藏仔豬致病性大腸桿菌疫苗的制備及效果評價

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致病性大腸桿菌是目前集約化養(yǎng)豬場中最為常見，也是最為嚴重的仔豬病原菌之一，其主要引起仔豬腹瀉癥狀，據(jù)研究，我國每年仔豬因腹瀉死亡占仔豬死亡總數(shù)的39.8%[1-2]。仔豬腹瀉不僅造成仔豬生長性能緩慢而且引起仔豬生長發(fā)育停滯(即所謂的僵豬)，嚴重影響藏區(qū)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。近年來，隨著西藏規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)的迅速發(fā)展，豬大腸桿菌病在西藏流行，豬腹瀉疾病幾乎遍布所有的豬場，發(fā)病率升高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來的經(jīng)濟損失越來越嚴重。同時，由于濫用抗生素等導致耐藥性菌株的數(shù)量不斷增多，加大了該病治療難度[3-5]。

疫苗免疫接種是有效預防傳染性疾病的主要手段，但西藏地區(qū)居住分散，科學教育基礎差，動物疫苗接種推行和普及困難。研究西藏仔豬的腸道傳染病的流行菌株，流行區(qū)域以及感染狀況，針對疫苗接種過程中一般的注射免疫在藏區(qū)操作困難的問題，迫切需要探索新的疫苗和新的免疫策略，這對西藏養(yǎng)豬行業(yè)有非常重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 采集西藏某豬場死亡藏仔豬組織，裝入自封袋，編號；KM小鼠購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.1.2主要試劑 普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍平板、生化培養(yǎng)基均由西藏大學農(nóng)牧學院動物科學學院高原動物疫病檢測中心制備。LB培養(yǎng)基，卡那霉素、氯霉素等儲存液由四川大學華西基礎醫(yī)學院與法醫(yī)學院微生物學實驗室制備。甘露醇購自成都科龍化工，重組質(zhì)粒pET28a(+)/CTB由課題組構(gòu)建,表達純化由四川萬可泰生物技術有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1細菌分離與鑒定 無菌取出待檢組織，接種在普通平板上，在37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察生長情況，并進行革蘭染色鏡檢。挑取普通平板上典型菌落分別接種在麥康凱及伊紅美藍瓊脂平板上，37 ℃，培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。挑取大腸桿菌典型菌落分別進行生化鑒定和血清型鑒定，同時分離菌用致病性大腸桿菌菌株16S RNA 19-1523 bp特異序列引物進行PCR擴增， 擴增產(chǎn)物在含2%瓊脂糖凝膠中電泳。具體引物和擴增目的片段如下表1。

表1 大腸桿菌菌株16S RNA特異序列引物16S rRNA序列引物
Tab.1 Pathogenic E. coli primers of 16S specific sequences RNA

PrimersSequences(5′?3′)SitesoftheprimersProduct/bpP1ATGGCTCAGATTGAACGC19?371505P2CAGGTTCCCCTACGGTTA1505?1523—

1.2.2重組霍亂毒素B亞單位的表達與純化 將重組霍亂毒素B亞單位工程菌接種于LB液體培養(yǎng)基，增菌培養(yǎng)，至A600≈0.6加入終濃度為1 mmol/L IPTG誘導蛋白的表達。收集菌液，4 ℃，10 000 r/min離心10 min。沉淀按10 mL培養(yǎng)物加入1 mL Binding Buffe的比例加入緩沖液(同時加入PMSF至終濃度0.1 mmol/L)，吹打懸浮細菌。加入溶菌酶至終濃度為1 mg/mL，冰上放置30 min后置于4 ℃搖床上孵育10 min。在冰上超聲破碎細菌，300W，破碎10 s，間隔10 s，作用15 min。將超聲破碎后的菌液，4 ℃，10 000 r/min離心20 min，收集上清液與沉淀。最后將上清參照GE公司HisTrapTMHP純化柱說明書對表達的重組融合蛋白進行純化，獲得高純度rCTB，然后凍干，備用。

