新疆棉花根際細(xì)菌TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR的建立及時(shí)空動(dòng)態(tài)分析

張 濤，李雪艷，楊紅梅，楚 敏，高 雁，曾 軍，霍向東，張 濤，林 青，歐提庫爾，李玉國，婁 愷，史應(yīng)武

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】棉花黃萎病是一種土傳病害，是新疆棉花生產(chǎn)上最主要的病害之一，嚴(yán)重阻礙著新疆棉花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。棉花黃萎病菌在土壤中生長繁殖，產(chǎn)生大量微菌核，改變棉花根際微生態(tài)環(huán)境。因此，分析棉花根際微生物動(dòng)態(tài)對(duì)于研究棉花根際微生物與黃萎病的發(fā)生具有重要意義?！厩叭搜芯縿?dòng)態(tài)】顧美英等[2-3]研究發(fā)現(xiàn)，新疆棉花黃萎病發(fā)病株根際土壤微生物總量均大于健康株根際微生物總量。李洪連等[4-6]研究表明，棉花對(duì)黃萎病的抗性除了與根際微生物數(shù)量有密切關(guān)系外，與根際微生物種類、種數(shù)和優(yōu)勢(shì)種也有關(guān)。張燕[7]研究表明，病株棉花的根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是動(dòng)態(tài)的并隨著棉花的生長而發(fā)生規(guī)律性的變化。前人研究已經(jīng)證實(shí)，棉花黃萎病的發(fā)生與根際微生物有密切關(guān)系?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】棉花根際微生物通過改變棉花根際微生態(tài)影響棉花黃萎病的發(fā)生，而細(xì)菌在根際微生物群落中數(shù)量和種類最多[8]。因此，定量檢測(cè)棉花根際細(xì)菌是研究棉花根際微生物與宿主黃萎病發(fā)生相關(guān)性的基礎(chǔ)。目前，棉花根際微生物定量檢測(cè)方法主要有選擇性培養(yǎng)基法、活體檢測(cè)法、免疫檢測(cè)法和分子生物學(xué)法。近年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以其快速、靈敏、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為棉花根際微生物檢測(cè)的重要工具[9-13]。然而應(yīng)用Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量棉花根際微生物數(shù)量的報(bào)道比較少見。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究應(yīng)用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)新疆棉花病株不同生育期根際細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)以及時(shí)空動(dòng)態(tài)分析，為研究棉花根際細(xì)菌對(duì)黃萎病的調(diào)控效應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試土樣

選擇新疆北疆地區(qū)的石河子、烏蘇和精河，南疆地區(qū)的庫爾勒、圖木舒克和阿拉爾，東疆地區(qū)的哈密等7個(gè)植棉區(qū)為采樣點(diǎn)。分別于棉花的苗期、蕾期、花鈴期和吐絮期等4個(gè)時(shí)期采集病株根際10～15 cm的土壤。土樣在室內(nèi)經(jīng)自然晾干后，用直徑2 mm的篩網(wǎng)過篩，混勻，裝入密封袋中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑和儀器

Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、Eppendorf Centeifuge 5417R型離心機(jī)、DW-40L188型醫(yī)用低溫保存箱、T Personal型PCR儀、DYCP-31E型電泳儀、WD-9413B型凝膠成像分析儀、Epoch型超微量微孔板分光光度計(jì)、Roche LightCycler?480Ⅱ型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2 方 法

1.2.1 土壤根際微生物基因組總DNA的提取

利用Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒的操作方法提取棉花根際土壤基因組總DNA。提取出的DNA樣品保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 樣品PCR擴(kuò)增

以土壤基因組總DNA為模板，選擇根際細(xì)菌16S rDNA基因特異引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和 1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'對(duì)不同取樣時(shí)期的根際土壤基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)液組成為：PremixTaq12.5 μL，DNA模板1 μL，27F(10 μM) 0.5 μL，1492R(10 μM) 0.5 μL，ddH2O 10.5 μL：PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 重組質(zhì)粒的制備與鑒定

將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合后經(jīng)SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化后，克隆至pGEM-T easy載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在氨芐青霉素平板上通過藍(lán)白斑試驗(yàn)篩選陽性轉(zhuǎn)化菌。取部分陽性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行Blast同源性比對(duì)分析。序列正確的陽性克隆子利用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，用超微量分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒OD值并計(jì)算質(zhì)粒的濃度。

