瓊脂-牛乳蛋白酸凝膠微流變特征研究

孫 健 牛天嬌 常圓圓 羅 潔 張 昊 李 媛

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院， 北京 100083； 2.蒙牛高科乳制品(北京)有限責(zé)任公司， 北京 101107；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院， 哈爾濱 150001)

0 引言

酸奶在運(yùn)輸過程中的脫冷和顛簸會(huì)引起其在銷售過程出現(xiàn)乳清析出、凝塊不結(jié)實(shí)等問題，由于多糖的保水性和增稠性，添加適量多糖可以增強(qiáng)酸誘導(dǎo)蛋白凝膠的凝膠強(qiáng)度，有效改善酸奶的乳清析出和凝塊不結(jié)實(shí)問題[1-2]。瓊脂是一種親水性多糖，在高溫溶液中為單螺旋結(jié)構(gòu)，隨著溫度降低，分子轉(zhuǎn)變成雙螺旋結(jié)構(gòu)并通過氫鍵相互連結(jié)，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[3-4]。目前關(guān)于瓊脂在酸奶中的應(yīng)用研究多從力學(xué)流變和質(zhì)構(gòu)儀方面分析瓊脂或者含有瓊脂的復(fù)配穩(wěn)定劑對(duì)牛乳發(fā)酵形成凝膠過程的影響[5-6]，尚未有瓊脂對(duì)酸奶整個(gè)發(fā)酵和冷卻過程的研究。

微流變學(xué)是通過追蹤體系中粒子運(yùn)動(dòng)來表征樣品的黏彈性變化，可在不破壞樣品的前提下研究樣品流變特性，其靈敏度高于機(jī)械流變學(xué)，現(xiàn)其已成功用于研究凝乳酶誘導(dǎo)的酪蛋白凝膠流變特性[7-8]。流變動(dòng)力學(xué)可以反映酸奶流變學(xué)特性隨時(shí)間的變化規(guī)律，酸奶發(fā)酵過程中的流變特性影響酸奶質(zhì)構(gòu)，進(jìn)而影響口感。通過流變動(dòng)力學(xué)對(duì)酸奶發(fā)酵過程進(jìn)行描述，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)酸奶產(chǎn)品凝膠強(qiáng)度等的預(yù)測(cè)，為工業(yè)生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。目前，關(guān)于酸奶發(fā)酵過程流變動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的研究尚未見報(bào)道，本文使用微流變測(cè)試手段，對(duì)瓊脂-脫脂乳混合體系的發(fā)酵冷卻過程進(jìn)行研究，通過考察不同體系黏彈性隨時(shí)間的變化關(guān)系，建立瓊脂-牛乳蛋白混合體系特性發(fā)酵流變動(dòng)力學(xué)模型，為瓊脂在酸奶中的生產(chǎn)應(yīng)用提供必要的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂乳粉(丹麥Arla Food Ingredients公司，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)32.6%)，瓊脂(青島利邦達(dá)海洋科技有限公司)，菌種YO-MIX 387 LYO(丹麥Danisco公司)。

ALC-210型分析天平(德國Acculab公司)，DK-8B型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，APV-1000型均質(zhì)機(jī)(德國APV公司)，SW-CJ-2FD型超凈臺(tái)(蘇景集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，SKP028型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，PHMS-410605型 pH計(jì)(瑞士Mettler Toledo公司)，Rheolaser LAB型微流變儀(法國Formulaction公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1瓊脂-脫脂乳體系制作

稱取12 g脫脂奶粉，緩慢加入到88 g蒸餾水中，45℃攪拌30 min后轉(zhuǎn)移至4℃冰箱靜置12 h，完成復(fù)原乳的制備。取出復(fù)原乳，恢復(fù)室溫(20℃)后置于磁力攪拌器上，中速攪拌。稱取一定質(zhì)量的瓊脂，緩慢加入到正在磁力攪拌的燒杯中進(jìn)行初步分散。將初步分散結(jié)束的瓊脂-復(fù)原乳溶液用保鮮膜封口，置于90℃帶水浴鍋中，磁力攪拌加熱1 h，即溶解完畢，隨后將樣品冷卻至42℃，加入0.004 U的菌種YO-MIX 387LYO，攪拌均勻備用。