1.2.3疫苗制備 將大腸桿菌接種在LB固體平板上，放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)過夜；洗脫細菌，接種到1L LB液體培養(yǎng)基中，放于37 ℃恒溫搖床中，培養(yǎng)24 h；培養(yǎng)后1%甲醛滅活；6 000～8 000 r/min離心10～15 min，收集菌體；用3%～5%的甘露醇溶液重懸，分高、低細菌濃度調(diào)整疫苗含特異抗原的最終濃度，一部分作為不含佐劑的疫苗直接凍干，另一部分加入重組霍亂毒素B亞單位作為免疫佐劑再凍干，制備獲得仔豬大腸桿菌滅活苗和仔豬大腸桿菌滅活佐劑疫苗(白色疏松體，且加入蒸餾水3～8 min能完全溶解)。

1.2.4疫苗效果檢測 用含佐劑和不含佐劑的疫苗按0、14、28、42 d的免疫程序，分別每次每只100 μL肌肉注射免疫小鼠或每次每只200 μL口服免疫小鼠。免疫前后采集眼球血以及4次免疫完成后14 d取小鼠胃 、腸液、血液，用間接ELISA方法測定特異的抗大腸桿菌特異抗體IgG和IgA。每組末次免疫結(jié)束后第14 d，用2倍LD50的致病性大腸桿菌攻擊不同免疫處理的各組小鼠，觀察3 d，記錄攻擊感染小鼠的存活數(shù)，分別計算死亡率和保護率。

1.2.5疫苗免疫后副反應監(jiān)測 用含佐劑和不含佐劑的疫苗，按0、14、28、42 d的免疫程序，分別每次每只100 μL肌肉注射免疫小鼠或每次每只200 μL口服免疫小鼠。每次免疫后監(jiān)測各組小鼠的體重、被毛和精神狀況，與對照組比較，判斷疫苗免疫后小鼠的副反應。

2 結(jié) 果

2.1大腸桿菌分離鑒定 在普通平板上生長出圓形、光滑、濕潤、半透明、灰白色菌落，經(jīng)革蘭氏染色后發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性兩端鈍圓的直桿菌。在麥康凱瓊脂平板及伊紅美藍平板上分別形成紅色菌落和帶金屬閃光的菌落，并能發(fā)酵乳糖、葡萄糖、蔗糖，其中乳糖發(fā)酵最快，甘露醇、吲哚、甲基紅均陽性，VP、枸櫞酸、氧化酶呈陰性，血清型為O66，分離菌PCR擴增電泳結(jié)果在1 500 bp處可以見到1條清晰的特異目的條帶，大小與與預期結(jié)果相符，見圖1。

M: The molecular weight; 1,2,3,4,5,6 were detected E. coli strains圖1 致病性大腸桿菌16S RNA特異性序列PCR擴增結(jié)果Fig.1 Results of 16S specific sequence RNA of pathogenic E. coli by PCR

2.2 免疫效果

2.2.1抗體檢測 血清抗體IgG實驗結(jié)果見表2、圖2和圖3：肌注高劑量含佐劑組與高劑量不含佐劑組免疫效果相當，肌注低劑量含佐劑組比不含佐劑組免疫效果好；口服組無論是高劑量含佐劑組還是低劑量含佐劑組免疫效果均好于高、低劑量不含佐劑組，且高劑量免疫效果好于低劑量免疫效果。血清抗體IgA實驗結(jié)果見表3、圖4和圖5：肌注組無論是高、低劑量佐劑組和高、低劑量不含佐劑組均未在血清中產(chǎn)生特異IgA抗體，而口服高劑量佐劑組在免疫末期血清中產(chǎn)生了比較高的特異IgA抗體。從免疫次數(shù)看，無論是肌注還是口服組免疫4次的抗體水平明顯好于免疫1、2、3次的抗體水平。

表2 免疫不同時間不同組別血清抗體IgG的變化(A450)
Tab.2 Changes of serum antibodies IgG in different groups at different time (A450)