1.2.4 RT- qPCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

將制備好的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋，得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)模板，作為標(biāo)準(zhǔn)品。應(yīng)用土壤根際細(xì)菌通用性引物331F：TCCTACGGGAGGCAGCAGT和797R：GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT擴(kuò)增菌株16S rDNA，探針Probe：5'- CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC -3'。探針和引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成。反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化采用史應(yīng)武[14]的方法：通過Roche LightCycler?480Ⅱ型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增探針濃度的優(yōu)化，其探針濃度優(yōu)化后的體系為：模板(標(biāo)準(zhǔn)DNA/陰性對(duì)照) 5 μL/0 μL，上下游引物各0.8 μL，F(xiàn)S Essential DNA Probes Master 10.0 μL，Probe 0.4 μL，加ddH2O水補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃欲變性10 min：95℃ 25 s，50℃ 120 s，72℃ 90 s，共45個(gè)循環(huán)。退火延伸時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)。根據(jù)反應(yīng)的Ct值、最高熒光值對(duì)引物反應(yīng)濃度、最佳退火溫度及擴(kuò)增效率進(jìn)行優(yōu)化，以擴(kuò)增Ct值在15～35，擴(kuò)增效率接近100%為最佳反應(yīng)。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)已經(jīng)建立及優(yōu)化的反應(yīng)體系，對(duì)獲得的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋樣品進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置不加模板的陰性對(duì)照，每個(gè)反應(yīng)體系重復(fù)3次，由Roche LightCycler?480Ⅱ型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 樣品的RT- qPCR檢測(cè)

采用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系對(duì)新疆棉花各生育期、各采樣地點(diǎn)根際土壤DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)完畢后，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算根際細(xì)菌的含量(copies/g FRW)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2017軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

經(jīng)計(jì)算，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為2.31×107copies/g (FRW)，將標(biāo)準(zhǔn)品作10倍梯度稀釋，獲得2.31×102～2.31×107copies/g (FRW) 6個(gè)稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品。將6個(gè)不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后由Roche LightCycler?480Ⅱ系統(tǒng)軟件自動(dòng)生成反應(yīng)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖1，圖2

擴(kuò)增反應(yīng)的誤差為0.008 49，擴(kuò)增效率為1.852，相關(guān)性系數(shù)為0.996，說明該反應(yīng)體系和條件比較理想。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.736，截距為43.50，由此得出根際細(xì)菌的DNA起始濃度對(duì)數(shù)值與Ct值之間的線性方程為y=-3.736x+43.50。

圖1 10倍梯度稀釋陽性質(zhì)粒的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線
Fig.1 RT-q PCR amplifacation curve of serial 10-fold dilutions of positive recombinant plasmids

Note: Error: 0.00849; Efficiency: 1.852; Slope: -3.736; YIntercept: 43.50; Link: 2,027

圖2 棉花根際細(xì)菌TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig.2 RT-q PCR standard curve of serial 10-fold dilutions of positive recombinant plasmids

2.2 新疆棉花不同生育時(shí)期根際細(xì)菌數(shù)量

庫爾勒、阿拉爾和哈密根際細(xì)菌數(shù)量變化趨勢(shì)在苗期至花期之間相似，根際細(xì)菌數(shù)量都是先增加后減少，花期至絮期之間根際細(xì)菌數(shù)量變化趨勢(shì)不同，從花期開始，庫爾勒根際細(xì)菌數(shù)量則是平緩增加，阿拉爾根際細(xì)菌數(shù)量則是不斷減少，絮期為1.6×105copies/g (FRW)，哈密根際細(xì)菌數(shù)量則是急劇增加，絮期達(dá)到最大值1.7×107copies/g (FRW)；石河子、烏蘇和圖木舒克根際細(xì)菌數(shù)量變化趨勢(shì)基本相同，從苗期開始緩慢減少，花期之后快速增加；精河根際細(xì)菌數(shù)量最低，苗期為8.5×104copies/g (FRW)，從苗期開始緩慢增加，蕾期至花期之間變化不大，花期之后快速增加，絮期達(dá)到6.7×106copies/g (FRW)。圖3

2.3 新疆棉花不同采樣地點(diǎn)根際細(xì)菌數(shù)量

哈密根際細(xì)菌數(shù)量最高，吐絮期達(dá)到1.7×107copies/g (FRW)，其次為庫爾勒，蕾期為8.8×106copies/g (FRW)，再次為阿拉爾，蕾期為6.8×106copies/g (FRW)；根際細(xì)菌數(shù)量最低的是精河，苗期僅為8.5×104copies/g (FRW)?？傮w來看，新疆棉花根際細(xì)菌數(shù)量的空間變化是東疆大于南疆大于北疆。圖4

注：SHZ、WS、JH、KEL、TMS、ALE、HM分別表示石河子、烏蘇、庫爾勒、圖木舒克、阿拉爾和哈密棉花病株根際細(xì)菌

Note: SHZ, WS, JH, KEL, ALE, TMS, HM show rhizosphere bacteria in cotton affected Verticillium Wilt in Shihezi, Wusu , Jinghe, Korla, Alar, Tumushuker and Hami respectively

圖3 不同生育時(shí)期棉花黃萎病病株根際細(xì)菌數(shù)量變化
Fig.3 Variation of number of rhizosphere bacteria in cotton infected by verticillium wilt at different growth stages

