物理處理對(duì)大豆蛋白-磷脂酰膽堿結(jié)構(gòu)影響的拉曼分析

江連洲 張瀟元 朱一方 李 楊 OLGA Olegovna Babich 王中江

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030； 2.克麥羅沃國立大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 克麥羅沃 650056)

0 引言

大豆蛋白由于蛋白含量高、乳化性能好以及利于機(jī)體消化吸收而被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)生產(chǎn)中。但是天然大豆蛋白難以滿足工業(yè)生產(chǎn)中對(duì)蛋白質(zhì)功能特性的不同需求，需對(duì)其進(jìn)行適度的改性[1]。磷脂酰膽堿作為安全、無毒副作用并具有治療與保健功能的天然兩性離子表面活性劑，與蛋白質(zhì)的相互作用會(huì)影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及乳液界面特性，進(jìn)而增強(qiáng)了其乳化能力，并影響到蛋白質(zhì)的微膠囊化性質(zhì)[2-4]。

大豆蛋白-磷脂酰膽堿復(fù)合體系普遍存在于傳統(tǒng)豆制品加工、新興全豆類制品加工中。目前國內(nèi)外研究者關(guān)于蛋白-磷脂酰膽堿復(fù)合體系的研究較為成熟，多集中于對(duì)復(fù)合比例、乳化條件、復(fù)合物相互作用機(jī)制及乳液穩(wěn)定機(jī)制的研究[5-12]。眾多研究均表明，磷脂酰膽堿的添加可以使蛋白質(zhì)乳液的粒徑降低。然而，已有關(guān)于大豆蛋白-磷脂酰膽堿相互作用機(jī)理的影響研究仍不清晰，超聲、高壓處理后大豆蛋白-磷脂酰膽堿復(fù)合體系對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的影響研究也尚屬空白。

本文利用拉曼光譜分析超聲、高壓均質(zhì)作用于大豆蛋白-磷脂酰膽堿復(fù)合體系中的各種功能鍵與復(fù)合磷脂酰膽堿后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。通過拉曼光譜圖頻率和強(qiáng)度反映大豆蛋白-磷脂酰膽堿復(fù)合體系所處環(huán)境和構(gòu)象變化等信息，以期通過結(jié)構(gòu)變化的辨認(rèn)為探清超聲及高壓均質(zhì)處理下大豆蛋白-磷脂酰膽堿復(fù)合物加工處理提供參考和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆蛋白，蛋白質(zhì)量濃度892.1 mg/mL(山東省高唐藍(lán)山集團(tuán))；磷脂酰膽堿(北京索萊寶科技有限公司)；氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(分析純?cè)噭?。

1.2 儀器與設(shè)備

T18 Basic型高速分散機(jī)/勻漿機(jī)(德國IKA公司)；超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；實(shí)驗(yàn)型高壓均質(zhì)機(jī)(英國Stansted Fluid Power公司)；79-1型磁力加熱攪拌器(武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司)；XW-80A型旋渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)；PerkinElmer Raman Station 400型拉曼光譜儀(美國PE公司)；PH SJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(中國上海雷磁公司)。

1.3 方法

1.3.1大豆蛋白-磷脂酰膽堿復(fù)合物的制備

參照LEE等[13]方法將質(zhì)量濃度為100 mg/mL的大豆蛋白和20 mg/mL磷脂酰膽堿溶于緩沖液(0.1 mol/L、pH值7.0磷酸鹽緩沖溶液)中，室溫(20℃)下攪拌2 h，另取質(zhì)量濃度為100 mg/mL的大豆蛋白溶于緩沖液(0.1 mol/L、pH值7.0磷酸鹽緩沖溶液)中，室溫下攪拌2 h。分別用高速乳化均質(zhì)機(jī)進(jìn)行均質(zhì)處理，處理?xiàng)l件為20 000 r/min剪切5 min[14]。