GroupsImmunetimes0d14d28d42d56d肌注組高劑量含佐劑組0．194±0．0230．386±0．0620．472±0．0520．578±0．0510．873±0．030高劑量組0．170±0．010．467±0．1270．502±0．1180．529±0．1150．781±0．021低劑量含佐劑組0．176±0．010．297±0．0570．361±0．0560．447±0．0670．758±0．033低劑量組0．135±0．0190．183±0．0430．245±0．0120．348±0．0580．704±0．037口服組高劑量含佐劑組0．160±0．0080．144±0．0060．200±0．0080．237±0．030．336±0．045高劑量組0．189±0．0090．096±0．0060．115±0．0090．156±0．0110．264±0．063低劑量含佐劑組0．147±0．0080．134±0．0410．173±0．0690．212±0．0890．309±0．122低劑量組0．165±0．0060．105±0．0240．120±0．0440．161±0．0680．224±0．018

表3 免疫不同時間不同組別血清抗體IgA的變化(A450)
Tab.3 Changes of serum antibodies IgA in different groups at different time (A450)

GroupsImmunetimes0d14d28d42d56d肌注組高劑量含佐劑0．071±0．0090．076±0．0060．067±0．0040．069±0．0060．070±0．069高劑量0．066±0．0060．070±0．0060．062±0．0070．061±0．0040．079±0．0056低劑量含佐劑0．073±0．0030．076±0．0060．068±0．0040．072±0．0030．073±0．0019低劑量0．066±0．0060．067±0．0050．060±0．0010．064±0．0020．078±0．0034口服組高劑量含佐劑0．072±0．0080．081±0．0050．078±0．0060．089±0．0050．280±0．14高劑量0．068±0．0060．075±0．0060．067±0．0070．072±0．0060．130±0．018低劑量含佐劑0．069±0．0040．072±0．0080．067±0．0030．078±0．0050．154±0．005低劑量0．071±0．0040．076±0．0090．066±0．0040．072±0．0080．120±0．005

從表2和表3中可看出，含佐劑和不含佐劑的大腸桿菌滅活疫苗的肌注組在血清，胃液，腸液中均可以產(chǎn)生特異IgG抗體，而口服組只在血清中產(chǎn)生特異IgG抗體，同時肌注組特異IgG抗體水平高于口服組，不含佐劑的肌注組、不含佐劑的大腸桿菌疫苗口服組和含佐劑的大腸桿菌疫苗的肌注組均不產(chǎn)生特異IgA抗體，而含佐劑的大腸桿菌疫苗口服組在血清和腸液中可以產(chǎn)生特異IgA抗體。

表4 不同疫苗組分和不同免疫途徑免疫小鼠后特異IgG抗體的變化(A450)
Tab.4 Changes of serum antibodies IgA in different groups at different time (A450)

組別Groups樣本Samples血清Serum腸液Intestinaljuice胃液Gastricjuice對照組0．126±0．0020．090±0．0040．081±0．006肌注組高劑量(含佐劑)0．873±0．0300．430±0．0120．377±0．030高劑量0．781±0．0210．325±0．0330．322±0．049低劑量(含佐劑)0．758±0．0330．315±0．0270．259±0．087低劑量0．704±0．0370．296±0．0450．222±0．045口服組高劑量(含佐劑)0．336±0．0450．110±0．0140．110±0．025高劑量0．264±0．0630．129±0．0130．096±0．009低劑量(含佐劑)0．309±0．1220．098±0．0120．120±0．030低劑量0．224±0．0180．122±0．0170．081±0．006

表5 不同疫苗組分和不同免疫途徑免疫小鼠后特異IgA的變化(A450)
Tab.5 Changes of specific IgA with different vaccine components and different immune treatments in mice (A450)

組別Groups樣本Samples血清Serum腸液Intestinaljuice胃液Gastricjuice對照組0．066±0．0610．098±0．0970．068±0．003肌注組高劑量(含佐劑)0．070±0．0690．193±0．0250．088±0．011低劑量(含佐劑)0．073±0．00190．183±0．0350．069±0．002高劑量0．079±0．00560．111±0．0190．073±0．003低劑量0．078±0．00340．095±0．0050．083±0．017口服組高劑量(含佐劑)0．280±0．140．226±0．0270．088±0．013低劑量(含佐劑)0．154±0．0050．224±0．0170．077±0．009高劑量0．130±0．0180．133±0．0030．072±0．002低劑量0．120±0．0050．110±0．0180．097±0．008