注：SHZ、WS、JH、KEL、ALE、TMS、HM分別表示采樣地點(diǎn)石河子、烏蘇、精河、庫爾勒、阿拉爾、圖木舒克和哈密

Note: SHZ, WS, JH, KEL, ALE, TMS, HM show sampling locations in Shihezi, Wusu , Jinghe, Korla, Alar, Tumushuker and Hami respectively

圖4 不同采樣地點(diǎn)棉花黃萎病病株根際細(xì)菌數(shù)量變化
Fig.4 Variation of number of rhizosphere bacteria in cotton infected by verticillium wilt at different sampling sites

3 討 論

棉花根際微生物是棉花微生態(tài)系統(tǒng)中重要組成部分，而根際微生物區(qū)系主要以細(xì)菌為主，細(xì)菌以生長快、抗逆性強(qiáng)和次生代謝產(chǎn)物多而著稱，是生物防治棉花黃萎病的主要菌群[15]。因此，尋找一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的根際細(xì)菌檢測(cè)方法是研究根際微生物與棉花黃萎病發(fā)生關(guān)系的前提。

實(shí)驗(yàn)室中傳統(tǒng)檢測(cè)根際細(xì)菌含量的方法是平板菌落計(jì)數(shù)法，該方法存在的問題是，可分離培養(yǎng)的根際細(xì)菌只占環(huán)境微生物的0.1%～10%[16]，這很難反映出根際細(xì)菌的真實(shí)數(shù)量；此外，平板菌落計(jì)數(shù)法操作比較繁瑣，勞動(dòng)強(qiáng)度比較大，培養(yǎng)時(shí)間較長，不能滿足大量樣品快速檢測(cè)需求。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以對(duì)土壤根際細(xì)菌個(gè)體進(jìn)行絕對(duì)定量，極大地提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性；同時(shí)，該技術(shù)操作簡便，可以大量擴(kuò)增，能夠在很短的時(shí)間內(nèi)對(duì)棉花根際細(xì)菌進(jìn)行大量檢測(cè)。與傳統(tǒng)方法相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。通過TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)建立了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的根際細(xì)菌檢測(cè)方法。研究結(jié)果表明：棉花黃萎病株根際細(xì)菌數(shù)量隨著棉花生育時(shí)期的不同而不同，根際細(xì)菌數(shù)量最高的是哈密，吐絮期達(dá)到1.7×107copies/g (FRW)，根際細(xì)菌數(shù)量最低的是精河，苗期僅為8.5×104copies/g (FRW)。

董蓮華等[17]對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)根際細(xì)菌數(shù)量的研究表明，根際細(xì)菌從蕾期開始下降，花期降到最低，鈴期和絮期有所回升。研究與董蓮華的結(jié)果相似。李家恕等[18]分析了棉花根際細(xì)菌總數(shù)，結(jié)果表明，棉花出苗以后細(xì)菌總數(shù)逐漸上升，至開花期達(dá)到最高，以后又慢慢減少。孫建波等[19]對(duì)香蕉不同生育時(shí)期根際土壤細(xì)菌群落變化的研究表明，香蕉根際微生物數(shù)量隨著香蕉生育階段的不同而不同。沈法富等[20]對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉和非轉(zhuǎn)基因棉根際微生物區(qū)系的研究表明，苗期根際細(xì)菌的數(shù)量少，蕾期開始上升，到花鈴期根際細(xì)菌的數(shù)量達(dá)到高峰，吐絮期下降。這可能是由于棉花品種、采樣地點(diǎn)以及細(xì)菌數(shù)量計(jì)數(shù)方法上的差異而造成了結(jié)果上的差異。

4 結(jié) 論

該文通過TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)建立了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的根際細(xì)菌檢測(cè)方法，為快速檢測(cè)根際微生物數(shù)量提供了一種方法。運(yùn)用此方法發(fā)現(xiàn)，新疆棉花根際細(xì)菌數(shù)量在時(shí)間和空間上變化不盡相同，從整個(gè)生育時(shí)期來看，棉花根際細(xì)菌數(shù)量呈現(xiàn)出不規(guī)律的變化趨勢(shì)；從不同采樣地點(diǎn)來看，棉花根際細(xì)菌數(shù)量變化趨勢(shì)是東疆、南疆、北疆依次減少，其中，棉花根際細(xì)菌數(shù)量最多的是東疆地區(qū)的哈密，吐絮期達(dá)到1.7×107copies/g(FRW)，最少的是北疆地區(qū)的精河，苗期僅為8.5×104copies/g(FRW)。該文僅對(duì)棉花根際細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行了定量檢測(cè)，而對(duì)于根際其他微生物的數(shù)量并沒有進(jìn)行研究，這是下一步研究工作的方向。

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