píng)估由非課題組成員完成。2）結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分。見(jiàn)表2。石蠟切片常規(guī)HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察評(píng)分。結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分（HS）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［6］如下，包括炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度、潰瘍、病變層次。組織病理學(xué)評(píng)分均由非課題組成員在病理老師指導(dǎo)下完成。3）結(jié)腸組織MPO活性檢測(cè)。取肛門(mén)以上結(jié)腸1 cm冰0.9%氯化鈉注射液洗凈，勻漿、離心后取上清，應(yīng)用化學(xué)比色法來(lái)檢測(cè) MPO 的活性［7］。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 結(jié)腸組織病理學(xué)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。符合正態(tài)分布且方差齊進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），不符合正態(tài)分布或方差不齊進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，均為組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)方潰結(jié)康灌腸液對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠DAI指數(shù)的影響 見(jiàn)表3。本次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，共有6只大鼠死亡，其中正常組2只，低劑量組1只，高劑量組3只。造模后第2日，模型組大鼠及出現(xiàn)便潛血陽(yáng)性，毛色、體質(zhì)量計(jì)活動(dòng)度無(wú)明顯變化。隨著DSS飲用量的增加，大鼠便血情況加重，開(kāi)始出現(xiàn)肉眼血便，而毛色逐漸失去光澤，活動(dòng)性變差，反應(yīng)較為遲緩、懶動(dòng)。至第7日DAI到最大。中藥各劑量組大鼠毛色、活動(dòng)度及反應(yīng)情況肉眼觀與模型組并無(wú)明顯差異，便血情況好轉(zhuǎn)；與正常組比較，模型組DAI明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組及美沙拉嗪組較明顯的下降（P＜0.01）。

表3 復(fù)方潰結(jié)康灌腸液對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠DAI指數(shù)的影響（±s）

表3 復(fù)方潰結(jié)康灌腸液對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠DAI指數(shù)的影響（±s）

與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。 下同。

組 別 n正常組 8模型組 10中藥低劑量組 9 DAI指數(shù)0.08375±0.2369 3.035±0.4842△△1.999±0.6227△△中藥中劑量組 10 2.066±0.6625△△中藥高劑量組 7 1.430±0.6596△△美沙拉嗪組 10 2.034±0.3978△△

2.2 復(fù)方潰結(jié)康灌腸液對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠病理的影響 見(jiàn)圖1，表4。模型組結(jié)腸黏膜充血、水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞為主；杯狀細(xì)胞明顯減少，黏膜連續(xù)性被破壞，可見(jiàn)深至黏膜下層的潰瘍，病變集中在黏膜層級(jí)黏膜下層。各治療組充血、水腫減輕，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。與正常組比較，模型組結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組及美沙拉嗪組結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分均顯著降低（P＜0.01）。

圖1 復(fù)方潰結(jié)康灌腸液治療DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸病理圖（HE染色，100倍）

表4 復(fù)方潰結(jié)康灌腸液對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠病理評(píng)分的影響（分，±s）

表4 復(fù)方潰結(jié)康灌腸液對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠病理評(píng)分的影響（分，±s）

與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。 下同。

組 別 n正常組 8模型組 10中藥低劑量組 9病理評(píng)分1.985±0.2962 8.130±0.6784**4.637±0.5977△△中藥中劑量組 10 3.876±0.3442△△中藥高劑量組 7 4.105±0.1185△△美沙拉嗪組 10 4.137±0.1867△△

2.3 復(fù)方潰結(jié)康灌腸液對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠MPO的影響 見(jiàn)表5。與正常組比較，模型組結(jié)腸MPO活性顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組及美沙拉嗪組結(jié)腸組織MPO活性均顯著降低（P＜0.01）。

表5 復(fù)方潰結(jié)康灌腸液對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠MPO 的影響（±s）

表5 復(fù)方潰結(jié)康灌腸液對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠MPO 的影響（±s）

組 別 n正常組 8模型組 10中藥低劑量組 9 MPO 28.84±6.971 56.38±5.954**42.77±7.029△△中藥中劑量組 10 36.38±11.70△△中藥高劑量組 7 38.54±9.565△△美沙拉嗪組 10 34.09±6.301△△

