鄭州地區(qū)漢族人群的CYP2C9/VKORC1基因多態(tài)性與華法林個(gè)體化用藥研究

劉科蘭

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450014)

華法林是目前臨床上的一線(xiàn)口服抗凝血藥，主要用于預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病，但其狹窄的抗凝治療窗口及給藥劑量不當(dāng)所致的并發(fā)癥是臨床合理用藥的巨大障礙。由于個(gè)體差異和種族差異很大，不同的患者若要達(dá)到相同的治療效果，華法林的劑量可相差10倍以上[1]。隨著遺傳學(xué)與藥物基因組學(xué)的發(fā)展，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素是造成華法林給藥劑量個(gè)體差異的主要原因之一[2]；華法林在肝臟的代謝酶CYP2C9及其作用靶點(diǎn)VKORC1的基因多態(tài)性是造成不同患者華法林給藥劑量差異的重要原因之一[3]。本研究通過(guò)檢測(cè)鄭州地區(qū)漢族人群的CYP2C9/VKORC1基因多態(tài)性，分析不同基因型與華法林給藥劑量的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DNA提取及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增試劑盒、BR526-24型全自動(dòng)雜交儀和BE-2.0型生物芯片識(shí)別儀(上海Baio公司)；ABI9902型PCR儀(美國(guó)AB公司)。

1.2 研究對(duì)象

研究對(duì)象為2014—2015年鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科、心外科及老年科的167例使用華法林(未聯(lián)用胺碘酮)患者的外周靜脈血樣標(biāo)本。所有患者均來(lái)自鄭州市及其周邊地區(qū)；均為漢族，彼此之間無(wú)血緣關(guān)系；男性患者94例，女性患者73例；年齡19～92歲；平均身高(165.94±7.46) cm；平均體質(zhì)量(65.31±12.66) kg。

1.3 方法

1.3.1 提取DNA：取患者外周血1 ml(乙二胺四乙酸抗凝)，采用DNA提取試劑盒，進(jìn)行DNA的提取。

1.3.2 定性PCR：采用PCR擴(kuò)增試劑盒。反應(yīng)體系25 μl。PCR反應(yīng)條件，50 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；再在72 ℃下延伸5 min，結(jié)束擴(kuò)增產(chǎn)物備用。

1.3.3 確定基因分型：同時(shí)檢測(cè)CYP2C9 *1、*2、*3位點(diǎn)和VKORC1-1 639位點(diǎn)基因型，確定每例患者的基因分型。

1.3.4 給藥劑量計(jì)算：采用國(guó)際華法林藥物基因組聯(lián)合會(huì)(international warfarin pharmaeogenetics consortium，IWPC)算法，根據(jù)患者的身高、體質(zhì)量、年齡及檢測(cè)出的基因型計(jì)算每例患者華法林的給藥劑量。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，利用χ2檢驗(yàn)和方差分析對(duì)各組進(jìn)行比較；進(jìn)行哈迪-溫伯格定律的吻合度測(cè)驗(yàn)，檢驗(yàn)各等位基因頻率是否符合遺傳學(xué)規(guī)律[4]。

1.3.6 CYP2C9、VKORC1基因多態(tài)性及其他指標(biāo)與華法林劑量的關(guān)系：對(duì)167例患者的CYP2C9、VKORC1基因型分別進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)患者基因型和IWPC模型確定患者華法林最初給藥劑量，并根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)監(jiān)測(cè)結(jié)果調(diào)整華法林至穩(wěn)定給藥劑量，分析不同的基因型與華法林用藥量的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 基因分型分布