1.2.2微流變特性測(cè)試

取出配置好的瓊脂-脫脂乳溶液20 mL，轉(zhuǎn)移至微流變儀專用樣品池中，將樣品池插入微流變儀，運(yùn)行測(cè)量程序，分析瓊脂-牛乳蛋白酸凝膠的形成過程。溫度設(shè)置：0～5 h為42℃，5 h時(shí)設(shè)置為10℃。

1.2.3流變特性和動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)分析

顆粒的均方位移(MSD)是樣品粒子散射軌跡的平均值。MSD曲線可以直接從微流變儀中得到，從MSD曲線可以得到樣品相關(guān)信息，如彈性因子(EI)、黏性因子(MVI)和晶格尺寸[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。利用軟件SPSS 21.0進(jìn)行Duncan’s判斷：P<0.05判斷為顯著性差異；P≥0.05判斷為不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂-脫脂乳混合凝膠彈性因子變化

圖1為在恒溫發(fā)酵過程中，沒有添加瓊脂的脫脂乳樣品和添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)瓊脂的樣品凝膠表征結(jié)構(gòu)生成的EI值隨時(shí)間的變化曲線。EI與凝膠彈性變化一致，EI值越大，凝膠的彈性越強(qiáng)，EI與凝膠的性質(zhì)(如網(wǎng)格大小、硬度、凝膠化過程的速度、剪切后恢復(fù)程度)有關(guān)[9]。從圖1可以看出，同一樣品的EI值在發(fā)酵初期(發(fā)酵約3 h內(nèi))并無明顯變化。這說明在發(fā)酵初期酪蛋白的結(jié)構(gòu)并無變化，沒有酪蛋白和瓊脂網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成。有研究表明，在脫脂乳發(fā)酵的初級(jí)階段，膠體中的磷酸氫鈣由于pH值的逐漸降低開始逐漸溶解，造成酪蛋白膠束融合，酪蛋白離解和重排，這一過程是膠體磷酸鈣在凝膠網(wǎng)絡(luò)中溶液化的過程[10]，添加瓊脂并沒有對(duì)這一過程產(chǎn)生影響。

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)瓊脂對(duì)酸奶發(fā)酵過程彈性因子的影響Fig.1 Effect of agar concentration on EI of yoghurt fermentation

相分離動(dòng)力學(xué)和凝膠動(dòng)力學(xué)將決定混合體系在酸化結(jié)束時(shí)的流變學(xué)狀態(tài)[11-12]。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加(發(fā)酵3 h后)，體系的pH值繼續(xù)下降，所有樣品EI值開始明顯增加。大約在30 min后，凝膠的EI增加速度才逐漸變緩和，不同濃度對(duì)于凝膠快速形成階段的起始和結(jié)束時(shí)間沒有明顯影響，由此可以得出在恒溫發(fā)酵階段，添加瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.025%～0.5%范圍內(nèi)時(shí)，瓊脂和熱脫脂乳中的蛋白質(zhì)形成互溶體系，兩者沒有相互作用。

圖2為酸奶在冷卻放置后熟階段，EI隨時(shí)間變化的曲線。在冷卻后熟階段的溫度遠(yuǎn)低于瓊脂的凝膠點(diǎn)(此溫度下，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025%的瓊脂不形成凝膠)。在初期階段，所有樣品表征結(jié)構(gòu)的EI均有所增加，并且凝膠的EI值隨添加瓊脂濃度的增加而增加，但樣品的EI值隨后熟時(shí)間變化不明顯。這表明瓊脂(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.025%～0.5%)能夠增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度，并且在后熟階段對(duì)樣品的結(jié)構(gòu)無明顯影響，該結(jié)果與ROCHA等[13]研究乳清蛋白-刺槐豆膠凝膠結(jié)果相似。