1.3.2超聲處理大豆蛋白-磷脂酰膽堿復(fù)合乳液

將粗乳液通過超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)一步處理。超聲處理的方法及條件設(shè)定參照HU等[15]方法并進(jìn)行一定修改。將超聲波處理器的鈦探頭(直徑0.636 cm)插入液面，在20 kHz下在輸出功率為500 W下處理9 min，超聲時(shí)間5 s，間隔時(shí)間5 s，并每3 min向冰水浴中加入冰塊保持低溫。

1.3.3高壓均質(zhì)處理大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液

將粗乳液通過高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)一步均質(zhì)乳化。高壓均質(zhì)處理的方法及條件設(shè)定參照DYBOWSKA[16]方法并進(jìn)行一定修改。高壓均質(zhì)機(jī)采用均質(zhì)壓力為100 MPa，均質(zhì)次數(shù)為4次，并每均質(zhì)一次將樣品置于冰水浴中保持低溫。

1.3.4拉曼光譜的測定及分析

拉曼光譜的測定參照HERRERO等[17]方法并進(jìn)行一定修改。相關(guān)參數(shù)設(shè)定為激發(fā)光波長785 nm，激光功率80 mW，掃描范圍400～2 000 cm-1，每次掃描時(shí)間60 s，積分10次，4次掃描進(jìn)行累加。以苯丙氨酸((1 003±1) cm-1)作為歸一化因子，得到大豆蛋白及磷脂的拉曼譜圖。譜圖基線校正、譜峰歸屬查找采用ACD Labs V12軟件。

1.3.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每次試驗(yàn)做3次平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS Statistics 22軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，P<0.05為顯著性差異。采用Origin 9.1軟件、ACD Labs V12軟件、Raman Spectral Analysis Package Version 2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、圖表處理及圖譜分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆蛋白主鏈結(jié)構(gòu)特征拉曼光譜分析

不同處理大豆蛋白及磷脂酰膽堿的拉曼譜圖如圖1所示，英文縮寫符號(hào)如表1所示，依據(jù)已有研究進(jìn)行各峰位歸屬分別列于表2中[18]。拉曼光譜中譜峰位置及強(qiáng)度的變化主要用于研究大豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及疏水微環(huán)境變化。

大豆蛋白的構(gòu)象主要由酰胺Ⅰ帶的拉曼特征峰確定，酰胺Ⅰ帶拉曼特征峰位置為：α-螺旋結(jié)構(gòu)，1 645～1 660 cm-1；β-折疊結(jié)構(gòu)，1 665～1 680 cm-1；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，1 680～1 690 cm-1；無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，1 660～1 670 cm-1。本實(shí)驗(yàn)中大豆蛋白的拉曼圖譜二級(jí)結(jié)構(gòu)的定量計(jì)算由Raman Spectral Analysis Package Version 2.1軟件完成。

圖1 不同處理?xiàng)l件下大豆蛋白-磷脂酰膽堿復(fù)合體系的拉曼圖譜Fig.1 Raman spectra of soybean protein-phosphatidylcholine composite system in different treatments

英文縮寫英文名稱中文名稱D-SPdispersiontreatmentsoybeanprotein分散處理大豆蛋白D-SP-PCdispersiontreatmentsoybeanprotein-phosphatidylcholine分散處理大豆蛋白-磷脂U-SPultrasonictreatmentsoybeanprotein超聲處理大豆蛋白U-SP-PCultrasonictreatmentsoybeanprotein-phosphatidylcholine超聲處理大豆蛋白-磷脂H-SPhighpressurehomogeneoussoybeanprotein高壓均質(zhì)處理大豆蛋白H-SP-PChomogeneoussoybeanprotein-phosphatidylcholine高壓均質(zhì)處理大豆蛋白-磷脂

表2 大豆蛋白拉曼峰位歸屬Tab.2 Tentative assignment of some bands in Raman spectrum of soybean protein

蛋白質(zhì)的酰胺Ⅰ帶及酰胺Ⅲ帶常被用于檢測蛋白質(zhì)的主鏈結(jié)構(gòu)，拉曼譜圖中1 665～1 675 cm-1處譜帶表明大豆蛋白中主要存在α-螺旋結(jié)構(gòu)及無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。在本研究中蛋白質(zhì)的酰胺Ⅰ帶用于研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的定量分析[19]，測試結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，大豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成為：30.59% α-螺旋結(jié)構(gòu)、24.28% β-折疊結(jié)構(gòu)、16.76% β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)及28.37%無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。

