星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化馬錢子堿-士的寧(B-S)雙載藥固體脂質(zhì)納米粒的制備工藝研究

史磊，曹思思，呂邵娃，孫爽 ，趙程程 ，李永吉*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱職業(yè)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

馬錢子始載于《本草綱目》，又稱番木鱉，為馬錢科植物馬錢子(Strychnosnux-vomicaL.) 及長(zhǎng)籽馬錢(Strychnos wallichiana steud.Ex DC.) 的干燥成熟種子，馬錢子味苦、性寒，有大毒。具有通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫的功效[1]。馬錢子種子含總生物堿約2%～5%[2]，其中，士的寧(番木鱉堿，strychnine，C21H22O2N2)約占總生物堿的40%～50%,但毒性較大,其次為馬錢子堿(brucine，C22H26O4N2),其毒性是士的寧的1/40?？诜R錢子生藥7 g可致死，中毒潛伏期30～180 min[3～5]。馬錢子主要成分馬錢子堿和士的寧既是有效成分也是毒性成分，占馬錢子總生物堿的80%左右，其中，士的寧毒性最強(qiáng),而且治療量與中毒量非常接近。固體脂質(zhì)納米粒(solidlipidnanoparticles,SLN)是20世紀(jì)90年代起發(fā)展起來的一種在體內(nèi)可生物降解、固體的、以天然或合成類脂材料為藥物載體，將藥物吸附或包裹于脂質(zhì)核制成的粒徑約為50～1 000 nm的亞微粒給藥系統(tǒng)[6]。具有良好的生理相容性，能提高難溶性藥物的溶解度；具有長(zhǎng)效緩控釋、靶向的作用，適合多種途徑給藥[7]。目前市場(chǎng)上馬錢子制劑存在毒性大、安全劑量達(dá)不到治療效果等缺陷，為了提高制劑的生物利用度、降低藥物毒性，本文采用馬錢子堿-士的寧雙載藥系統(tǒng)進(jìn)行固體脂質(zhì)納米粒包合，通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法研究其制備工藝，并進(jìn)行處方優(yōu)化。

1 材料

1.1 儀器 752型紫外分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限責(zé)任公司)；BS124S電子天平(德國賽多利斯公司)；KQ-500E型超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；JEM-1200EX透射電鏡(日本電子株式會(huì)社)；Zetasizer Nano-ZS90激光粒度分析儀(馬爾文儀器有限公司)；SENCO-R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申科技有限公司)；SHB-3循環(huán)水多用真空泵(鄭州杜甫儀器廠)；DF-101Z集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；Waters2695高效液相色譜儀，包括Waters2996 DAD 檢測(cè)器、Empower色譜工作站(美國Waters公司);DiamonsilC-18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(北京迪馬科技有限公司)。

1.2 藥品及試劑 馬錢子堿對(duì)照品(≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)652154-10-4)；士的寧對(duì)照品(≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)1421-86-9)；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體制備工藝

采用乳化蒸發(fā)法制備，稱取單硬脂酸甘油酯(50 mg)-卵磷脂(100 mg)分散于10 mL無水乙醇中，超聲使其溶解形成有機(jī)相。配制20 mL濃度為0.2%的F-68水溶液形成水相。分別稱取約2 mg馬錢子堿(Brucine，以下簡(jiǎn)稱B)和士的寧(Strychnine，以下簡(jiǎn)稱S)，溶解于有機(jī)相，將有機(jī)相用1 ml注射器在1 000 r/min的磁力攪拌的條件下注入水相中，磁力攪拌1 h，冰浴中固化1 h，即得脂質(zhì)體溶液。

2.2 含量測(cè)定及方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件 波長(zhǎng)265 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL；等度洗脫，流動(dòng)相：乙腈(21%)-[0.01 mol/L庚烷磺酸鈉溶液與0.02 mol/LKH2PO4的等量混合液(10%磷酸調(diào)pH值2.8)](79%)。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取B對(duì)照品4.4 mg和S對(duì)照品2.7 mg至25 ml容量瓶中，加入甲醇使其溶解，定容，得對(duì)照品貯備液。

2.2.3 供試品溶液制備 按“2.1”項(xiàng)下制備脂質(zhì)體樣品，精密量取 B-S雙載脂質(zhì)體混懸液0.5 mL，置5 mL量瓶中，甲醇稀釋近刻度，超聲處理10 min使其完全破乳，定容，0.22 μm有機(jī)微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 專屬性考察 按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，將空白納米粒溶液、B與S的混合對(duì)照品溶液、B-S脂質(zhì)體供試品溶液注入HPLC進(jìn)行檢測(cè)(色譜圖見圖1)。在此色譜條件下，載體等材料不干擾樣品的測(cè)定，靈敏度高專屬性強(qiáng)、方法可靠。

Fig.1 Chromatogram of specificity(from the top down:blank SLN，BS reference substance and BS-SLN)