3 討 論

目前為止，西醫(yī)尚無(wú)治療UC的特效藥物，誘導(dǎo)緩解、維持緩解、防治UC相關(guān)的并發(fā)癥，成為目前UC治療的三大目標(biāo)［8-9］。目前常用的治療藥物包括水楊酸類、類固醇激素、免疫抑制劑、生物制劑等［10-11］，不僅療效不突出，還存在各種各樣的問(wèn)題，例如臨床使用水楊酸類和類固醇激素類藥物存在藥物不耐受，副作用明顯，療程長(zhǎng)，復(fù)發(fā)率高的問(wèn)題，免疫抑制劑和生物制劑的使用處在研究及臨床試驗(yàn)階段，其療效及安全性評(píng)價(jià)仍需要進(jìn)一步研究［12］。因此，急需尋找新的治療方法。中藥保留灌腸治療UC療效顯著，使高濃度藥物直達(dá)患處，提高腸內(nèi)局部血藥濃度，藥物的有效成分與腸道病變黏膜接觸后即可發(fā)揮作用，再經(jīng)過(guò)肝腸循環(huán)，最后通過(guò)血液循環(huán)輸送到全身，大大降低了肝腸循環(huán)、首過(guò)效應(yīng)消除對(duì)藥物有效成分的影響，并且具有副作用小、費(fèi)用低、復(fù)發(fā)率低的優(yōu)勢(shì)，成為最近治療潰瘍性結(jié)腸炎的研究熱點(diǎn)［13-14］。

復(fù)方潰結(jié)康灌腸液是北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院消化內(nèi)科李軍祥教授經(jīng)過(guò)多年臨床總結(jié)的臨床經(jīng)驗(yàn)方，主要針對(duì)本病的濕熱內(nèi)蘊(yùn)，夾有瘀血的標(biāo)實(shí)進(jìn)行治療，清腸利濕、化瘀止血，在臨床上對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎（直腸和乙狀結(jié)腸型）進(jìn)行局部灌腸治療，取得了很好的療效。 本方由苦參15 g，青黛5 g，地榆炭30 g，五倍子10 g組成，其中苦參苦、寒，功效清熱燥濕，青黛咸、寒，功效清熱涼血解毒，兩藥合用具有清熱利濕解毒的作用；重用地榆炭苦、酸、涼，功效涼血止血、解毒斂瘡，五倍子酸、澀、寒，收斂止血，《本草拾遺》記載，五倍子能夠治腸虛泄痢；諸藥合用，共奏清腸利濕、化瘀止血之效。我們?cè)谇捌谂R床研究中已經(jīng)觀察到復(fù)方潰結(jié)康灌腸液能改善UC患者腹痛腹瀉、黏液膿血便和里急后重的癥狀，但是作用機(jī)制不明確，因此本研究采用4.5%DSS溶液自由飲用以制備UC大鼠模型，意在探討本方對(duì)UC大鼠結(jié)腸黏膜的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DSS誘導(dǎo)的UC大鼠第2日即開(kāi)始出現(xiàn)便潛血陽(yáng)性、大便稀溏、體質(zhì)量下降、毛色光澤變差、活動(dòng)性差、反應(yīng)遲緩等表現(xiàn)；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，DAI指數(shù)不斷升高，至第7日達(dá)到最大；結(jié)腸病理光鏡下可見(jiàn)結(jié)腸黏膜充血、水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（以中性粒細(xì)胞為主）；黏膜連續(xù)性被破壞，可見(jiàn)深至黏膜下層的小潰瘍，HS評(píng)分較正常組明顯升高，特點(diǎn)與人類UC比較吻合。另外，我們也對(duì)結(jié)腸組織進(jìn)行了MPO檢測(cè)，MPO主要存在于炎癥細(xì)胞，尤其是中性粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，其活性反映了組織中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)程度，因此，MPO可作為UC急性期疾病活動(dòng)嚴(yán)重程度的檢測(cè)指標(biāo)，是UC病情活動(dòng)的標(biāo)志物［15］。研究發(fā)現(xiàn)，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠MPO值較正常組明顯升高，說(shuō)明結(jié)腸組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加。經(jīng)過(guò)復(fù)方潰結(jié)康灌腸液治療后，大鼠的DAI指數(shù)、HS評(píng)分以及MPO活性都較模型組有明顯的降低，由此表明，復(fù)方潰結(jié)康灌腸液對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠有較好的治療作用，能夠明顯改善腹痛腹瀉、膿血等臨床癥狀，還能降低結(jié)腸炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，保護(hù)結(jié)腸黏膜免受損傷。

本次研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步探討了復(fù)方潰結(jié)康灌腸液對(duì)DSS誘導(dǎo)UC大鼠結(jié)腸黏膜的保護(hù)作用及其機(jī)制，但進(jìn)一步的作用機(jī)理仍不清楚，還需要我們后續(xù)進(jìn)一步的研究。

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