167例患者中，VKORC1-1639 AA基因型者138例(占82.63%)，VKORC1-1639 AG基因型者27例(占16.17%)，VKORC1-1639 GG基因型者2例(占1.20%)；CYP2C9 *1/*1基因型者153例(占91.62%)，CYP2C9*1/*3基因型者14例(占8.38%)，CYP2C9*1/*2基因型者0例；所有患者中共有10例同時(shí)出現(xiàn)VKORC1 AA和CYP2C9*1/*3基因變異(χ2=2.054，P>0.05)，符合哈迪-溫伯格定律。各種基因型生物芯片識(shí)別圖見(jiàn)圖1。

A.(CYP2C9*1/*1)/(VKORC1-1639 AA)；B.(CYP2C9*1/*1)/(VKORC1-1639 GA)； C.(CYP2C9*1/*1)/(VKORC1-1639 GG)；D.(CYP2C9*1/*3)/(VKORC1-1639 AA)；E.(CYP2C9*1/*3)/(VKORC1-1639 GA)圖1 各種基因型生物芯片識(shí)別示意圖Fig 1 Schematic diagram of genotype biochip identification

2.2 CYP2C9、VKORC1基因多態(tài)性及其他指標(biāo)與華法林劑量的關(guān)系

167例患者中，女性患者的華法林平均劑量為3.04 mg/d，男性患者為3.39 mg/d，兩者的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。VKORC1-1639 GG基因型[(5.61±0.69)mg/d]、VKORC1-1639 AG基因型[(4.01±1.05)mg/d]患者的華法林穩(wěn)定給藥劑量明顯高于VKORC1-1639 AA基因型[(2.98±0.58)mg/d]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 5)；CYP2C9*1/*1基因型患者的華法林穩(wěn)定給藥劑量[(3.34±0.86)mg/d]明顯高于CYP2C9*1/*3基因型[(2.02±0.45)mg/d]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表1。其中，基因型為CYP2C9*1/*1和VKORC1-1639 AA的患者128例，華法林平均穩(wěn)定給藥劑量為(3.24±0.69)mg/d；基因型為CYP2C9*1/*1和VKORC1-1639 AG的患者21例，華法林平均穩(wěn)定該藥劑量為(4.45±0.73)mg/d；基因型為CYP2C9*1/*1和VKORC1-1639 GG的患者2例，華法林平均穩(wěn)定給藥劑量為(5.86±0.51)mg/d；基因型為CYP2C9*1/*3和VKORC1-1639 AA的患者10例，華法林平均穩(wěn)定給藥劑量為(1.90±0.45)mg/d；基因型為CYP2C9*1/*3和VKORC1-1639 AG的患者4例，華法林平均穩(wěn)定該藥劑量為(2.29±0.26)mg/d，見(jiàn)表2。

表1 167例患者的CYP2C9/VKORC1基因多態(tài)性分布Tab l Distribution of gene polymorphism in CYP2C9/VKORC1 from 167 patients

表2 基因多態(tài)性對(duì)華法林抗凝作用的影響Tab 2 Influence of gene polymorphism on the anticoagulant effect of warfarin

注：等位基因頻率在性別間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)

Note：there was no statistical significance in allele frequency between the genders(P>0.05)

3 討論

目前，臨床上仍主要依靠INR的監(jiān)測(cè)值調(diào)整患者的華法林用量，這種方法不但增加了患者的治療費(fèi)用、檢驗(yàn)次數(shù)，還延長(zhǎng)了藥物達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度的時(shí)間，并可能增加栓塞及出血的風(fēng)險(xiǎn)。隨著藥物基因組學(xué)的發(fā)展，藥物代謝酶的基因多態(tài)性研究在臨床上的指導(dǎo)意義越來(lái)越大，基因?qū)騻€(gè)體化治療已被用于臨床，對(duì)指導(dǎo)臨床的個(gè)體化用藥極為重要。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C9/VKORC1的基因多態(tài)性是導(dǎo)致不同患者華法林給藥劑量差異的重要原因[5-6]。華法林60%～70%的抗凝作用由S-華法林承擔(dān)，而參與S-華法林代謝的酶主要為CYP2C9，可見(jiàn)CYP2C9基因多態(tài)性可顯著影響華法林的代謝[7]。另有研究結(jié)果顯示，CYP2C9突變型(*2、*3)的基因多態(tài)性對(duì)華法林代謝的影響約占10%，可使酶的活性降低，攜帶此基因的患者服用華法林后達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度需要的時(shí)間較長(zhǎng)，與野生型*1/*1相比，華法林的給藥劑量相對(duì)較低，且在使用初期有較高的出血危險(xiǎn)性[8]。另外，在VKORC1編碼區(qū)和非編碼區(qū)存在大量的多態(tài)性基因位點(diǎn)，這些多態(tài)性基因位點(diǎn)會(huì)影響相關(guān)酶的活性，使華法林的給藥劑量存在顯著的個(gè)體差異。文獻(xiàn)曾報(bào)道，對(duì)華法林劑量有影響的位點(diǎn)主要是啟動(dòng)子區(qū)1 639位置G>A。