2.2.5 線性關(guān)系的考察 分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml至10 ml容量瓶中，甲醇定容，得系列混合對(duì)照品溶液。按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。馬錢子堿線性方程為：Y=23 130X-643.7(R=0.999 8)；士的寧線性方程為Y=35 521X-4 130(R=0.999 9)。結(jié)果表明,B在17.60～88.00 μg/mL、S在10.8～54.00 μg /mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 方法學(xué)考察 經(jīng)回收率實(shí)驗(yàn)、精密度實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，方法可靠。

2.3 包封率測(cè)定方法的建立

采用葡聚糖凝膠色譜法測(cè)定包封率，取載藥脂質(zhì)體納米粒溶液2 mL，加入到Sephadex G-50凝膠柱頂部，用蒸餾水以1 mL/min洗脫，分離納米粒和游離藥物，接取游離藥物定容至50mL容量瓶中，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣(10 μL)，計(jì)算包封率以及載藥量。包封率以及載藥量計(jì)算公式為:包封率 (Entrapment efficiency,EE)=(WQ-QL)/WQ×100%；載藥量(Durg loadingy,DL)=(WQ-WL)/(WP+WR-WL)；其中，WP為硬脂酸甘油酯-大豆卵磷脂用量，WQ為藥物的投入量，WL為測(cè)得的游離藥物量，WR為乳化劑用量。

2.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.4.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)及單因素考察，雙載藥系統(tǒng)的單硬脂酸甘油酯與卵磷脂比例、硬脂酸甘油酯用量、馬錢子堿與士的寧比例、表面活性劑濃度四個(gè)因素對(duì)BS-SLN有顯著的影響，可對(duì)其進(jìn)一步優(yōu)化，故采用四因素的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。此設(shè)計(jì)中，單硬脂酸甘油酯與卵磷脂比例(X1)、單硬脂酸甘油酯用量(X2)、馬錢子堿與士的寧比例(X3)、F-68濃度(X4)分別為獨(dú)立因素X1，X2，X3,X4，共設(shè)五水平表，包括析因設(shè)計(jì)點(diǎn)、極值點(diǎn)(即+1，-1，0，+а 和-а)。真實(shí)值和代碼值見Tab.1。以總包封率(Y1，%)，總載藥量(Y2，%)為響應(yīng)參數(shù)，按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)方案安排試驗(yàn)。

Tab.1 The real value and code

2.4.2 模型擬合及方差分析

2.4.2.1 對(duì)總包封率的分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析表見Tab.2，各因素與指標(biāo)之間的等高線及響應(yīng)面3D效果圖見Fig.2。經(jīng)SAS軟件分析，模型顯著性檢驗(yàn)F=20.39，P<0.01， 說明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，決定系數(shù)R2=0.941 1，調(diào)整后的Adj.R2=0.886 1，均較高，說明回歸方程擬合度好。其中X2、X3、X1X2、X2X3、X2X4、X3X4、X12、X22、X32、X42對(duì)方程影響顯著?；貧w方程為：Y1=-0.890 65-0.348 95X1+0.013 842X2+0.243 32X3+3.414 68X4+0.026 130X1X2-0.054 182 X1X3-0.633 41X1X4+3.238 27×10-3X2X3+0.033 514X2X4-0.329 43X3X4-0.675 27X12-3.399 13×10-4X22-0.059 061X32-6.855 97 X42，R2=0.946 1，調(diào)整R2= 0.971 7，P<0.000 1,小于0.05，模型顯著。對(duì)于包封率來說，單硬脂酸甘油酯用量(X2)、馬錢子堿與士的寧比例(X3)是主要的影響因素。

Tab.2 ANOVA for response surface quadratic model of Y1

Fig.2 Contour plot and response surface of Y1 follows independent variables interaction for X1X2(A)、X1X3(B)、X1X4(C)、X2X3(D)、X2X4(E) and X3X4(F)

2.4.2.2 對(duì)總載藥量的分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析表見Tab.3。經(jīng)SAS軟件分析，模型顯著性檢驗(yàn)F=27.46，P<0.01， 說明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，決定系數(shù)R2=0.951 2，調(diào)整后的Adj.R2=0.905 7，均較高，說明回歸方程擬合度好。其中X1、X2、X3、X1X2、X2X3、X2X4、X22、X32、X42對(duì)方程影響顯著。

回歸方程為：

Y2=4.06×10-3-0.029X1+2.47×10-4X2-2.40×10-3X3+0.058X4+7.31×10-4X1X2+2.80×10-3X1X3-7.39×10-3X1X4+1.03×10-4X2X3+7.50×10-4X2X4-7.80×10-4X3X4-4.77×10-3X12-9.32×10-6X22-6.92×10-4X32-0.15 X42

各因素與指標(biāo)之間的等高線及響應(yīng)面3D效果圖為Fig.3，可見4個(gè)因素對(duì)指標(biāo)的影響。由Tab.3方差分析結(jié)果知，P<0.05表明模型是顯著的。對(duì)于載藥量來說，單硬脂酸甘油酯與卵磷脂比例(X1)、單硬脂酸甘油酯用量(X2)、馬錢子堿與士的寧比例(X3)是主要的影響因素。