通過比較可知，超聲處理及高壓均質(zhì)處理均提高了大豆蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量，并降低了大豆蛋白的β-構(gòu)型結(jié)構(gòu)。

表3 不同處理樣品蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組分相對(duì)含量Tab.3 Percentages of protein secondary structure of sample with different treatments %

注：同一列數(shù)據(jù)后不同字母代表差異顯著(P<0.05)，下同。

研究表明高壓均質(zhì)產(chǎn)生的壓力作用、高頻振蕩和對(duì)流撞擊等機(jī)械力誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[20]，在本研究中高壓均質(zhì)作用下大豆蛋白的有序結(jié)構(gòu)增多，F(xiàn)LOURY等[21]研究發(fā)現(xiàn)高壓均質(zhì)可使大豆蛋白的變性溫度升高，加大了大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。研究表明高壓均質(zhì)作用下蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加、β-折疊結(jié)構(gòu)含量降低，與本研究結(jié)果相同，研究指出均質(zhì)處理使大豆蛋白內(nèi)部氫鍵結(jié)構(gòu)排列發(fā)生改變[22]。

超聲處理下大豆蛋白的無序結(jié)構(gòu)含量較多，這可能是由于超聲處理下大豆蛋白分子剛性結(jié)構(gòu)減弱，柔性結(jié)構(gòu)增加，分子由有序變得無序[23]。研究表明大豆蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由肽鏈氨基酸上羰基和酰胺基團(tuán)之間形成的氫鍵維持，超聲波處理能夠破壞氫鍵作用是本研究中大豆蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)含量降低的可能原因[24-25]。

綜合比較可知，大豆蛋白-磷脂酰膽堿交互作用顯著降低了蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)，并轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)及β-折疊結(jié)構(gòu)。超聲處理及高壓均質(zhì)作用下大豆蛋白-磷脂酰膽堿復(fù)合物中蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)均低于高速分散處理組，而β-折疊結(jié)構(gòu)及無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量較高。這可能是由于超聲處理及高壓均質(zhì)作用可促進(jìn)大豆蛋白-磷脂酰膽堿交互作用，進(jìn)而改變了大豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。畢爽等[20]研究推測高壓均質(zhì)作用下卵磷脂結(jié)合到大豆蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)中的疏水性氨基酸區(qū)域，表現(xiàn)為α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低，β-折疊結(jié)構(gòu)及β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量升高。經(jīng)過不同條件高壓均質(zhì)處理后，蛋白質(zhì)中二級(jí)結(jié)構(gòu)含量均發(fā)生了明顯的變化。

2.2 大豆蛋白側(cè)鏈結(jié)構(gòu)特征拉曼光譜分析

如表4所示，色氨酸在拉曼譜圖上表現(xiàn)出多個(gè)拉曼譜帶用于監(jiān)測蛋白質(zhì)微環(huán)境極性及氫鍵變化規(guī)律，LI-CHAN[26]研究表明760 cm-1附近區(qū)域的拉曼峰強(qiáng)度降低與色氨酸殘基由原本“包埋式”轉(zhuǎn)變?yōu)椤氨┞妒健庇嘘P(guān)。已有研究表明熱變性造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，進(jìn)而引起色氨酸殘基的暴露，在拉曼譜圖中表現(xiàn)為色氨酸譜帶強(qiáng)度的降低[27-30]。然而，在本研究中，超聲處理下760 cm-1附近區(qū)域的色氨酸拉曼峰強(qiáng)度增加，該區(qū)域歸屬于色氨酸殘基的伸縮振動(dòng)，表明此條件下色氨酸殘基更趨于“暴露態(tài)”。而高壓均質(zhì)作用下大豆蛋白色氨酸微環(huán)境并未發(fā)生顯著變化。