2.2.2保護性檢測 每組末次免疫結(jié)束后第14 d，用2倍LD50的致病性大腸桿菌菌量攻擊各組不同免疫處理的小鼠，觀察3 d，記錄攻擊感染小鼠的存活數(shù)，分別計算死亡率和保護率，具體見表6。

表6 小鼠不同免疫處理對致病性大腸桿菌的攻擊保護率
Tab.6 Protection rates of pathogenic E. coli in different immunization treatments of mice

Groups(n=15)Mortalityrate(%)Protectionrate(%)對照組8020肌注組高劑量(含佐劑)0100低劑量(含佐劑)0100高劑量0100低劑量0100口服組高劑量(含佐劑)0100低劑量(含佐劑)2080高劑量2080低劑量4060

圖2 免疫不同時間血清抗體IgG的變化(肌注組)Fig.2 Changes of serum IgG in different time of immunization (intramuscular injection group)

圖3 免疫不同時間血清抗體IgG的變化(口服組)Fig.3 Changes of serum antibody IgG in different time of immunization (oral group)

圖4 免疫不同時間血清抗體IgA的變化(肌注組)Fig.4 Changes of serum antibody IgA at different time of immunization (intramuscular injection group)

圖5 免疫不同時間血清抗體IgA的變化(口服組)Fig.5 Changes of serum antibody IgA at different time of immunization (oral group)

2.2.3免疫后的副反應監(jiān)測 按0、14、28、42 d的免疫程序肌肉注射免疫小鼠或口服免疫小鼠后觀察，無論含佐劑和不含佐劑的疫苗，其各組小鼠的體重、被毛和精神狀況與對照組比較無可見差異。

3 討 論

免疫佐劑可增強抗原所激發(fā)的免疫應答，可提高疫苗抗原的免疫原性，以及增強吞噬細胞的非特異性殺傷功能和特異性細胞免疫的刺激作用等，提高疫苗的免疫效力[5]。佐劑是疫苗特別是滅活疫苗所必不可少的成分，因此，本試驗選擇了重組霍亂毒素B亞單位免疫佐劑。大量的研究結(jié)果已經(jīng)證明, 重組霍亂毒素B亞單位是一種良好的免疫佐劑和輸送抗原載體, 通過黏膜途徑免疫其效果更佳[6-11]。該免疫佐劑作為新型提高粘膜免疫抗原提呈能力的蛋白質(zhì)分子，無毒害無殘留，課題組在小鼠的實驗結(jié)果證明本次配方中，無論對口服途徑免疫還是肌肉注射途徑免疫，重組霍亂毒素B亞單位作為疫苗佐劑均能顯著提高藏豬大腸桿菌滅活疫苗免疫效力。

本研究用西藏地區(qū)分離鑒定的豬致病性大腸桿菌臨床菌株為關鍵抗原材料，制備含生物佐劑的仔豬大腸桿菌滅活疫苗，經(jīng)過口服和肌注法4次免疫實驗小鼠后，該滅活疫苗能夠有效的提高小鼠腸液特異的Ig G或IgA抗體，達到有效增強腸道和血液免疫反應的目的，此實驗數(shù)據(jù)為致病性大腸桿菌的佐劑研究和免疫接種途徑研究提供了新數(shù)據(jù)。

本研究以小鼠為模型，攻擊保護性實驗研究顯示無論口服還是肌肉注射，本次制備的疫苗免疫小鼠后均可對致病性大腸桿菌產(chǎn)生很好的保護性。特別是高劑量含佐劑疫苗口服4次免疫小鼠對致病性大腸桿菌的保護率達到了100%，初步證明本疫苗口服免疫接種方便，對大腸桿菌攻擊保護有效。本研究初步探索了藏豬養(yǎng)殖過程中致病性大腸桿菌的疫苗開發(fā)新思路，為西藏地區(qū)豬致病性大腸桿菌疫苗的抗原、佐劑、劑量、免疫程序和免疫途徑的研究奠定了基礎。

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