本研究探討了鄭州地區(qū)167例患者中CYP2C9/VKORC1這2種基因的多態(tài)性與華法林劑量的關(guān)系，以及不同基因型對(duì)華法林劑量個(gè)體差異的影響程度。結(jié)果顯示，患者服用華法林的劑量從1.71 mg/d到6.14 mg/d，個(gè)體差異很大，與陳暉等[7]的報(bào)道基本一致。攜帶CYP2C9*1/*1基因型的患者153 例，CYP2C9*1/*3基因型的患者14例，未發(fā)現(xiàn)CYP2C9*1/*2基因型的患者。CYP2C9*1/*1基因型患者的穩(wěn)定給藥劑量[(3.34±0.86)mg/d]明顯高于CYP2C9*1/*3基因型[(2.02±0.45)mg/d]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。攜帶CYP2C9突變型患者(*1/*3)發(fā)生INR過(guò)高和嚴(yán)重出血事件的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于野生型患者(*1/*1)，穩(wěn)定給藥劑量較野生型患者低。另外，攜帶VKORC1-1639 AA基因型的患者138例(占82.63%)，VKORC1-1639 AG基因型27例(占16.17%)，VKORC1-1639 GG基因型2例(占1.20%)，與其他研究結(jié)果基本一致[9-10]。VKORC1-1639 AA是純合子突變基因型，與野生

基因型相比，攜帶純合子突變基因型的患者需要的華法林劑量更低一些。VKORC1-1639 GG基因型[(5.61±0.69) mg/d]、VKORC1-1639 AG基因型[(4.01±1.05) mg/d]患者的穩(wěn)定給藥劑量明顯高于VKORC1-1639 AA基因型[(2.98±0.58) mg/d]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 5)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11-12]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，基因多態(tài)性在性別上的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本次研究?jī)H檢測(cè)了患者CYP2C9、VKORC1基因型，由結(jié)果可見(jiàn)，華法林最初給藥劑量明顯高于穩(wěn)定給藥劑量。原因是華法林的抗凝效果除了與CYP2C9、VKORC1基因型密切相關(guān)外，還受到CYP2A6、CYP4F2、γ-谷氨酰基羧化酶、載脂蛋白E及多藥耐藥基因等的調(diào)控[13]。另外，藥物相互作用、生理病理狀態(tài)及藥物等非遺傳因素對(duì)華法林抗凝治療亦存在顯著影響[14]。