與磷脂酰膽堿的交互作用下，大豆蛋白的色氨酸拉曼光譜強(qiáng)度有所增大，這是由于交互作用下大豆蛋白色氨酸被重新包裹進(jìn)入分子內(nèi)部，另一可能原因是大豆蛋白與磷脂酰膽堿交互作用位點(diǎn)為蛋白質(zhì)的疏水側(cè)鏈基團(tuán)。超聲處理及高壓均質(zhì)作用下色氨酸拉曼光譜歸屬峰強(qiáng)度顯著增大，進(jìn)一步驗(yàn)證了超聲處理及高壓均質(zhì)作用更大程度地促進(jìn)了大豆蛋白-磷脂酰膽堿的交互作用。

表4 不同處理?xiàng)l件下大豆蛋白側(cè)鏈基團(tuán)譜帶強(qiáng)度Tab.4 Intensities of tryptophan band, tyrosyl doublet of soy protein with different treatments

850 cm-1和830 cm-1是酪氨酸殘基苯環(huán)的呼吸振動(dòng)和面外彎曲倍頻之間的費(fèi)米共振[30]，通過兩條譜線的強(qiáng)度比，推測酪氨酸是氫鍵的供體或是受體。若I850/I830比值為2.5，酪氨酸苯環(huán)上的羥基氧原子是強(qiáng)氫鍵受體；如果I850/I830比值為1.25，此時(shí)酪氨酸苯環(huán)上的羥基氧原子為中強(qiáng)度氫鍵的供體或受體；如果比值為0.3，表明酪氨酸苯環(huán)上的羥基氧原子是強(qiáng)氫鍵的供體。在本研究中，I850/I830比值分布于0.99～1.06之間，表明所測試蛋白的酪氨酸殘基暴露于溶液的極性微環(huán)境下作為中性強(qiáng)度氫鍵的供體或受體。

通過比較可知，超聲處理及高壓均質(zhì)作用均顯著提高了大豆蛋白酪氨酸拉曼歸屬峰強(qiáng)度，表明兩者作用下大豆蛋白酪氨酸殘基更趨于“暴露態(tài)”，而大豆蛋白-磷脂酰膽堿交互作用下大豆蛋白酪氨酸拉曼歸屬峰強(qiáng)度有所降低，進(jìn)一步驗(yàn)證了大豆蛋白與磷脂酰膽堿交互作用位點(diǎn)可能為蛋白質(zhì)的疏水側(cè)鏈基團(tuán)。

1 450 cm-1是脂肪族氨基酸的拉曼歸屬譜線，研究表明脂肪族氨基酸的拉曼歸屬峰強(qiáng)度降低與脂肪族氨基酸暴露有關(guān)[28]，在本研究中超聲處理及高壓均質(zhì)作用下大豆蛋白在1 450 cm-1處的拉曼歸屬峰均有顯著降低、脂肪族氨基酸趨于“暴露態(tài)”，這與大豆蛋白結(jié)構(gòu)的局部解折疊及二級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變有關(guān)[27]。而交互作用下大豆蛋白脂肪族氨基酸拉曼歸屬譜帶強(qiáng)度均有所增大，這是由于交互作用下脂肪族氨基酸更多包埋于分子內(nèi)部的原因。而超聲處理及高壓均質(zhì)處理并未進(jìn)一步改變大豆蛋白-磷脂酰膽堿復(fù)合物中蛋白質(zhì)脂肪族氨基的譜帶強(qiáng)度。

2.3 大豆蛋白二硫鍵構(gòu)型的拉曼光譜分析

二硫鍵是蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的重要維持力，500～550 cm-1范圍內(nèi)是二硫鍵的特征譜帶。二硫鍵在不同振動(dòng)模式下所反映出來的拉曼位移有所不同，如500～510 cm-1處為g-g-g(旁-旁-旁)模式，515～525 cm-1為g-g-t(旁-旁-反)模式，535～545 cm-1為t-g-t(反-旁-反)模式[17]。由圖1可知，大豆蛋白二硫鍵拉曼歸屬峰位于516 cm-1處，表明大豆蛋白二硫鍵主要構(gòu)型為g-g-t模式，而超聲處理、高壓均質(zhì)作用下，大豆蛋白二硫鍵構(gòu)型未發(fā)生顯著變化，仍保持g-g-t振動(dòng)模式。而大豆蛋白-磷脂酰膽堿交互作用也未改變二硫鍵構(gòu)型，表現(xiàn)為大豆蛋白-磷脂酰膽堿復(fù)合體系組的二硫鍵拉曼歸屬峰均位于515～520 cm-1范圍內(nèi)。