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)瓊脂對(duì)酸奶冷藏后熟過程彈性因子的影響Fig.2 Effect of agar concentration on EI of yoghurt cold storage

當(dāng)瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025%時(shí)，瓊脂的添加使得樣品EI值增加，這是由酪蛋白膠束和瓊脂分子之間的排空相互作用所引起的。當(dāng)兩個(gè)酪蛋白膠束粒子相互靠近時(shí)，它們的排空層開始重疊，聚合物被排除出粒子間的重疊區(qū)域，溶液中和粒子重疊區(qū)域間聚合物的濃度存在差異，導(dǎo)致了酪蛋白膠束粒子間的有效吸引增強(qiáng)，從而表現(xiàn)為EI增加[14]。當(dāng)瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.05%～0.5%范圍內(nèi)時(shí)，瓊脂的增加使得樣品EI增加，可能有兩方面原因：一方面，酪蛋白膠束和瓊脂分子之間存在排空相互作用；另一方面，由于瓊脂分子在高溫是舒展的，隨著溫度下降，瓊脂分子收縮，形成質(zhì)點(diǎn)，其可以均勻分散在酪蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，隨著溫度的降低，瓊脂質(zhì)點(diǎn)之間發(fā)生相互作用并形成連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[15]。

2.2 瓊脂-脫脂乳混合凝膠黏性因子變化

由圖3可知，發(fā)酵前3 h樣品的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)尚未形成(EI值無明顯變化)，此時(shí)瓊脂-脫脂乳混合體系的MVI值顯著高于脫脂乳體系，表明瓊脂增加了未形成凝膠時(shí)樣品黏度，這是由于瓊脂自身具有增稠性。網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成后各個(gè)樣品的MVI值無顯著性差異，這可能是由于在3 h之后樣品開始形成凝膠，樣品的MVI值急速增加并且在數(shù)值上明顯高于瓊脂自身的MVI值(P<0.05)，此時(shí)瓊脂的添加引起的MVI變化不明顯。

圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)瓊脂對(duì)酸奶發(fā)酵、冷藏后熟過程黏性因子的影響Fig.3 Effect of agar concentration on MVI of yoghurt fermentation and cold storage

2.3 瓊脂-脫脂乳混合凝膠網(wǎng)格晶格尺寸的變化

由圖4可知，在恒溫發(fā)酵初期凝膠的晶格尺寸無明顯變化，隨后隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，晶格尺寸急劇減小，晶格尺寸越小，凝膠彈性越大，表明酸凝過程中網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成，并越來越細(xì)致緊密[16]。這是由于隨著溫度的下降，形成的瓊脂的質(zhì)點(diǎn)增多，瓊脂之間相互靠近形成分子間氫鍵，構(gòu)成瓊脂的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。瓊脂凝膠結(jié)構(gòu)填充了酪蛋白凝膠的空間，使酪蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)孔隙尺寸進(jìn)一步減小，彈性增加[17]。

圖4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)瓊脂對(duì)酸奶發(fā)酵、冷藏后熟過程晶格尺寸的影響Fig.4 Effect of agar concentration on mesh size of yoghurt fermentation and cold storage

2.4 瓊脂-脫脂乳混合凝膠動(dòng)力學(xué)分析

酸奶中的酪蛋白和瓊脂形成凝膠的過程中，瓊脂分子和酪蛋白相互纏繞，未參與纏繞的分子鏈逐漸減少，最終形成了具有空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠，從而影響到相應(yīng)的流變學(xué)特性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出的EI變化曲線可以用類似非牛頓流體Cross模型的流變動(dòng)力學(xué)方程很好地?cái)M合[18]，即