由本研究結(jié)果可見(jiàn)，CYP2C9及VKORC1基因多態(tài)性在鄭州地區(qū)人群中的分布比較普遍，這對(duì)于臨床實(shí)踐將具有很重要的指導(dǎo)意義。Zhu等[15]研究結(jié)果顯示，CYP2C9/VKORC1基因多態(tài)性加上性別、年齡及體質(zhì)量等因素對(duì)華法林的影響可以解釋約50.4%～64.1%的個(gè)體用藥差異，其中VKORC1基因的影響約占25%[7]?？梢?jiàn)，目前CYP2C9/VKORC1基因多態(tài)性仍是影響華法林劑量個(gè)體差異的重要因素。因此，建議鄭州地區(qū)的廣大醫(yī)務(wù)工作者在對(duì)患者進(jìn)行治療時(shí)，要重視患者的CYP2C9/VKORC1基因分型，尤其是攜帶CYP2C9突變型的患者(*1/*2、*1/*3)；另外，可以在允許的條件下，建議患者進(jìn)行CYP2C9/VKORC1基因分型的檢測(cè)，參考檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)臨床合理使用華法林，最終實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥。

[1]Ansell J，Hirsh J，Hylek E，et al.Pharmacology and management of the vitamin Kant agonists：American College of Chest Physicians Evi-dence-Based Clinical Practice Guidelines(8th Edition)[J].Chest，2008，133(6 Suppl)：160S-198S.

[2]苗靜琨，陳啟雄，吳小玫，等.石菖蒲α-細(xì)辛醚對(duì)Lithium-Pilocarpine抗癲癇模型GABA系統(tǒng)的調(diào)控作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(8)：1067-1071.

[3]婁瑩，劉紅，韓璐璐，等.CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性對(duì)肺栓塞患者華法林初始抗凝療效的影響[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2012，28(4)：256-259.

[4]都麗萍，梅丹，劉昌偉，等.CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性對(duì)華法林劑量和抗凝效果的影響[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2010，45(21)：1628-1633.

[5]Almeida L，F(xiàn)alc?o A，Vaz-da-Silva M，et al.Effect of nebicapone on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of warfar in healthy subjects[J].Eur Clin Pharmacol，2008，64(10)：961-966.

[6]張延博，葛衛(wèi)紅，印曉星.120例華法林鈉抗凝治療患者CYP2C9基因多態(tài)性的研究[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26(1)：45-48.

[7]陳暉，馬蕾.CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性與華法林個(gè)體化用藥的臨床研究[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2015，10(12)：3-5.

[8]賀寶霞，石磊，趙樹(shù)進(jìn)，等.CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性與華法林個(gè)體化用藥研究進(jìn)展[J].廣東醫(yī)學(xué)，2008，29(4)：684-686.

[9]顧強(qiáng)，陳柏成，郝嘉，等.重慶地區(qū)人工機(jī)械瓣膜置換術(shù)后患者VKORC1-1639 A/G遺傳多態(tài)性與華法林劑量調(diào)整的研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(23)：2370-2373.

[10] Yang L，Ge W，Yu F，et al.Impact of VKORC1 gene polymorphism on inter-individual and interethnic warfarin dosage requirement syst-ematic review and meta analysis[J].Thromb Res，2010，125(4)：e159-e166.

[11] Wang D，Chen H，Momary KM，et al.Regulatory polymorphism in vitamin K epoxide reductase complex subunit 1(VKORC1)affects gene expression and warfarin dose requirement[J].Blood，2008，112(4)：1013-1021.

[12] Sconce EA，Khan TI，Wynne HA，et al.The impact of CYP2C9 and VKORC1 genetic polymorphism and patient characteristics upon warfarin dose requirements：proposal for a new dosing regimen[J].Blood，2005，106(7)：2329-2333.

[13] 何志強(qiáng)，韓勇，彭雯，等.基因檢測(cè)指導(dǎo)華法林個(gè)體化用藥案例分析[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33(14)：1188-1189.

[14] 劉俊，徐航，葛衛(wèi)紅，等.華法林基于藥物基因組學(xué)個(gè)體化給藥方案的評(píng)價(jià)[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33(22)：1857-1862.

[15] Zhu Y，Shennan M，Reynolds KK，et al.Eslimation of warfarin main-tenance dose based on VKORC1(-1639 G>A)and CYP2C9 genolypes[J].Clin Chem，2007，53(7)：1199-1205.