2.4 磷脂酰膽堿結(jié)構(gòu)的拉曼光譜分析

拉曼光譜中的C—C骨架振動(dòng)可以用來表征磷脂酰膽堿脂鏈的反式-旁式構(gòu)象變化。面內(nèi)和面外的C—C伸縮振動(dòng)出現(xiàn)在1 000～1 200 cm-1區(qū)域內(nèi)，其中1 064 cm-1和1 129 cm-1譜線代表了C—C鏈反式構(gòu)象的伸縮振動(dòng)，而1 090 cm-1譜線則歸屬于C—C鍵扭曲式異構(gòu)體的貢獻(xiàn)[31]。在本研究中考慮到大豆蛋白的拉曼吸收，采用差譜對(duì)磷脂酰膽堿的結(jié)構(gòu)進(jìn)行光譜分析，通過I1090/I1064及I1090/I1129表示脂鏈的無序程度，具體結(jié)果如表5所示。

表5 不同處理?xiàng)l件下磷脂酰膽堿I1090/I1064及I1090/I1129拉曼峰強(qiáng)度Tab.5 Normalized intensities of I1090/I1064 and I1090/I1129 soybean protein- phosphatidyl choline with different treatments

由表5可知，超聲處理及高壓均質(zhì)作用下，磷脂酰膽堿的拉曼峰高強(qiáng)度比值I1090/I1064及I1090/I1129均有所增加，表明磷脂酰膽堿脂鏈中C—C的旁式構(gòu)象增多，脂鏈的無序性增強(qiáng)，這是由于大豆蛋白與磷脂酰膽堿在超聲處理及高壓均質(zhì)作用下表現(xiàn)出更強(qiáng)的交互作用，進(jìn)一步證明大豆蛋白-磷脂酰膽堿的交互作用位點(diǎn)為大豆蛋白疏水氨基酸側(cè)鏈及磷脂酰膽堿疏水脂鏈，兩者之間的疏水作用是大豆蛋白-磷脂酰膽堿交互作用的主要形式。

3 結(jié)束語

以大豆蛋白、磷脂酰膽堿為原料，通過拉曼光譜分析大豆蛋白-磷脂酰膽堿復(fù)合物與大豆蛋白的各種功能鍵與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，超聲處理及高壓均質(zhì)處理均提高了大豆蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量，并降低了大豆蛋白的β-構(gòu)型結(jié)構(gòu)。大豆蛋白-磷脂酰膽堿交互作用顯著降低了蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)，并轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)及β-折疊結(jié)構(gòu)。超聲處理及高壓均質(zhì)作用下大豆蛋白-磷脂酰膽堿復(fù)合物中蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)均低于高速分散處理組，而β-折疊結(jié)構(gòu)及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量較高。與磷脂酰膽堿復(fù)合后，超聲、高壓均質(zhì)作用改變了大豆蛋白色氨酸、酪氨酸所處的微環(huán)境，具體表現(xiàn)為大豆蛋白色氨酸拉曼光譜強(qiáng)度有所增大以及色氨酸、酪氨酸殘基由“包埋態(tài)”趨于“暴露態(tài)”。進(jìn)一步證明因超聲處理及高壓均質(zhì)作用而暴露的疏水性基團(tuán)使其更易與磷脂酰膽堿發(fā)生疏水相互作用，更大程度地促進(jìn)了大豆蛋白-磷脂酰膽堿的交互作用。大豆蛋白-磷脂酰膽堿的交互作用位點(diǎn)為大豆蛋白疏水氨基酸側(cè)鏈及磷脂酰膽堿疏水脂鏈，兩者之間的疏水作用是大豆蛋白-磷脂酰膽堿交互作用的主要形式。超聲處理、高壓均質(zhì)作用下，大豆蛋白二硫鍵構(gòu)型未發(fā)生顯著變化，仍保持g-g-t振動(dòng)模式。蛋白-磷脂酰膽堿交互作用也未改變二硫鍵構(gòu)型。本研究為超聲、高壓均質(zhì)作用于大豆蛋白-磷脂酰膽堿復(fù)合產(chǎn)品提供了一定的理論依據(jù)。

1 MA L, LI B, HAN F, et al. Evaluation of the chemical quality traits of soybean seeds, as related to sensory attributes of soymilk [J]. Food Chemistry, 2015, 173:694-701.