式中E0——初始彈性因子，nm-2

Emax——終態(tài)彈性因子，nm-2

E——實(shí)驗(yàn)測(cè)定的彈性因子，nm-2

k——發(fā)酵過程結(jié)構(gòu)變化速率常數(shù)，h-1

n——依賴系數(shù)

t——時(shí)間，h

瓊脂-脫脂乳混合體系的交聯(lián)流變動(dòng)力學(xué)方程模型參數(shù)值如表1所示。通過此模型擬合獲得的決定系數(shù)R2均不低于0.970，證明模型適用。

表1 流變動(dòng)力學(xué)方程擬合參數(shù)Tab.1 Parameters of rheological kinetic equation

注：同一列不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

由圖5和表1可以看出，改變瓊脂的濃度對(duì)脫脂乳體系的交聯(lián)過程影響有兩部分。隨著瓊脂濃度的增加，交聯(lián)結(jié)束時(shí)體系的彈性因子增加，這是由于較高濃度瓊脂酸奶的凝膠更加致密和粗壯[19-20]。當(dāng)瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于等于0.1%時(shí)，瓊脂濃度的增加使交聯(lián)體系的初始彈性因子增大，這時(shí)因?yàn)樵诃傊瑵舛仍龃蠛?，由于瓊脂自身具有的黏彈性使得混合體系溶液的彈性增強(qiáng)，初始EI值增大[21]。

圖5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)瓊脂下體系EI隨時(shí)間變化規(guī)律Fig.5 Changes of EI in different agar concentrations system

當(dāng)瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于等于0.05%時(shí)，k值隨著瓊脂的增加而降低，這可能是由于瓊脂的加入增加了體系的粘度，從而降低了蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的速度，這與BI等[1]研究含有不同濃度刺槐豆膠的大豆分離蛋白-刺槐豆膠凝膠過程的結(jié)果一致。從表1中可以看出，隨著瓊脂濃度的增加，k減小，這表明瓊脂濃度對(duì)酸奶的交聯(lián)速度有影響，在一定范圍內(nèi)(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0～0.5%)，瓊脂濃度增大降低了蛋白之間的有效碰撞幾率，從而結(jié)構(gòu)變化速率常數(shù)變低。

3 結(jié)束語

采用微流變儀研究了瓊脂-脫脂乳混合體系凝膠特征。結(jié)果表明，瓊脂-脫脂乳混合酸凝膠和脫脂乳酸凝膠的恒溫發(fā)酵彈性因子變化趨勢(shì)相似，但瓊脂會(huì)增強(qiáng)混合凝膠冷卻后熟階段的彈性因子；瓊脂-脫脂乳混合體系的黏性因子僅在未形成凝膠網(wǎng)絡(luò)前比脫脂乳凝膠高，在恒溫發(fā)酵的其他時(shí)間和冷卻后熟階段二者無顯著差別。由此可以得出，添加瓊脂可以增加凝固型酸奶的凝膠強(qiáng)度，但對(duì)其發(fā)酵過程并無顯著影響。酸奶的最終食用特性與發(fā)酵過程中的流變特性密切相關(guān)，流變動(dòng)力學(xué)揭示了酸奶的流變學(xué)特性隨時(shí)間的變化規(guī)律。利用微流變技術(shù)對(duì)酸奶發(fā)酵過程進(jìn)行描述，可以更好地掌握和預(yù)測(cè)酸奶流變特性，為工業(yè)生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 BI C H, LI D, WANG L J, et al. Effect of LBG on the gel properties of acid-induced SPI gels [J]. LWT—Food Science and Technology, 2017, 75:1-8.

2 胡文娥,林士強(qiáng).食用明膠對(duì)凝固型酸奶質(zhì)量的影響探究[J]. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2015，33(6): 22-25.

3 王璐,劉力,王艷梅,等.幾種紅藻瓊脂的組分結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的比較[J]. 海洋與湖沼, 2001, 32(6):658-664.