Tab.3 ANOVA for response surface quadratic model of Y2

Fig.3 Contour plot and response surface of Y2 follows independent variables interaction for X1X2(A)、X1X3(B)、X1X4(C)、X2X3(D)、X2X4(E) and X3X4(F)

2.4.3 優(yōu)化處方驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)確定最佳處方條件為:當(dāng)單硬脂酸甘油酯：大豆卵磷脂選擇0.66(即單硬脂酸甘油酯：大豆卵磷脂=2:3)，單硬脂酸甘油酯用量選擇60 mg，B：S選擇2.62， F-68用量選擇0.31時(shí)，Y1(包封率)預(yù)測(cè)最大值為0.499 9，Y2(載藥量)預(yù)測(cè)最大值為0.010 5。

依據(jù)最優(yōu)工藝與處方條件制備三批樣品，比較實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相對(duì)偏差，評(píng)價(jià)模型方程的可靠性。各批次樣品的總包封率及總載藥量的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值見Tab.4，PS、ZP、PDI、EE及DL的指標(biāo)結(jié)果見Tab.5。

Tab.4 The compare of the predicted and obserbed responses(n=3)

注：相對(duì)偏差=(預(yù)測(cè)值-實(shí)測(cè)值)/預(yù)測(cè)值×100%

由Tab.5中數(shù)據(jù)可知，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間的偏差率較小，各項(xiàng)指標(biāo)偏差均小于±5%，說明優(yōu)化后的處方驗(yàn)證試驗(yàn)的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值基本相吻合，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法的預(yù)測(cè)效果良好，可以描述效應(yīng)面和影響因素之間的關(guān)系。

由Tab.5及Fig.4所示，優(yōu)化后工藝制備的三批樣品外觀為淡藍(lán)色乳光的液體，批間的各項(xiàng)指標(biāo)變化差異小，重現(xiàn)性良好。

Tab.5 The verification results(n=3)

Fig.4 The picture of PS， ZP andappearance(from left to right: PS， ZP and appearance)

3 討論

3.1 制備方法

本實(shí)驗(yàn)在載藥納米粒制備方法考察時(shí)，考察了沉淀法、乳化蒸發(fā)法、復(fù)乳法，傳統(tǒng)的沉淀法制備的納米粒包封率和載藥量不高且粒徑超過200 nm，可能是由于在乳化的過程中，水溶性藥物易從油相中脫離，并從粒子內(nèi)部不斷擴(kuò)散進(jìn)水相，這不僅降低藥物的包封率，而且很有可能因?yàn)閿U(kuò)散后形成的孔道，造成藥物釋放過程中的“突釋”現(xiàn)象。為了提高水溶性藥物的包封率及載藥量，本實(shí)驗(yàn)嘗試使用復(fù)乳法，包封率及粒徑均不及乳化蒸發(fā)法，每批產(chǎn)品波動(dòng)較大，與文獻(xiàn)報(bào)道的此法影響因素較多、對(duì)實(shí)驗(yàn)條件及操作人員操作要求高相符。乳化蒸發(fā)法制備的納米粒溶液，外觀呈淡藍(lán)色乳光，粒徑小于120 nm，分布較窄，Zeta電位絕對(duì)值較大，包封率和載藥量較高，TEM觀察納米粒大小均勻圓球形，該方法操作簡(jiǎn)單，故確定用乳化蒸發(fā)法制備納米粒。

3.2 穩(wěn)定劑的選擇

脂質(zhì)體納米粒具有顆粒細(xì)小的特點(diǎn)，比表面積巨大而極易聚集或成團(tuán)從而導(dǎo)致體系穩(wěn)定性降低。因此，制備時(shí)需要加入穩(wěn)定劑來抑制納米粒的聚集，并增加體系的粘度，以減緩其沉降速率，同時(shí)穩(wěn)定劑需具備低毒、安全等特點(diǎn)。故本研究選擇F-68為穩(wěn)定劑。

3.3 包合材料的選擇

在包載藥物的過程中，B和S兩個(gè)成分之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。在有限的載體材料中，包載藥物的能力也是有限的，故改變藥物用量及二者比例時(shí)，對(duì)兩個(gè)成分的包封率及載藥量均有影響。在星點(diǎn)考察或單因素考察的實(shí)驗(yàn)過程中，會(huì)有士的寧的包封率高于馬錢子堿的情況，但總包封率比較高(總包封率30%以上)的樣品中，馬錢子堿均為投藥量高于士的寧；且在總包封率相對(duì)較高的樣品當(dāng)中，馬錢子堿的包封率總是大于士的寧的包封率。因此,通過前面的實(shí)驗(yàn)可以總結(jié)出，在投藥時(shí)采用馬錢子堿高于士的寧投藥量的方式。主要原因可能是由于馬錢子堿結(jié)構(gòu)與士的寧比較，差別只在結(jié)構(gòu)式上引入了兩個(gè)甲氧基，因此馬錢子堿的極性要小于士的寧，在所選用的載體材料單硬脂酸甘油酯為脂溶性成分時(shí)，馬錢子堿與其親和性較大，因此才體現(xiàn)出馬錢子堿比例高有利于提高總包封率的情況。

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