2 McCANN T H, SMALL D M, BATEY I L, et al. Protein-lipid interactions in gluten elucidated using acetic acid fractionation [J]. Food Chemistry, 2009, 115(1):105-112.

3 McCRAE C H. Heat stability of milk emulsions: phospholipid-protein interactions [J]. International Dairy Journal, 1999, 9(3):227-231.

4 NIEUWENHUYZEN W V, SZUHAJ B F. Effects of lecithins and proteins on the stability of emulsions [J]. Lipid, 1998, 100(7):282-291.

5 BECKWITH A C. Interaction of phosphatidylocholine vesicles with soybean 7S and 11S globulin proteins [J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 1984, 32(6):1397-1402.

6 WAGNER J R, TOMAS M C, LUPANO C E. Influence of pH-calcium relationship on soybean proteins-lecithin interaction and stability of oil in water (O/W) emulsions [J]. Functional Properties of Food Components, 2007:23-31.

7 FANG Y, DALGLEISH D G. Casein adsorption on the surfaces of oil-in-water emulsions modified by lecithin [J]. Colloids & Surfaces B Biointerfaces, 1993, 1(6):357-364.

8 MANTOVANI R A, CAVALLIERIL, NETTO F M, et al. Stability and in vitro digestibility of emulsions containing lecithin and whey proteins [J]. Food & Function, 2013, 4(9):1322-1331.

9 PONGSAWATMANIT R, HARNSILAWAT T, MCCLEMENTS D J. Influence of alginate, pH and ultrasound treatment on palm oil-in-water emulsions stabilized by β-lactoglobulin[J]. Colloids & Surfaces A Physicochemical & Engineering Aspects, 2006, 287(1-3):59-67.

LI Jufang, Lü Ying, XU Jingting, et al. Solution physicochemical properties and rheological behavior of lecithin-soybean protein complex [J/OL]. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2013, 44(8):207-212.(in Chinese)

11 PUPPO C, CHAPLEAU N, SPERONI F, et al. Physicochemical modifications of high-pressure-treated soybean protein isolates [J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2004, 52(6):1564-1571.

12 涂宗財(cái), 汪菁琴, 阮榕生,等. 超高壓均質(zhì)對(duì)大豆分離蛋白功能特性的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2006, 27(1):66-67.

TU Zongcai, WANG Qingqin, RUAN Rongsheng, et al. Effect of ultrahigh pressure homogenization on functional properties of soybean protein isolate[J]. Science and Technology of Industry, 2006, 27(1):66-67.(in Chinese)

13 LEE S J, MCCLEMENTS D J. Fabrication of protein-stabilized nanoemulsions using a combined homogenization and amphiphilic solvent dissolution/evaporation approach [J]. Food Hydrocolloids, 2010, 24(6-7):560-569.

14 TAN C P, NAKAJIMA M. Effect of polyglycerol esters of fatty acids on physicochemical properties and stability of beta-carotene nanodispersions prepared by emulsification/evaporation method[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 2005, 85(1):121-126.

15 HU H, WU J, LI-CHAN E C Y, et al. Effects of ultrasound on structural and physical properties of soy protein isolate (SPI) dispersions [J]. Food Hydrocolloids, 2013, 30(2):647-655.

16 DYBOWSKA B E. Rheology of whey protein O/W emulsions obtained by one and two stage homogenization [J]. Milchwissenschaft-milk Science International, 2001, 56(11):628-632.