WANG L, LIU L, WANG Y M, et al. The comparation of several algal agar’s composition and physicochemical properties[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2001, 32(6):658-664.(in Chinese)

4 STEPHEN A M, PHILLIPS G O, WILLIAMS P A. Food polysaccharides and their applications[M]. Boca Raton, FL:CRC Taylor & Francis, 2006.

5 趙曉麗,李潔慧,宮春波,等.穩(wěn)定劑添加對(duì)發(fā)酵型酸奶發(fā)酵效果的影響[J].中國食品添加劑, 2011(1):182-186.

ZHAO X L, LI J H, GONG C B, et al. Effect of the stabilizers in yoghurt fermentation[J]. China Food Additives, 2011(1):182-186.(in Chinese)

6 張國棟,馬力,潘曉亞,等.增稠劑對(duì)凝固型酸奶品質(zhì)的影響研究[J]. 中國乳品工業(yè), 2005, 33(7):31-32.

ZHANG G D, MA L, PAN X Y, et al. Influence of thickeners on the quality of yoghurt [J]. China Dairy Industry, 2005, 33(7):31-32.(in Chinese)

7 ALEXANDER M, DALGLEISH D G. Dynamic light scattering techniques and their applications in food science [J]. Food Biophysics, 2006, 1(1):2-13.

8 HEMAR Y, SINGH H, HORNE D S. Determination of early stages of rennet-induced aggregation of casein micelles by diffusing wave spectroscopy and rheological measurements [J]. Current Applied Physics, 2004, 4(2):362-365.

9 MIN W, YANG X Q. Effects of molecular weight of dextran on the rheological behavior and texture properties of soy protein isolate cold-set gels[J]. Science & Technology of Food Industry, 2010, 31(5):71-72.

10 GASTALDI E, LAGAUDE A, FUENTE B T D L. Micellar transition state in casein between pH 5.5 and 5.0[J]. Journal of Food Science, 2010, 61(1):59-64.

11 L?FGREN C, PERNILLA W A, HERMANSSON A M. Microstructure and rheological behavior of pure and mixed pectin gels[J]. Biomacromolecules, 2002, 3(6):1144-1153.

12 TADROS T. Protein-polysaccharide interaction[M]. Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 2013.

13 ROCHA C, TEIXEIRA J A, HILLIOU L, et al. Rheological and structural characterization of gels from whey protein hydrolysates/locust bean gum mixed systems [J]. Food Hydrocolloids, 2009, 23(7):1734-1745.

14 DOUBLIER J L, GARNIER C, RENARD D, et al. Protein-polysaccharide interactions [J]. Canadian Institute of Food Science & Technology Journal, 2000, 5(3-4):202-214.

15 ZHANG G, FOEGEDING E A. Heat-induced phase behavior of β-lactoglobulin/polysaccharide mixtures [J]. Food Hydrocolloids, 2003, 17(6):785-792.

16 OELSCHLAEGER C, SCHOPFERER M, SCHEFFOLD F, et al. Linear-to-branched micelles transition: a rheometry and diffusing wave spectroscopy (DWS) study [J]. Langmuir, 2009, 25(2):716.

17 TIWARI S, BHATTACHARYA S. Aeration of model gels: rheological characteristics of gellan and agar gels [J]. Journal of Food Engineering, 2011, 107(1):134-139.

18 MA M, FANG B, LU Y, et al. Intrinsic rheo-kinetics on gelation process of hydrophobic amphoteric cellulose[J]. Journal of Dispersion Science & Technology, 2016, 37(8):1076-1082.

19 SHI A M, WANG L J, LI D, et al. Characterization of starch films containing starch nanoparticles. Part 2: viscoelasticity and creep properties [J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 96(2):602-610.

20 CURA D E, LILLE M, PARTANEN R, et al. Effect of trichoderma reesei tyrosinase on rheology and microstructure of acidified milk gels[J]. International Dairy Journal, 2010, 20(12):830-837.

21 HEMAR Y, PINDER D N. DWS microrheology of a linear polysaccharide[J]. Biomacromolecules, 2006, 7(3):674-677.