17 HERRERO A M, JIMENEZCOLMENROI F, CARMONA P. Elucidation of structural changes in soy protein isolate upon heating by Raman spectroscopy [J]. International Journal of Food Science & Technology, 2009, 44(4):711-717.

18 王中江, 張瀟元, 隋曉楠,等. 熱處理大豆蛋白體外消化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特征分析[J]. 食品科學(xué), 2017,38(1):20-26.

WANG Zhongjiang, ZHANG Xiaoyuan, SUI Xiaonan, et al. Structural characteristics of in vitro digestion products of heat-treated soybean protein[J]. Food Science, 2017,38(1):20-26. (in Chinese)

19 黃群, 金永國, 馬美湖,等. 超高壓處理對(duì)S-卵白蛋白構(gòu)象與功能特性的影響[J/OL]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào), 2013, 44(3):161-166.http:∥www.j-csam.org/jcsam/ch/reader/view_abstract.aspx?flag=1&file_no=20130330&journal_id=jcsam.DOI:10.6041/j.issn.1000-1298.2013.03.030.

HUANG Qun, JIN Yongguo, MA Meihu, et al. Effect of ultra high pressure on conformation and functional properties of S-ovalbumin[J/OL]. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2013, 44(3):161-166. (in Chinese)

20 畢爽, 李楊, 隋曉楠,等. 高壓均質(zhì)對(duì)大豆蛋白-磷脂復(fù)合體系結(jié)構(gòu)及理化/功能性質(zhì)的影響[J].食品科學(xué), 2017,38(5):148-153.

BI Shuang, LI Yang, SUI Xiaonan, et al. Effect of high pressure homogenization on structural, physicochemical and functional properties of soybean protein-lecithin composite system[J]. Food Science, 2017, 38(5): 148-153. (in Chinese)

21 FLOURY J, DESRUMAUX A, LARDIERES J. Effect of high-pressure homogenization on droplet size distributions and rheological properties of model oil-in-water emulsions [J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2000, 1(2):127-134.

22 張媛. 超高壓均質(zhì)對(duì)大豆分離蛋白影響及制備復(fù)合蛋白膜研究[D].哈爾濱： 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

ZHANG Yuan.Effect of ultra-high pressure homogenization on soybean protein isolate and study on preparation of composite protein films[D]. Harbin: Northeast Agricultural University, 2016. (in Chinese)

23 包中宇. 超聲波技術(shù)對(duì)大豆分離蛋白功能性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及凝膠特性的影響[D].南昌： 南昌大學(xué), 2015.

BAO Zhongyu.Effects on the functional, structural and gelation property of soybean protein isolate treated by ultrasound[D]. Nanchang: Nanchang University, 2015. (in Chinese)

24 GULSEREN I, GUZEY D, BRUCE B D, et al. Structural and functional changes in ultrasonicated bovine serum albumin solutions [J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2007, 14(2):173-183.

25 CHANDRAPALA J, ZISU B, PALMER M, et al. Effects of ultrasound on the thermal and structural characteristics of proteins in reconstituted whey protein concentrate [J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2011, 18(5):951-957.

26 LI-CHAN E C Y. The applications of Raman spectroscopy in food science [J]. Trends in Food Science & Technology, 1996, 7(11):361-370.

27 XU X L, HAN M Y, FEI Y, et al. Raman spectroscopic study of heat-induced gelation of pork myofibrillar proteins and its relationship with textural characteristic [J]. Meat Science, 2011, 87(3):159-164.

28 HERRERO A M. Raman spectroscopy for monitoring protein structure in muscle food systems [J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2008, 48(6):512-523.

29 NGARIZE S, ADAMS A, HOWELL N K. Studies on egg albumen and whey protein interactions by FT-Raman spectroscopy and rheology [J]. Food Hydrocolloids, 2004, 18(1):49-59.

30 FERRER E G, GOMEZ A V, ANON M C, et al. Structural changes in gluten protein structure after addition of emulsifier. A Raman spectroscopy study [J]. Spectrochimica Acta Part A Molecular & Biomolecular Spectroscopy, 2011, 79(1):278-281.

31 許以明. 拉曼光譜及其在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2005.